专利名称：利用FSHβ基因第2外显子检测徐淮山羊繁殖力的方法
技术领域：
利用FSHP基因第2外显子检测徐淮山羊繁殖力的方法。
背景技术：
卵泡刺激素又称促卵泡激素(FSH)，是一种糖蛋白激素，分子量约为30KD，属于糖蛋白激素家族。它促进颗粒细胞增生，刺激类固醇生成，调节配子细胞的发育和成熟，是下丘脑-垂体-性腺轴中的主要激素之一。其主要生理作用是促进雌性动物子宫内膜生长、 排卵、刺激多卵泡发育及刺激雄性动物精子发生。FSH是由两个非共价结合可解离的亚基所组成，称为a-亚基和￠-亚基，a-亚基由92 96个氨基酸组成，P -亚基由109 115个氨基酸组成。由垂体分泌的FSH、LH、促甲状腺激素(TSH)及胎盘产生的绒毛膜促性腺素(hCG)它们共同组成一个糖蛋白激素家族。它们的功能各异，结构却极为相似，都是由a-亚基和￠-亚基所组成。在同一种内a-亚基是确定的，甚至在所有哺乳动物中的 a-亚基的氨基酸序列都是保守的，它们的a-亚基可以互换，而￠-亚基不能互换，￠-亚基具有激素各自的特异性，又具有种间特异性，是激素生物活性和免疫活性的决定因素。徐淮山羊是产于徐州、淮阴地区沿废黄河故道及丘陵地带的兼用型山羊地方品种。经过长期选育，逐渐培育形成具有早熟、产羔多、耐粗放、板皮质地优良等特点的徐淮山羊品种。徐淮山羊主要特征被毛白色，头部多有角，少数无角，角粗壮呈三角形，琥珀色，向外上方或向后弯曲，额微突，面微凹，嘴狭长，耳微翅，体型近似方形，前躯较大，腹部紧缩， 四肢稍高，蹄呈白玉色，尾短上翘。公羊4-7月龄性成熟。7月龄开始配种。母羊5-6月龄初配，终年发情，配种集中在中春、秋两季，产羔率250%左右，每胎多产双羔，最多者达4-5 只。以2-3月龄和7-8月龄的当年羊在晚秋初冬时屠宰剥皮，其板皮质量最好，皮板足壮， 质地坚韧细致，弹性好。徐淮山羊主要分布徐州市的丰、沛、铜山、睢宁四县，以睢宁县数量最多；淮阴市的泗洪、泗阳、宿迁等县也有少量分布。Means和Vaitukaitis等(1972)首先证实大鼠睾丸的曲细精管具有FSH的特异结合位点 ° (Means AR, Vaitukaitis J. Peptide hormone " receptors " specif ic binding of 3H-FSH to testis[J]Endocrinology, 1972,90 :39-46.) Monniaux 等(1989)发现，具有二层或二层以上颗粒细胞的大鼠卵泡，其颗粒细胞膜上已存在FSH结合位点.(Monniaux D，De RevierM M. Quantitative autoradiographic study of FSH Binding sites in prepubertal ovaries of three strains of rats[J]. J Reprod Fertil，1989，85 : 151-162.)。赵要风等(1999)通过交叉PCR扩增对猪FSHP亚基基因结构区插入片段进行了精确定位，该插入片段位于第I个内含子靠近第2个外显子上游区段。(赵要风，李宁，陈永福，等.猪FSHP基因RFLP s研究初报[J],畜牧兽医学报，1998，29 (I) :23-26.)。1997年Abir等首次利用镜下显微解剖的方法获取人腔前卵泡并培养(Abir R， Franks S，Mobberley M A，et al. Mechanical isolation and in vitro growth of preantral and small antral human follicles[J]. Fertil Steril，1997，68 :682-688.)。 Silva的研究结果表明FSH能够剌激体外培养的牛颗粒细胞P450aMmRNA和P450scxmRNA
3的转录，雌激素、孕激素的合成能力相应的提高，对雌激素起效的最小剂量为O. lng/ml, 而孕丽为 10ng/ml。(J Manuel Silva, et al. [J]. Biol Reprod, 2000,62 :186-191.)。 Campbell发现生理浓度的FSH刺激羊颗粒细胞的增生和分化。(Campbell B K，et al. [J], Biol Reprod, 1996,106 :7-16.) Tilly等在培养大鼠的颗粒细胞时发现，在体外培养过程中，颗粒细胞所含FSH受体呈下降趋势，用FSH处理可防止这种下降(Tilly J L， Lapolt P S, Hsueh A J ff. Hormonal regulation of follicle-stimulating hormone receptor messenger ribonucleic acid levels in cultured rat granulosa cells[J]. Endocrinology, 1992，130 1296-1302.)Tisdall D J等利用反转录_PCR技术及原位RNA杂交技术，发现成年山羊在有 1-2层颗粒细胞的早期腔前卵泡中就已存在FSH受体mRNA的表达并且一直持续贯穿于卵子发生至闭锁后期。(Tisdall D J, Watanabe K, Hudson N L, et al. FSH receptor gene expression during ovarian follicle development in sheep[J]. J Mol Endocrinol, 1995,15(3) =273-281.) 0 Hulshof等发现，添加FSH可使牛腔前卵泡卵母细胞生长直径的增长加快，颗粒细胞增多，这一结果与小鼠、仓鼠和人类上的研究结果一致。(Hulshof S C, Fiquei redo J R, Beckers J F, et al. Effects of fetal bovine serum, FSH and 17 β -E2on the culture of bovine preantral follicles[J]. Theriogenology,1995,44 217-226.)。李凤娥研究表明在FSHi3基因与仔猪哺乳期生长关系的研究中发现杂合型(Nn) 母猪后代生长速度比纯合子后代生长快，存在显著的杂合效应(P < O. 05)，携带等位基因η 的母猪，其胎儿初生重大于NN型的母猪(P < O. 05)(李凤娥.猪ESR和FSHii位点对繁殖性状的调控及其调控机理的研究[学位论文].华中农业大学，2002.)。朱孟玲等研究发现 FSH^基因对初产小梅山母猪的总产仔数、产活仔数和初生窝重有显著影响(朱孟玲，吴井生，陈超，等.FSHii基因和PRLR基因的多态性对小梅山猪繁殖性状的影响[J].猪业科学， 2008(4) :76-78. )。CHEN Jie等研究表明二花脸猪中FSHβ基因各基因型间产仔数差异显著(CHEN Jie, JIANG Zhi-Hua, LIU Hong-Lin,LI Qi-Xian, FANG Mei-Ying, WU Yan-Ning. Relationship between PCR-SSCP at FSHβ subunit locus and litter size in the Erhualian pigs. Journal of Nanjing Agricultural University,1999, 22(2) :55-58.)。
程美玲等人对云岭黑山羊产糕性状的分子基础进行了研究，分析了云岭黑山羊FSH基因表达量与其产羔数性状的相关性，采用绝对荧光定量PCR方法对两品种山羊卵巢组织中FSH基因的表达量、用放射免疫技术对血液中FSH的水平进行了测定。结果表明，云岭黑山羊FSH表达水平显著地低于波尔山羊(P < 0. 05)，云岭黑山羊血清FSH浓度显著低于波尔山羊(P < 0. 05)，且云岭黑山羊FSH表达水平与产羔数之间的相关系数为
0.9540，存在显著正相关(P < 0. 05)(程美玲，赵素梅，黄英等.云岭黑山羊FSH基因表达量与其产羔数相关性研究[J].云南农业大学学报，2010，25 (6) :807-810.)。AN Xiao-peng 等人根据羊的FSHii基因序列，设计两对引物，通过PCR-SSCP检测FSHii基因第2外显子在西农萨能奶山羊和波尔山羊中的单核苷酸多态性。研究结果表明FSHP基因与羊的产糕性能存在着显著的相关性(AN Xiao-peng, HAN Dan，HOU Jin-xing，等 Polymorphism of Exon 2 of FSHβ Gene and Its Relationship with Reproduction Performance in Two Goat Breeds [J], Agricultural Sciences in China，2010，9 (6) :880-886.)。王敬军等人为提高崇明白山羊的繁殖效率，用促卵泡素(Follicle-Stimulating Hormone,FSH)对崇明白山羊进行超数排卵，回收2-4细胞期胚胎移植至同期发情受体的输卵管，跟踪受体妊娠和产羔结果，观察不同FSH剂量时的超排结果，比较受体品种和移植胚胎数对妊娠率和产羔率的影响(王敬军，胡大伟，刘国辉，等.FSH剂量、受体品种及移植胚胎数对崇明白山羊胚胎移植效率的影响[J]·上海交通大学学报，2011，29 (I) :38-42.)。哺乳动物FSH0基因编码110多个氨基酸，其在分子进化过程中具有很强的保守性。例如在111个氨基酸中，人和马FSHii亚基只有9个氨基酸的变化，同源性达到92% ； 羊和牛之间有8个氨基酸的变化，同源性为94% ;猪与牛之间有7个氨基酸的变化，同源性为94% (焦淑贤，王瑞祥，蔡正华，等。枫泾和长白青所母猪首次发情周期内血清中5种生殖激素的变化[J]·畜牧兽医学报，1992，23 (3) :202-206.)。张莉，李庆章等(2002)指出 FSH由α和β亚基所组成，FSHa负责信号传导作用，其氨基酸序列保守，山羊与绵羊、水牛的同源性最高(张莉，李庆章，关洪斌.山羊卵泡刺激素a亚基cDNA的分子克隆与序列分析[J].中国生物化学与分子生物学报，2002，18 (6) :693-697.)。FSH^基因作为一个影响繁殖性状的候选基因，其SNP与产羔性状相关性已成为重要研究方向之一。梁琢，储明星等(2006)在济宁青山羊和辽宁绒山羊中检测到AA、AB和 AC 3种基因型，在波尔山羊中检测到AA、CC和AC 3种基因型，在安哥拉山羊中检测到AA、 BB、CC、AB、AC和BC6种基因型，BB型与AA型相比在外显子2的第94bp处有G — A突变， CC型与AA型相比在外显子2的第174bp有一处C —T沉默突变。(梁琢，储明星，张建海， 等.FSHii基因PCR-SSCP多态性及其与济宁青山羊高繁殖力关系的研究[J].遗传，2006， 28(9) :1071-1077.)。安小鹏等(2009)则在西农萨能奶山羊和波尔山羊2个群体中发现外显子2的40bp处发生了 G — A突变，同时在148bp处碱基发现了 T — C替代(安小鹏，韩丹，侯金星，等.FSHii基因外显子2的多态性及其与两个山羊品种繁殖性能的相关性研究 [J].中国农业科学，2009，42 (11) :4051-4057.)。杨玉敏等(2009)对黄淮山羊的该段序列研究中发现存在AA、AB、和AC 3种基因型，AB型与AA型相比在47bp和147bp发生了 C —T 突变，AC型除在147bp处发生了 C —T突变外，在156bp处则发生了 G — A突变(杨玉敏， 丁建平，张子军，等.黄淮山羊FSHii基因第2外显子SSCP多态性研究[J].安徽农业大学学报，2009，36 (3) :461-463.)。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用FSHii基因第2外显子检测徐淮山羊繁殖力的方法。本发明所提供的检测徐淮山羊繁殖力的方法，是检测待测徐淮山羊基因组中的 FSH^基因的第二外显子第174位核苷酸为C还是突变为T，185位核苷酸为G还是突变为 A，从而确定徐淮山羊的基因型，然后通过基因型确定徐淮山羊繁殖力；所述FSHii基因第2 外显子核苷酸序列为自GENBANK ACCESSION NUMBER为S64745. I的第2461至2691的核苷酸。所述确定徐淮山羊的基因型的方法为如果徐淮山羊基因组中的FSH0基因的第二外显子第174位核苷酸为C时，其纯合体的基因型为AA，突变为T时，其基因型为AB ;如果徐淮山羊基因组中的FSHii基因的第二外显子第185位核苷酸为G时，其纯合体的基因型为AA，突变为A时，其基因型为AC。通过基因型确定徐淮山羊繁殖力的方法为所述AA基因型徐淮山羊的繁殖力高于AB基因型徐淮山羊和AC基因型徐淮山羊。所述方法中，所述检测山羊基因组的FSHP基因的第二外显子第174位核苷酸为 C还是突变为T，185位核苷酸为G还是突变为A的方法是利用PCR-SSCP方法扩增待测山羊基因组中的核苷酸序列为自GENBANK ACCESSION NUMBER为S64745. I的第2387至2738 位核苷酸的片段，并将该扩增产物进行SSCP检测，若得到2条电泳条带，即为AA基因型；得到与所述AA基因型沿电泳方向第一条电泳条带和第二条电泳条带具有相同迁移距离的两条电泳条带并且在这两条电泳条带之间出现一条新的条带的，为AB基因型；得到与所述AA 基因型沿电泳方向第一条电泳条带和第二条电泳条带具有相同迁移距离的两条电泳条带并且在第一条电泳条带上面出现一条新的电泳条带的，为AC基因型。所述方法中，所述PCR-SSCP方法的扩增引物对为具有序列表中SEQ ID No. I所述的核苷酸和具有序列表中SEQ ID No. 2所述序列的核苷酸。所述方法中，所述繁殖力为每胎产羔数。本发明的方法，采用SSCP方法对在FSHP基因第二外显子进行单核苷酸多态性检测，并对具有SSCP多态性的DNA片段进行测序比较分析，寻找到与繁殖力相关的遗传标记， 数据统计结果表明，该遗传标记多态性可确定山羊的繁殖力。本发明的方法即利用该遗传标记，建立SSCP检测山羊品种的基因型，并利用该基因型确定其繁殖力的有效方法，实验证明，该方法可以迅速、简便的检测徐淮山羊的繁殖力。本发明的方法为山羊的分子育种提供了一个准确简便的检测方法。
图I为FSHP基因第二外显子的引物的PCR产物。图2为徐淮山羊PCR扩增片段的SSCP分析。
具体实施例方式下述实施中所用主要试剂10XPCR Buffer, d NTP, Taq DNA聚合酶，DNA Maker PCR弓丨物等均购自上海生物工程公司。检测山羊繁殖力的方法的建立及其效果验证I、检测山羊繁殖力的方法的建立I)模板材料准备2011年具有产羔数记录的75只徐淮山羊母羊的耳组织，采自江苏镇江种羊场。采用酚-氯仿法抽提山羊的基因组DNA，灭菌TE溶解稀释后_20°C保存备用。2)弓丨物设计和PCR扩增根据Guzman K等发表的绵羊FSH ^基因外显子2的序列(GenBank登录号 S64745)设计引物，引物扩增片段大小为352bp。上游引物5'-CAGACTACTGTAACTCATCTC-3' (SEQ ID No. I)下游引物5'-ATGTTTTGGTCCTTTAAGGGT-3' (SEQ ID No. 2)PCR扩增反应总体积为 20 ii L 10 XBuffer 2. 5 y L (含Mg2+)，lOmmol/LdNTP 2 u L,10 μ mol/L上下游引物各I. O μ L, IOOng/ μ LDNA模版I μ L, rTaq酶O. 3 μ L,去离子水 12. 2 μ L0PCR扩增条件如下94°C预变性5min，94°C变性30s, 58. 8°C退火30s，72°C延伸 30s, 32个循环，72°C延伸10min，4°C保存。扩增产物在聚丙烯酰胺凝胶中检测，结果表明扩增片段长度与预期大小一致(图 I)，并且没有非特异性扩增条带，可以直接进行SSCP分析。3) SSCP 分析将扩增的PCR产物进行SSCP分析，具体方法如下所述取5μ L PCR产物置于 PCR管中，加5μ L上样缓冲液(98%甲酰胺、O. 025%溴酚蓝、O. 025%二甲苯氰、ρΗ8. O的 IOmmoI/L EDTA, 10%甘油)，离心混匀，98°C变性lOmin，迅速插入冰盒放置_25°C冰箱7min 完成变性。变性后PCR产物在12%非变性聚丙烯酰胺凝胶中常温电泳过夜，电泳结束后，银染显色并进行拍照和分析。结果发现PCR扩增片段有3种基因型，命名为AA、AC和AB (图2)。扩增产物非变性聚丙烯酰胺电泳得到两条带的，即为AA基因型；得到与所述AA基因型沿电泳方向第一条电泳条带和第二条电泳条带具有相同迁移距离的两条电泳条带并且在这两条电泳条带之间出现一条新的条带的，为AB基因型；得到与所述AA基因型沿电泳方向第一条电泳条带和第二条电泳条带具有相同迁移距离的两条电泳条带并且在第一条电泳条带上面出现一条新的电泳条带的，为AC基因型。图2中，泳道3，5，6，7为AA基因型；泳道1，2，8为AB基因型；泳道4为AC基因型。根据PCR-SSCP的分析结果，选取不同的基因型的样品进行序列测定。PCR产物经电泳鉴定后，交由上海生物工程技术服务有限公司AB I PRISM 377DNA自动测序仪完成序列测定。结果发现AA型与GenBank S64745序列一致，AB型与AA型相比在外显子2的第 174bp有一处C — T沉默突变，AC型与AA型相比在外显子2的第185bp发生G — A突变， 并引起氨基酸的改变(精氨酸一谷氨酰胺)。上述结果表明，引物扩增得到的352bp的片段具有多态性，共有AA、AB和AC三种基因型。其中AA基因型的扩增得到的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 3所示，AB基因型的扩增得到的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 4所示，AC基因型的扩增得到的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 5所示。2、FSHi3基因与繁殖力关系的统计分析配合下列模型进行最小二乘方差分析，比较山羊产羔数在基因型之间的差异。 _] Yijk = μ +Gj+Ik+eiJk(Yijk为性状观察值；μ为群体均值而为基因型效应；Ik为家系效应；eiA为随机残差效应)，采用SPSS生物分析软件分析基因型与山羊产羔数的相关。3、FSHii基因不同基因型的徐淮山羊的产羔数的最小二乘均值不同FSH0基因型的75只徐淮山羊母羊产羔数的最小二乘均值及标准误见表I。由表I可见AA基因型徐淮山羊产羔数的最小二乘均值比AC基因型的多O. 75 只(P < O. 05)，而AA与AB及AB与AC基因型产羔数最小二乘均值的差异都不显著(P >0. 05)。该结果表明，可利用该引物基因型多态性检测徐淮山羊繁殖力。
表I不同FSHP基因型的徐淮山羊产羔数的最小二乘均值及标准误
权利要求
1.利用FSHii基因第2外显子检测徐淮山羊繁殖力的方法，是检测待测徐淮山羊基因组中的FSH β基因的第二外显子第174位核苷酸为C还是突变为Τ，185位核苷酸为G还是突变为Α，从而确定徐淮山羊的基因型，然后通过基因型确定徐淮山羊繁殖力；所述FSH3 基因第2外显子核苷酸序列为自GENBANK ACCESSION NUMBER为S64745. I的第2461至 2691的核苷酸；所述确定徐淮山羊的基因型的方法为如果徐淮山羊基因组中的FSHii基因的第二外显子第174位核苷酸为C时，其纯合体的基因型为AA，突变为T时，其基因型为AB ;如果徐淮山羊基因组中的FSHii基因的第二外显子第185位核苷酸为G时，其纯合体的基因型为 AA,突变为A时，其基因型为AC ；通过基因型确定徐淮山羊繁殖力的方法为所述AA基因型徐淮山羊的繁殖力高于AB基因型徐淮山羊和AC基因型徐淮山羊。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述检测徐淮山羊基因组的FSHii基因的第二外显子第174位核苷酸为C还是突变为T，185位核苷酸为G还是突变为A的方法是利用PCR-SSCP方法扩增待测徐淮山羊基因组中的核苷酸序列为自GENBANK ACCESSION NUMBER为S64745. I的第2387至2738位核苷酸的片段，并将该扩增产物进行SSCP检测， 若得到2条电泳条带，即为AA基因型；得到与所述AA基因型沿电泳方向第一条电泳条带和第二条电泳条带具有相同迁移距离的两条电泳条带并且在这两条电泳条带之间出现一条新的条带的，为AB基因型；得到与所述AA基因型沿电泳方向第一条电泳条带和第二条电泳条带具有相同迁移距离的两条电泳条带并且在第一条电泳条带上面出现一条新的电泳条带的，为AC基因型。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR-SSCP方法的扩增引物对为具有序列表中SEQ ID No. I所述的核苷酸和具有序列表中SEQ ID No. 2所述序列的核苷酸。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其特征在于所述繁殖力为每胎产羔数。
全文摘要
本发明公开了利用FSHβ基因第2外显子检测徐淮山羊繁殖力的方法，是检测待测山羊基因组中的FSHβ基因的第二外显子第174位核苷酸为C还是突变为T，185位核苷酸为G还是突变为A，从而确定徐淮山羊的基因型，然后通过基因型确定徐淮山羊繁殖力。本发明的方法利用SSCP遗传标记多态性确定徐淮山羊的繁殖力，可以迅速、简便的检测徐淮山羊的繁殖力，为徐淮山羊的育种提供了一个准确简便的检测其繁殖力的方法，从而有利于扩大有利群里，进行规模化养殖，提高经济效益。
文档编号C12Q1/68GK102586471SQ201210112319
公开日2012年7月18日 申请日期2012年4月17日 优先权日2012年4月17日
发明者周洪, 孙伟, 张玉龙, 陈家振 申请人:扬州大学