专利名称：微生物发酵生产低温超氧化物歧化酶的方法
技术领域：
本发明涉及微生物学、酶工程、发酵工程、生物化学等领域，具体涉及一种微生物发酵生产SOD的方法。该方法生产的低温SOD作为生物体内超氧阴离子自由基的清洁剂，主要应用于医学、食品、化妆品等行业，尤其在防辐射、抗衰老、消炎、抑制肿瘤、癌症和自身免疫治疗等方面显示出独特的优越性。
背景技术：
超氧化物歧化酶(superoxidedismutase, ECl. 15. I. I,简称 S0D)是一类广泛存在于生物体内的金属酶，能够催化超氧阴离子自由基和氢离子反应形成过氧化氢和分子氧，从而清除生物体内的氧自由基，起到保护生物体免受伤害作用(自俊青，大理师专学报，1998)。1969年Mccord和Fridovich发现该酶生物催化活性并命名为超氧化物歧化酶(林庆斌，化学世界，2006)。按其结合的金属种类不同，可将其分为三类一类是蓝绿色的Cu，Zn-SOD，相对分子量约32000，主要存在于真核细胞的胞液和叶绿体中，是目前研究最多、最深入的一类；第二类是紫红色的Mn，Fe-SOD，相对分子量约40000，主要存在于原核生物细胞及线粒体的基质中；第三类是黄褐色的Fe-SOD，相对分子量约为38700，主要存在于原核细胞及一些植物中(陈惠芳，生命的化学，2003)。SOD作为生物酶制剂，医疗上主要用于辅助放疗与化疗，肾、肝、心脏等器官的保护和移植，消除辐射引起的副作用，以及作为某些疾病的探针等；食品工业作为添加剂应用于饮料和啤酒等。近年来SOD被广泛用于治疗氧中毒、老年性白内障、糖尿病、心血管疾病、各种炎症等多种疾病(张博润等，微生物学通报，1992)。几十年来SOD—直是国内外研究热点，起初阶段多集中于从动物血液或组织中提取S0D，到中期阶段微生物发酵生产SOD的研究开始起步并日渐增多，到目前为止微生物生产SOD已然成为研究的主体。但多为中、高温SOD，最适作用温度一般在45°C以上，而人体的生理温度一般为36. 5 37°C，致使微生物发酵生产的中、高温SOD不能充分发挥作用，出现治疗效果差或没有效果(曾胤新，微生物学杂志，2004)。低温SOD最适作用温度一般为35 40°C，比较接近人体的生理温度，应用于治疗效果比较明显。但低温SOD产业化、规模化生产及应用还未见报道(吴江等，中国医药工业杂志，1997)。鉴于动物血液来源困难及微生物发酵生产的中、高温SOD最适作用温度的局限性，利用微生物发酵生产的低温SOD具有很大的应用优势。低温SOD在自然环境温度下具有高酶活力及高催化效率，且对热敏感，经过温和的热处理即可使低温酶的活力丧失，如果将SOD应用于食品工业从而大大缩短处理过程的时间并省却昂贵的加热或冷却费用，且不影响产品品质(郑洲等，极地研究，2007)，这将有助于低温SOD的推广和使用。可从根本上摆脱繁琐的提取工艺及中、高温酶的加热、冷却设备和流程，在提高得率及酶活性的同 时降低能耗及生产成本。鉴于低温SOD在自然和生理条件下的优势，低温SOD在医疗保健、食品、化妆品等方面拥有更加广泛的应用前景和开发潜力
发明内容
本发明是提供一种微生物发酵生产低温SOD的方法，该方法主要是微生物经过低温驯化后，在10 16°C液体发酵生产低温SOD的方法，这种生产方法获得的低温SOD酶活性可以达到203. 68U/ml，如再经过分离和纯化，可以得到不同浓度和纯度的酶制剂。该酶制剂应用操作简单、方便、快捷、成本低。可以从根本上避免中温、高温酶的加热、冷却设备和工艺。本发明所述的一种微生物发酵生产低温SOD的方法具体包括以下步骤(I)将产生SOD的微生物逐级低温驯化，驯化温度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低温环境中生长良好；(2)按常规方法将低温驯化后的SOD产生菌10 16°C逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；
(3)将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的3 9%接种量接入液体发酵培养基中，在10 16°C培养68 96h时，即微生物发酵生产低温SOD结束；(4)将(3)的发酵液4，000 8，OOOrpm离心收集菌体，用蒸馏水洗涤数次之后离心收集沉淀；(5)将沉淀悬浮于缓冲液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm离心，收集的上清为SOD粗酶液；(6)根据不同需要和使用对象不同，将(5)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。本发明中使用的菌种来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，初期活化和生长条件按菌种保藏单位提供的说明进行。SOD产生菌(CGMCC编号
I.119或I. 551)先活化、低温驯化后，按本发明产酶条件发酵生产低温S0D，低温驯化后的菌株在4°C可保存2个月，用10 25%甘油制成的菌悬液、在_80°C条件下可长期保藏。
具体实施例方式实施例一(I)培养基制备①菌种活化培养基葡萄糖lO.Og，牛肉膏14.(^，蛋白胨7.(^，酵母粉4.(^，琼脂20. Og, pH 7. 0,蒸懼水I. 0L, pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。②菌种低温驯化培养基葡萄糖8. 0 16. 0g，牛肉膏10. 0 25. Og,蛋白胨3. 0 12. 0g，酵母粉2.0 9. 0g，琼脂10.0 30. 0g，蒸馏水I. 0L，pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌 30min。③液体种子培养基葡萄糖5. 0 15. Og,牛肉膏8. 0 20. Og,蛋白胨5. 0 15. 0g，酵母粉2.0 10. Og,自来水1.01，？11值自然，1211高压蒸汽灭菌30min。④发酵产酶培养基葡萄糖10. 0 30. 0g, (NH4) 2S043. 0 10. 0g，玉米浆5. 0 15. 0g，酵母粉 2.0 8. 0g, CaCO3LO 6. 0g, MgSO4O. I 0. 9g，自来水 I. 0L, pH 值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。(2)将产生SOD的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；(3)将⑵活化好的菌种逐级低温驯化，驯化温度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低温环境中生长良好；(4)按常规方法将低温驯化后的SOD产生菌在10 16°C培养24 36h而后按5 8%的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(5)将(4)制备的二级种子按发酵液体积3 5%的接种量接入IOL的产酶培养基中，在10 12°C培养120 144h时，即微生物发酵生产低温SOD结束；(6)将(5)的发酵液4，000 8，OOOrpm离心收集菌体，用蒸馏水洗涤数次之后离心收集沉淀；(7)将沉淀悬浮于缓冲液中 加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm离心，收集到的上清为SOD粗酶液；(8)根据不同需要和使用对象不同，将(7)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的低温SOD制剂。实施例二 (I)培养基制备①菌种活化培养基葡萄糖10. 0g，牛肉膏14.(^，蛋白胨7.(^，酵母粉4.(^，琼脂20. Og, pH 7. 0,蒸懼水I. 0L, pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。②菌种低温驯化培养基葡萄糖8. 0 16. 0g，牛肉膏10. 0 25. Og,蛋白胨3. 0
12.0g，酵母粉2.0 9. 0g，琼脂10.0 30. 0g，蒸馏水I. 0L，pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌 30min。③液体种子培养基葡萄糖5. 0 15. 0g，牛肉膏8. 0 20. Og,蛋白胨5. 0 15. 0g，酵母粉2.0 10. Og,自来水1.01，？11值自然，1211高压蒸汽灭菌30min。④发酵产酶培养基葡萄糖10. 0 30. 0g, (NH4) 2S043. 0 10. 0g，玉米浆5. 0 15. 0g，酵母粉 2.0 8. 0g, CaCO3LO 6. 0g, MgSO4O. I 0. 9g，自来水 I. 0L, pH 值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。(2)将产生SOD的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；(3)将⑵活化好的菌种逐级低温驯化，驯化温度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低温环境中生长良好；(4)按常规方法将低温驯化后的SOD产生菌在10 16°C培养24 36h，而后按5 8%的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(5)将(4)制备的二级种子按发酵液体积5 7%的接种量接入50L的产酶培养基中，在12 14°C培养96 120h时，即微生物发酵生产低温SOD结束；(6)将(5)的发酵液4，000 8，OOOrpm离心收集菌体，用蒸馏水洗涤数次之后离心收集沉淀；(7)将沉淀悬浮于缓冲液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm离心，收集到的上清为SOD粗酶液；(8)根据不同需要和使用对象不同，将(7)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的低温SOD制剂。实施例三(I)培养基制备
①菌种活化培养基葡萄糖lO.Og，牛肉膏14.(^，蛋白胨7.(^，酵母粉4.(^，琼脂
20.Og, pH 7. 0,蒸懼水I. 0L, pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。②菌种低温驯化培养基葡萄糖8. 0 16. 0g，牛肉膏10. 0 25. Og,蛋白胨3. 0 12. 0g，酵母粉2.0 9. 0g，琼脂10.0 30. 0g，蒸馏水I. 0L，pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌 30min。③液体种子培养基葡萄糖5. 0 15. 0g，牛肉膏8. 0 20. Og,蛋白胨5. 0
15.0g，酵母粉2.0 10. Og,自来水1.01，？11值自然，1211高压蒸汽灭菌30min。④发酵产酶培养基葡萄糖10. 0 30. 0g, (NH4) 2S043. 0 10. Og,玉米浆5. 0 15. 0g，酵母粉 2.0 8. 0g, CaCO3LO 6. 0g, MgSO4O. I 0. 9g，自来水 I. 0L, pH 值自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。(2)将产生SOD的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；(3)将⑵活化好的菌种逐级低温驯化，驯化温度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低温环境中生长良好；(4)按常规方法将低温驯化后的SOD产生菌在10 16°C培养24 36h而后按5 8%的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；(5)将(4)制备的二级种子按发酵液体积7 9%的接种量接入100L的产酶培养基中，在14 16°C培养72 96h时，即微生物发酵生产低温SOD结束；(6)将(5)的发酵液4，000 8，OOOrpm离心收集菌体，用蒸馏水洗涤数次之后离心收集沉淀；(7)将沉淀悬浮于缓冲液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm离心，收集到的上清为SOD粗酶液； (8)根据不同需要和使用对象不同，将(7)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的低温SOD制剂。
权利要求
1.一种微生物发酵生产低温超氧化物歧化酶的方法，包括以下步骤 (1)将产生超氧化物歧化酶的微生物逐级低温驯化，驯化温度由高到低，25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，使其在低温环境下生长良好； (2)按常规方法将低温驯化后的超氧化物歧化酶产生菌在10 16°C逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子； (3)将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的3 9%接种量接入液体发酵培养基中，在10 16°C培养72 144h时，即微生物发酵生产低温超氧化物歧化酶结束； (4)将(3)的发酵液4，000 8，OOOrpm离心收集菌体，用蒸馏水洗涤数次之后离心收集沉淀； (5)将沉淀悬浮于缓冲液中，加石英砂研磨破碎，10,000 14，OOOrpm离心,收集到的上清为超氧化物歧化酶粗酶液； (6)根据不同需要和使用对象不同，还可以将(5)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
2.根据权利要求I所述的方法，在步骤(6)之后进一步包括将步骤(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其中菌种低温驯化培养基、液体种子培养基、产酶培养基分别为 (1)菌种低温驯化培养基葡萄糖8.0 16.0g，牛肉膏10.0 25. 0g，蛋白胨3.0 ·12. 0g，酵母粉2.0 9. 0g，琼脂10.0 30. 0g，蒸馏水I. 0L，pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌 30min。
(2)液体种子培养基葡萄糖5.0 15.0g，牛肉膏8.0 20. 0g，蛋白胨5. 0 15. Og,酵母粉2.0 10. Og,自来水1.01，？11值自然，1211高压蒸汽灭菌30min。
(3)发酵产酶培养基葡萄糖10.0 30.0g，(NH4)2S043.0 ~ 10. 0g，玉米浆5. 0 ·15. 0g，酵母粉 2.0 8. 0g, CaCO3LO 6. 0g, MgSO4O. I 0. 9g，自来水 I. 0L, pH 值自然，·121°C高压蒸汽灭菌30min。
全文摘要
本发明所述的一种微生物发酵生产低温超氧化物歧化酶的方法是将产生超氧化物歧化酶的微生物逐级低温驯化，使其在低温环境中生长良好；将低温驯化后的超氧化物歧化酶产生菌在10～16℃逐级扩大培养，按发酵液体积的3～9％接种量接入液体发酵培养基中，在10～16℃培养72～144h时，即微生物发酵生产低温超氧化物歧化酶结束；发酵液在4,000～8,000rpm离心收集菌体，数次洗涤后收集沉淀，悬浮于缓冲液中，并加石英砂研磨，10,000～14,000rpm离心收集上清即为粗酶液；根据不同需要和使用对象不同，可以将粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
文档编号C12N9/02GK102653733SQ20121010674
公开日2012年9月5日 申请日期2012年4月12日 优先权日2012年4月12日
发明者张庆芳, 迟乃玉, 马莉 申请人:大连大学