专利名称：一种人工合成的耐草甘膦基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种人工合成的耐草甘膦基因及其应用，特别涉及一种根据玉米偏好密码子设计并合成的耐草甘膦基因及其应用。
背景技术：
目前在植物转基因育种中所应用的外源基因如Bt、EPSPS等，大多来自原核生物，由于原核生物基因自身的特点，如I)AT含量较高，超过60%，造成基因表达的mRNA在植物体内极易被降解；2)存在类似真核基因的内含子切点、转录终止子序列，造成转录不完整、mRNA异常剪切等；3)密码子与植物密码子存在较大差异，造成蛋白翻译效率降低；4)其结构与植物等真核生物差异显著，如不含有真核生物基因的5’ -UTR序列和3’末端的PolyA加尾序列，导致基因在植物体内往往表达水平较低。例如，来自于苏云金芽孢杆菌的野生型杀虫蛋白基因在植物中的表达量非常低，其表达的毒蛋白只占总蛋白的O. 001%或者几乎检测不到。美国 Monsanto 公司的 Perlak(Perlak F J, Fuchs R L, Dean D A, et ai. Modification of the coding SEQ ID NO. uence enhances plant expressingof insect control protein genes. Proc Natl Acad Sci USA,1991,88 :3324-3328)和 Iannacone 等(Iannacoe R, Grieco P D, Cellini F. Specific SEQ ID NO. uencemodification of a cry3B endotoxin gene result in high levels of expression andinsect resistance. Plant Mol Biol,1997,34 :485-496)在不改变韋蛋白氛基酸序列的前提下，分别对杀虫蛋白基因和cryIII基因进行了改造，选用植物偏爱的密码子，増加GC含量，并去除原序列中存在的polyA和富含AT的ATTTA序列等不稳定元件序列，使转基因植株中毒蛋白的表达量增加了 30 100倍，高达可溶性蛋白的O. 02 1%，获得了明显的抗虫效果。杂草是农作物生产的大害，自1942年出现近代杂草防治技术以来，化学除草剂有了很大的发展。草甘膦类除草剂是ー种广谱性、非选择性除草剤，它通过抑制EPSPS (5-烯醇丙酮酰草酸-3_磷酸合酶，是植物体内芳香族氨基酸合成途径中的ー个重要酶)的活性，阻断了植物莽草酸途径的生物合成，強烈抑制细胞分裂，对许多一年生和多年生杂草都具有強烈的抑制作用。由于草甘膦易于被微生物分解，在土壤中无残毒，对动物无毒害，自从1976年Roundup研制成功以来，得到了广泛的应用。但是，由于玉米等禾本科作物对草甘膦敏感，使其应用受到限制。因此，将耐草甘膦基因转入玉米，不但可以扩大草甘膦的使用范围，而且可降低生产成本，保护玉米免受药害，最終达到增产增收的目的。尽管耐草甘膦基因G2-aroA已在2004年被发现，并在宿主荧光假单胞菌G2及大肠杆菌中都能高效表达，表现高耐草甘膦的特性(Yichen Sun, MinLin and Yiping Wang. Novel AroA witn high tolerance to blyposate, encoded by agene oi Pseudomonas putida 4G_lisolated from an extremeIypoIluted environmentin China. Aplied and environmental microbiology. 2005, 71 (8) :4771-4776),但其在植物，特别是重要的粮食作物中由于表达量较低而没有被利用，因此急需对其在植物中的应用进行研究，如进行密码子优化，以加速其应用到农业生产中。
发明内容
本发明的目的是提供ー种DNA分子，该DNA分子是耐草甘膦基因。本发明所提供的DNA分子，名称为mG2-aroA，其核苷酸序列为序列表中序列2。根据需要，所述DNA分子的核苷酸序列也可为序列表中序列2的第1-1335位。所述DNA分子的核苷酸序列还可为与序列表中序列2或序列2的第1-1335位至少具有98%的同一性，且编码序列9所不蛋白质(命名为G2_aroA蛋白)。其中，序列2由1338个核苷酸组成，其末尾处为两个终止密码子。序列2的第
1-1335位为编码序列，编码序列9所示的G2-aroA蛋白。序列9由444个氨基酸组成。 含有所述DNA分子的重组载体、重组宿主菌、重组细胞系或转基因植物也属于本发明的保护范围。根据需要，所述重组载体既可为克隆载体，也可为表达载体；在本发明的一个实施例中，所述重组载体具体为PS3300-UMG2。在本发明的一个实施例中，所述重组宿主菌为携带有所述DNA分子的农杆菌，如LBA4404。所述重组细胞系可以为真核细胞，也可以为原核细胞，如植物细胞系。所述转基因植物(如玉米)包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。由所述DNA分子转录所得的RNA也属于本发明的保护范围。上述DNA分子mG2-aroA在培育耐草甘膦转基因玉米中的应用也属于本发明的保护范围。所述转基因玉米包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。上述DNA分子mG2_aroA在提高玉米G2_aroA蛋白表达量中的应用也属于本发明的保护范围。所述G2-aroA蛋白为序列表中序列9所示的蛋白质。本发明针对原核生物耐草甘膦基因G2-aroA(序列I)在植物中表达较低的问题，在保持原氨基酸序列不变的前提下，采用玉米偏好性密码子对其进行优化，去除影响RNA稳定性的结构(如polyA、重复序列、AT和GC串联重复、RNAニ级结构、核糖体结合位点等)，増加GC含量等，使其在玉米中高效稳定表达。实验证实，与原始G2-aroA基因(序列I)的转基因玉米相比，本发明所提供的人工合成的耐草甘膦基因(序列2)的转基因玉米，其G2-aroA蛋白的表达量明显提高，每克(鲜重)叶片中G2-aroA蛋白的表达量可达15. 057 μ g，远高于原始G2_aroA基因转基因玉米的3.735yg。同时，与原始G2-aroA基因(序列I)的转基因玉米相比，本发明所提供的人工合成的耐草甘膦基因(序列2)的转基因玉米对草甘膦的耐受性也明显提高，转入mG2-aroA基因的T6代植株，在玉米5_6叶期喷施800ml/亩农达后，无明显的药害，表现正常，后期的生长期内均无药害反应；而转入G2-aroA基因的T6代植株，在800ml/亩农达处理后，药害非常严重，植株均表现黄化、畸形，后期植株生长期内大部分表现雄穗不分化、雌穗不吐丝或者植株矮小。
图I为载体pUC19-UG2的质粒图谱。图2为载体pCAMBIA3300的质粒图谱。图3为载体pS3300的质粒图谱。
图4为重组表达载体pS3300-UG2的质粒图谱。图5为重组表达载体pS3300-UMG2的质粒图谱。图6为重组载体pS3300-UG0的质粒图谱图7为T6代G2_aroA转基因玉米的PCR鉴定图谱。其中，泳道I为阳性对照；泳道2为DNA Marker (D2000);泳道3为空白对照组；泳道4为未转基因的玉米植株(阴性对照2);泳道5-15为11株转入G2-aroA基因的T6代转基因玉米植株。图8为T6代mG2-aroA转基因玉米的PCR鉴定图谱。其中，泳道I为阳性对照；泳 道2为DNA Marker (D2000);泳道3为空白对照组；泳道4为未转基因的玉米植株(阴性对照2);泳道5-24为20株转入mG2-aroA基因的T6代转基因玉米植株。图9为T6代G2_aroA转基因玉米植株和T6代mG2_aroA转基因玉米植株的草甘膦耐性田间鉴定图。其中，A为mG2-aroA转基因玉米植株、空载体转基因植株和未转基因植株；B为mG2-aroA转基因玉米植株和G2_aroA转基因玉米植株。A和B中，I所示一行玉米为mG2-aroA转基因玉米植株；2所示一行玉米为G2_aroA转基因玉米植株；3所示一行玉米为空载体转基因玉米植株；4所示一行玉米为未转基因的玉米植株。图10为双抗夹心ELISA检测G2_aroA蛋白浓度的标准曲线。图11为纯化后G2_aroA蛋白SDS-PAGE电泳鉴定图。其中，泳道I为蛋白Marker，自上到下依次为72KD、45KD、32KD、14. 4KD ;泳道2_4均为原核重组表达载体pET-28a-G2_aroA中表达后纯化所得的G2-aroA蛋白，上样量分别为5μ 1、10μ 1、15μ I。图12为SDS-PAGE检测纯化后单克隆抗体的纯度。其中，泳道I为蛋白Marker ；泳道2为纯化后的单克隆抗体，较大的目的条带为重链，较小的目的条带为轻链。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例I、密码子优化型耐草甘膦基因的获得本实施例根据G2_aroA基因(中国专利，申请号03826892. 2，授权公告号CN100429311C)的氨基酸序列(核苷酸序列如序列表中序列I所示)，在保证氨基酸序列不变的前提下，首先采用玉米偏好密码子对G2-aroA基因进行人工优化改造。尽量避免使用玉米稀有密码子，并调整了密码子的使用频率(表I)。在此基础上，去除DNA序列中存在的典型的造成植物基因转录本不稳定的富含AT序列，并去除了发夹结构，得到的新的核苷酸序列为序列表中序列2。序列2与G2-aroA基因(序列I)同源性只有84%，而G+C含量由原来的64. 83%降低到62. 07%。序列2所示基因即为密码子优化型耐草甘膦基因，将其命名为mG2-aroA。密码子在G2_aroA基因和mG2_aroA基因中的使用频率见表I。为方便克隆，发明人在序列2的5’端引入BamHI酶切位点，在3’端引入Kpn I酶切酶切位点，最终序列如序列表中序列3所示。序列3的第7-1344位即为序列2。序列I、序列2的第1-1335位，以及序列3的第7-1341位均编码序列，均编码序列表中序列9所示蛋白，将该蛋白命名为G2_aroA蛋白。表I玉米优选密码子标准
权利要求
1.DNA分子，其核苷酸序列为序列表中的序列2。
2.根据权利要求I所述的DNA分子，其特征在于所述DNA分子的核苷酸序列为序列表中序列2的第1-1335位。
3.根据权利要求I或2所述的DNA分子，其特征在于所述DNA分子的核苷酸序列与序列表中序列2或序列2的第1-1335位至少具有98%的同一性，且编码序列9所示蛋白质。
4.含有权利要求I或2或3所述DNA分子的重组载体。
5.含有权利要求I或2或3所述DNA分子的重组宿主菌。
6.含有权利要求I或2或3所述DNA分子的重组细胞系。
7.含有权利要求I或2或3所述DNA分子的转基因植物。
8.由权利要求I或2或3所述DNA分子转录所得的RNA。
9.权利要求I或2或3所述的DNA分子在培育耐草甘膦转基因玉米中的应用。
10.权利要求I或2或3所述DNA分子在提高玉米G2-aroA蛋白表达量中的应用；所述G2_aroA蛋白为序列表中序列9所不蛋白质。
全文摘要
本发明公开了一种人工合成的耐草甘膦基因及其应用。本发明所提供的基因的核苷酸序列为序列表中序列2。与所述原核生物耐草甘膦基因G2-aroA的转基因玉米相比，本发明所提供的人工合成的耐草甘膦基因的转基因玉米，其G2-aroA蛋白的表达量明显提高；同时对草甘膦的耐受性也明显提高。
文档编号C12N15/84GK102676553SQ20121010707
公开日2012年9月19日 申请日期2012年4月12日 优先权日2012年4月12日
发明者刘素霞, 姜付坤, 宋哲, 连肖华, 邓德芝, 韩庚辰 申请人:北京奥瑞金种业股份有限公司