专利名称：鉴定鸡传染性支气管炎病毒流行株与疫苗株的rt-pcr法的制作方法
技术领域：
本发明涉及RT-PCR检测技术，具体地说，涉及鉴定鸡传染性支气管炎病毒流行株与疫苗株的RT-PCR法。
背景技术：
鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis, IB)是鸡的一种急性、高度传染性的上呼吸道疾病，病原为传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus，IBV)。IBV疫苗防控中的主要难点是该病毒血清型较多，并且不同血清型之间缺少有效的交叉保护性。因此生产中有效区分IBV疫苗株和流行野毒株并明确其血清型对该病的防控至关重要。目前针对传染性支气管炎病毒进行病原学检测的方法主要有病毒分离鉴定和RT-PCR方法。病毒分离鉴定要将临床样品处理后接种合适的载体(通常是SPF鸡胚)通过观察特征性的鸡胚病变(侏儒胚)来进行初步鉴定，初步分离物还要通过中和试验进行进一步鉴定和进行血清分型，因此费时费力。常规RT-PCR方法由于M41类活疫苗的广泛使用而不能够区分疫苗毒和野毒株，具有明显的局限性。对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的系统研究结果表明，目前我国IBV临床上主要存在两种类型的毒株，一种为M41血清型毒株，约占25%，利用M41相关疫苗(如H120、H52、Ma5等)可有效进行防控。另一种毒株类型为A2-Like毒株，约占70%左右，必须使用对应的疫苗才能进行有效防控。这两类毒株之间的核苷酸同源性通常只有87%左右，这种明显的基因差异的存在为设计引物，建立更加实用的PCR检测方法提供了可能。
发明内容
本发明的目的在于克服现有检测手段的不足，提供一种采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术对鸡传染性支气管炎病毒疫苗株和流行株感染进行快速鉴别检测的方法。为了实现本发明目的，本发明的一种鉴定鸡传染性支气管炎病毒流行株与疫苗株的RT-PCR法，包括以下步骤I)临床样品经预处理后，提取样本总RNA。2)反转录(RT)得到样本cDNA。3)以样本cDNA为模板，使用以下引物组合进行PCR扩增。上游引物PI : 5 ’ -GACCACAGTCACGCACAA-3 ’ ；下游引物P2 :5’ -AATCTCCTCGGGTTCATC-3’ ；下游引物P3 :5’ -AACTACACTCAACAATGGA-3’ ；以及下游引物P4 :5’ -CCTGAITCTTCTTGATAC-3’。4)分析PCR扩增产物，结果判定。即对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，根据电泳结果确定样品中能否扩增出各目的条带。如果无目的条带则为鸡传染性支气管炎病毒检测阴性；如果扩增出通用目的条带(182bp)和疫苗株目的条带(470bp)则为鸡传染性支气管炎病毒疫苗株检测阳性；如果扩增出通用目的条带(182bp)和流行株目的条带(355bp)则为鸡传染性支气管炎病毒流行株检测阳性；如果同时扩增出通用目的条带和疫苗株、流行株目的条带则为疫苗株与流行株鸡传染性支气管炎病毒检测阳性，如果仅扩增出通用目的条带(182bp)则证明为其他类型毒株的传染性支气管炎病毒检测阳性。本发明参照GenBank上登录的鸡传染性支气管炎病毒基因组的高度保守区段以及鸡传染性支气管炎病毒疫苗株和流行株(GenBank登录号分别为FJ888351、AY851295、EU817497)基因组的基因型间高度差异的区段设计4条检测弓I物序列引物PI、引物P2、弓丨物P3和引物P4。引物Pl与P2组合可扩增182bp的鸡传染性支气管炎病毒通用目的基因片段，引物Pl与P3组合可扩增355bp的流行株特异性目的基因片段，引物Pl与P4组合可扩增470bp的常用疫苗株目的基因片段，适用于对鸡传染性支气管炎病毒常用疫苗株和主 要流行野毒株进行快速鉴别检测。前述检测方法中，步骤2)中反转录生成cDNA的方法为在0. 2ml离心管内加入下列成分RNA 溶液6ul500 u g/ml 随机引物I ii I轻轻混匀，70°C水浴5min，冰浴2min ；然后向上述离心管中加入下列成分
5x反应缓冲液40
2.5mM dNTPs
5 OU/fil Rnase 抑制刻I fil
200U4U反转录酶0.50
DEPC处理水5.50轻轻混匀，将上述反应体系置于37°C Ih, 95°C 5min，得到样本cDNA。前述检测方法中，步骤3)中PCR反应体系以20 ill计为
cDNA3 ^il
20pM上游引物Pl1.4^il
20pM下游引物P20.6^il
20pM下游引物P30鄭1
20pM下游引物P40.4^il
2 X PCR Taq mix14.2(ilPCR 反应条件为95 °C 5min ；94°C 45s, 52. 5 °C 45s, 71 °C 60s，共 30 个循环；IVC IOmin。进一步优化条件可研制成RT-PCR检测试剂盒，提高检测标准性。具体地，所述试剂盒包括上述鉴定鸡传染性支气管炎病毒流行株与疫苗株的引物组合引物P1、引物P2、引物P3和引物P4。优选地，所述试剂盒还包括随机引物(即人工合成的长度为6个寡核苷酸残基的寡聚核苷酸片段的混合物)、反应缓冲液、dNTPs、Rnase抑制剂、反转录酶、PCRTaq mix、DEPC处理水中的一种或多种。更优选地，所述试剂盒还包括阳性标准模板。由于扩增的目的序列片段位于鸡传染性支气管炎病毒基因组的高度保守区段以及鸡传染性支气管炎病毒疫苗株和流行株基因组的高度差异的区段，且最长的核苷酸序列只有470bp，因而该法敏感性好，简便易行，对常用疫苗株、主要流行株及其他感染类型等的鸡传染性支气管炎病毒感染均能够较好检出(通用性)。该法对其它常见禽病病原，如禽流感病毒、鸡新城疫病毒、鸡传染性法氏囊病毒以及鸡痘病毒的检测结果皆为阴性，没有交叉反应，表明该方法亦具有良好的特异性。另外，本发明的方法还具有高效率、低成本的特点，在实现对IBV与其他病毒的鉴别的同时可鉴别出毒株基因型的归属。该方法的建立对鸡传染性支气管炎病毒的分子变异机制以及分子流行病学分析均有十分重要的意义。
图I为鸡传染性支气管炎病毒常用疫苗株及流行野毒株RT-PCR检测结果；其中，M DNA Marker ;1和2 :鸡传染性支气管炎病毒常用疫苗株H120 ；3和4 :鸡传染性支气管炎流行野毒株YN株。图2为采用本发明的方法对混合样品的RT-PCR检测结果；其中，M DNA Marker ；I :鸡传染性支气管炎流行野毒株与常用疫苗株混合样品。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例I设计用于鉴定鸡传染性支气管炎病毒流行株与疫苗株的引物组合根据GenBank上登录的鸡传染性支气管炎病毒基因组的高度保守区段以及鸡传染性支气管炎病毒疫苗株和流行株(GenBank登录号分别为FJ888351、AY851295、EU817497)基因组的基因型间高度差异的区段设计以下4条引物序列上游引物Pl :5’ -GACCACAGTCACGCACAA-3，；下游引物P2 :5，-AATCTCCTCGGGTTCATC-3 ’ ；下游引物P3 :5 ’ -AACTACACTCAACAATGGA-3 ’ ；以及下游引物P4 :5 ’ -CCTGATTCTTCTTGATAC-3，。实施例2鉴定鸡传染性支气管炎病毒流行株与疫苗株的RT-PCR法I临床样品的处理I. I实验试剂和主要仪器主要试剂灭菌生理盐水。主要仪器4°C台式离心机；涡旋振荡器；研磨器。I. 2实验步骤(I)组织样品处理取Img脏器组织样品加入Iml灭菌生理盐水并用研磨器进行研磨混悬，组织悬液3000rpm离心30min后取上清用于检测。
(2)棉拭子样品的处理将气管或泄殖腔拭子样品加入Iml灭菌生理盐水涡旋振荡器混悬后，同上离心取上清用于检测。2样本总RNA的提取2. I实验试剂和主要仪器主要试剂Trizol试剂；DEPC处理水；Rnase_free的离心管与Tips ;新的氯仿、异丙醇和乙醇，DEPC水配制的75%乙醇。主要仪器4°C台式离心机。
2. 2实验步骤(I)取待检样品悬液250 Ul，加入750 U I Trizol，颠倒混匀15s至液体变粘稠，冰浴 15min ；(2)加入200 U I氯仿，颠倒混匀15s，冰浴15min ；(3)混合液以12000rpm,4°C离心15min分为两相；(4)取上层水相加入另一离心管内，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后15_30°C静置 IOmin ；(5) 13500rpm, 4°C离心 15min,沉淀 RNA ；(6)小心尽弃上清，用DEPC水配制的75%乙醇Iml轻轻漂洗沉淀；(7)将RNA沉淀置超净台内风干，约IOmin ；(8)用DEPC水处理的灭菌水9 ill溶解沉淀，并加入I ill核酸酶抑制剂(Rnasin50U/U I)；(9)提取的RNA样品直接用于反转录或分装后_80°C保存备用。3逆转录生成cDNA3. I实验试剂和主要仪器主要试剂反转录酶(ReverseTranscriptase) 200U/ U I ;核酸酶抑制剂(RnaseInhibitor) 50U/u I ；5 倍体积的反应缓冲液(5 X Reaction Buffer) ；dNTP 混合物 2. 5mM ；随机引物(Random Primer,即人工合成的长度为6个寡核苷酸残基的寡聚核苷酸片段的混合物)500 u g/ml ；DEPC处理水。主要仪器PCR扩增仪；恒温水浴锅。3. 2实验步骤(I)在0. 2ml离心管内加入下列成分RNA 溶液6 U I随机引物IU I轻轻混匀，70°C水浴5min，冰浴2min。
5 X Reaction Buffer4jxl
dNTP混合物2pl
Rnase InhibitorI jxlReverse Transcriptase0.5(il
DEPC处理水5.50轻轻混匀，进行如下反应，37°C Ih, 95°C 5min，得到样本cDNA。4目的片段的PCR扩增4. I实验试剂和主要仪器主要试剂cDNA溶液；2XTaq mix ;实施例I中设计的特异性引物P1、P2、P3和P4。主要仪器PCR扩增仪；电泳仪；a凝胶成像仪。4. 2实验步骤在0. 2ml离心管中加入下列成分
cDNA3 ^il
上游引物Pl ( 20^iM)1.4^il
下游引物P2 ( 20^iM)0.6^il
下游引物P3 ( 20^iM)0.4^il
下游引物P4 ( 20^iM)0.4^il
2 x PCR Taq mix14.2(il轻轻混匀后，进行如下反应95°C预变性5min，94°C 45s, 52. 5°C 45s，71°C 60s，进行30个循环，循环结束71°C延伸lOmin。PCR反应结束后，用IXTAE电泳缓冲液制备2 %琼脂糖凝胶并按照参考比例混入荧光染料Goldview 。按照比例将5iU PCR产物加入凝胶孔中，选择合适的电压(4V/cm-10V/cm)，电泳时间为40-60分钟，进行电泳，电泳结束后将凝胶块置于凝胶成像仪上观察并拍照，结果如图I所示。利用此方法对鸡传染性支气管炎病毒各种流行株及疫苗株毒株样品及疫苗株和流行毒株混合样品进行检测，结果均有符合预期的检出，表明本方法具有良好的敏感性和通用性，结果如图2所不。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.鉴定鸡传染性支气管炎病毒流行株与疫苗株的引物组合，其特征在于，其包括上游引物 Pl :5’ -GACCACAGTCACGCACAA-3’ ；下游引物 P2 :5’ -AATCTCCTCGGGITCATC-3’ ； 下游引物 P3 :5’ -AACTACACTCAACAATGGA-3’ ；以及 下游引物 P4 :5’ -CCTGAITCTTCTTGATAC-3’。
2.含有权利要求I所述引物组合的用于鉴定鸡传染性支气管炎病毒流行株与疫苗株的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括随机引物、反应缓冲液、dNTPs、Rnase抑制剂、反转录酶、PCR Taq mix、DEPC处理水中的一种或多种。
4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性标准模板。
5.鉴定鸡传染性支气管炎病毒流行株与疫苗株的RT-PCR法，其特征在于，包括以下步骤 1)样本总RNA的提取； 2)反转录得到样本cDNA； 3)以样本cDNA为模板，使用权利要求I的引物组合进行PCR扩增； 4)分析PCR扩增产物，结果判定。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤3)中PCR反应体系以20Ul计为cDNA 3 ^il20pM上游引物Pl1.4^il20pM下游引物P20.6^il20pM下游引物P30鄭120pM下游引物P40.4^il2 X PCR Taq mix14.2(ilPCR 反应条件为95 °C 5min ；94°C 45s, 52. 5 °C 45s, 71 °C 60s，共 30 个循环；71 °CIOmin0
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)中反转录生成cDNA的方法为 在0. 2ml离心管内加入下列成分 RNA溶液6 u I 500iig/ml随机引物IiU 混匀，70°C水浴5min，冰浴2min ； 然后向上述离心管中加入下列成分
全文摘要
本发明提供了一种利用多重引物组合鉴定鸡传染性支气管炎病毒流行株与疫苗株的RT-PCR法，其包括如下步骤样本总RNA的提取→反转录得到样本cDNA→使用多重引物扩增目标片段→凝胶电泳分析、结果判定。该法适用于对鸡传染性支气管炎病毒常用疫苗株和主要流行野毒株进行快速鉴别检测，具有高特异性、高灵敏度、高效率、低成本的特点，在实现对IBV与其他病毒的鉴别的同时鉴别出毒株基因型的归属。该方法的建立对鸡传染性支气管炎病毒的分子变异机制以及分子流行病学分析均有十分重要的意义。
文档编号C12N15/11GK102643931SQ201210112760
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月17日 优先权日2012年4月17日
发明者唐娜, 张国中, 秦秀慧, 龚一 申请人:中国农业大学