专利名称：一种阿维菌素B1a高产菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及ー种阿维菌素Bla高产菌株及其诱变方法与其在发酵生产阿维菌素Bla中的应用。
背景技术：
阿维菌素(avermectin, AVM)是一种由放线菌阿维链霉菌(streptomycesavermitilis)经液体发酵产生的ー类十六元环内脂类抗生素,是ー种全新无公害生物农用抗生素，具有高效、低毒及环境友好等特点，对蔬菜、果树、棉花、水稻等多种作物的相关害虫有良好防效杀灭作用，其杀虫活性比一般化学农药高出几到几十倍。作为ー种农用杀虫剂，阿维菌素的作用机理独特，对害虫具有触杀和胃毒作用，对靶标作物有较强的滲透作用，能有效防治双翅目、同翅目、鞘翅目和磷翅目害虫。作为农用药物，它具有高选择性和高安全性。在常用剂量下，不仅对人畜安全，还不伤害大多种类的有益昆虫，不破坏生态。在光照条件下或在土壌微生物作用下迅速降解成无活性的化合物，其分子碎片最終作为碳源被植物和微生物分解利用，几乎无任何残留毒性。在水中易降解，无残留，不污染环境，且在生物体内也无积累和持久性残留。是目前世界上最有前途的生物杀虫杀螨剂。目前，上千种阿维菌素衍生物已经合成出来，已经商品化的有伊维菌素(ivermectin,简称IVM),埃玛菌素(emamectin,又称甲氨基阿维菌素)，道拉菌素(dormectin),埃拍利诺菌素(eprinomectin,又称こ酰氨基阿维菌素)和色拉菌素(selamectin)等。可见，阿维菌素不仅是ー个优异的产品，更是ー种宝贵的资源，被认为是继青霉素以来抗生素的又一次革命。因此，市场拉动和技术进步都推动了阿维菌素得迅猛发展。经发酵产生的阿维菌素中包括结构类似物共8种，按其中的C5、C22_23、C26三个位置上的结构差异可以区分为Ala、Alb、A2a、A2b、Bla、Bib、B2a、B2b 8种组分，其中B组分的生物活性优于A组分，其中以Bla组分活性最高且毒性最小。因此，提高发酵产物中Bla组分已经成为目前研究領域的重点。例如，河北大学生命科学学院赵丽坤等人利用紫外线-氯化锂(UV-LiCl)和紫外线-亚硝基胍(UV-NTG)对其进行复合诱变处理获得了一株相对出发菌株含量提高65%左右的高产菌株。沈阳药科大学生物技术与生物制药实验室采用NTG、DES、紫外线等诱变因子对阿维链霉菌的原始菌株进行了多次诱变处理，产量有了明显提高。CN201110003059. 2公开了ー种阿维菌素生产菌及其制备方法，其通过反复的诱变和筛选得到一株名为FT26-9的高产菌株，其应用于エ业生产可提高发酵单位40%左右。但由于其诱变大多采用了具有致癌作用的剧毒有机试剂，且诱变エ艺复杂，对人体健康和环境保护带来不利影响，上述技术方案有待进ー步提高。
发明内容
本发明要解决的技术问题之ー在于提供一种简单、高效、安全的阿维菌素Bla高产菌诱变方法，诱变筛选得到一株可大幅度提高发酵产物中阿维菌素Bla组分的阿维菌素Bla高产菌株。本发明要解决的技术问题之二在于提供上述阿维菌素Bla高产菌株的应用。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下一种阿维菌素Bla高产菌株，其分类命名为阿维链霉菌(streptomycesavermitilis)AVE07-N2-16515,已于2012年4月8日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号CCTCC NO M 2012094。本发明所述的阿维菌素Bla高产菌株阿维链霉菌AVE07-N2-16515的筛选方法是将阿维链霉菌出发菌株，经低能氮离子注入-氯化锂(N+-LiCl)复合诱变结合紫外线-氯化锂(UV-LiCl)复合诱变后，通过初筛、摇瓶发酵复筛选获阿维菌素Bla产量高的菌株作为下一轮诱变的出发菌株，重复上述诱变过程，最后筛选出阿维菌素Bla产量高的目标菌株。本发明菌株的形态学及生理生化学特征如下菌落颜色灰白色。需氧方式好氧生长。菌落大小2 5_。适宜生长温度27· 5 28. 5°C。适宜生长pH :7.2 7. 4。菌体形态圆形菌落，无光泽。革兰氏染色阳性。本发明所提供的阿维菌素Bla高产菌株的诱变方法，具体步骤如下(a)、单孢子悬浮液制备将阿维链霉菌出发菌株孢子制成孢子悬液，调整孢子浓度为IO6个/毫升。(b)、低能氮离子注入-氯化锂复合诱变取O. ImL的步骤(a)中孢子悬液均匀涂布于无菌空平皿上，以无菌风吹干，在10 18KeV、注入剂量为40 X IO14 240 X 1014ions/cm2下对阿维链霉菌进行氮离子注入，离子注入完毕后，取出平皿，在无菌环境下用ImL无菌水洗脱，涂布到氯化锂平板培养基上，在26 30°C下倒置培养6 7d。(c)、紫外线-氯化锂复合诱变取5mL步骤(a)中孢子悬液移入含有磁力转子的无菌空平板中，进行紫外线照射诱变，照射时间为30 90s，诱变结束后取菌悬液涂布于氯化锂平板培养基上，在26 30°C下避光倒置培养6 7d。(d)、诱变菌株的筛选初筛将步骤(b)和步骤(C)诱变得到的单菌落接种至斜面培养基上，在26 30°C下培养6 7d，铲取二分之一的菌体于离心管中，用丙酮浸泡12 15h，然后加入
O.25mL乙酸乙酯，快速混匀，离心，取上清液测定各菌株浸取液中阿维菌素Bla效价，留取50 %的高效价菌株上摇瓶发酵进行复筛。、
复筛将初筛筛选到的菌株经斜面培养接入种子培养基扩大培养后，按2 10%(v/v)的接种量接入发酵培养基。在26 30°C，180 220rpm摇床转速下培养8 IOd下摇床，取3mL发酵液于离心管中，3500rpm高速离心IOmin,弃上清液,加入甲醇至9mL,在快速混匀器上震荡30min ；3500rpm高速离心lOmin，取上清液测定发酵液中阿维菌素Bla效价。取发酵液阿维菌素Bla效价最高的菌株作为下次诱变的出发菌株，重复步骤(a) (d)，直至筛选出阿维菌素Bla产量高的目标菌株阿维链霉菌AVE07-N2-16515。
步骤(b)中低能氮离子注入，优选诱变能量为16KeV，诱变剂量为160X 1014ions/
2
cm o步骤(c)中紫外线诱变，优选照射时间为60s。步骤(b)和步骤(C)中所用的氯化锂平板培养基为碳源0.5% 1.5%、氮源0. 1% 0. 3%、无机盐0. 5% 1.0%、琼脂I. 2% 1.8%、氯化锂I. OmoL吨―1，其余为水，PH 7. 2 7. 4 ;其中所述碳源为葡萄糖和可溶性淀粉中的一种或两种的混合；所述氮源为乙酸铵和硫酸铵中的一种或两种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐中的一种或几种的混合步骤(d)中所用的斜面培养基为碳源0. 5% I. 5%、氮源0. I % 0. 3%、无机盐0. 5% I. 0%、琼脂I. 20Z0 I. 8%、其余为水，pH 7. 2 7. 4 ;其中所述碳源为葡萄糖和可溶性淀粉中的一种或两种的混合；所述氮源为乙酸铵和硫酸铵中的一种或两种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐中的一种或几种的混合。步骤(d)中所用的种子培养基为碳源2. 0% 3. 0%、氮源2. 0% 4. 0%、微量元素0. 0001% 0. 0004%，淀粉酶3 5u/g淀粉，其余为水，pH 7. 0 7. 2 ;其中所述碳源为玉米淀粉和葡萄糖中的一种或两种的混合；所述氮源为有机含氮化合物，为花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆(也可作为生长因子)、酵母粉和酵母膏中的一种或几种的混合；所述的微量元素为氯化钴。步骤(d)中所用的发酵培养基为碳源5.0% 15. 0%、氮源2.0% 4.0%、微量元素0. 0001% 0. 0004%，淀粉酶3 5u/g淀粉，其余为水，pH 7. 0 7. 2 ;其中所述碳源为玉米淀粉、葡萄糖和麦芽糖中的一种或几种的混合；所述氮源为有机含氮化合物，为花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆(也可作为生长因子)、酵母粉中的一种或几种的混合；所述的微量元素为氯化钴。上述筛选出的阿维菌素Bla高产菌株阿维链霉菌AVE07-N2-16515在发酵生产阿维菌素Bla中的应用。具体步骤如下(I)、平板培养将阿维链霉菌AVE07-N2-16515接种于平板培养基上，培养温度为26 30°C，培养时间为6 7d ;(2)、斜面培养将步骤⑴平板培养的阿维链霉菌AVE07-N2-16515接种到斜面培养基上，培养温度为26 30°C，培养时间6 7d。(3)、种子培养将步骤(2)斜面培养的阿维链霉菌AVE07-N2-16515接种到种子培养基中，250mL培养瓶中装液量为20 50mL，培养温度为26 30°C，180 220rpm摇床转速下培养30 45h ；(4)、发酵培养将步骤(3)中的种子培养液接种到发酵培养基中，接种量为2 10% (v/v), 250mL培养瓶中装液量为35 65mL，培养温度为26 30°C，180 240rpm摇 床转速下培养8 10d。其中，所述平板培养基包含如下质量百分数的组分碳源0. 5% I. 5%、氮源
0.1% 0. 3%、无机盐0. 5% I. 0%、琼脂I. 2% I. 8%、其余为水，pH 7. 2 7. 4 ;其中所述碳源为葡萄糖和可溶性淀粉中的一种或两种的混合；所述氮源为乙酸铵和硫酸铵中的一种或两种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐中的一种或几种的混合。
所述斜面培养基包含如下质量百分数的组分碳源O. 5% I. 5%、氮源O. 1%
O.3%、无机盐O. 5% I. O %、琼脂I. 2% I. 8 %、其余为水，pH 7. 2 7. 4 ;其中所述碳源为葡萄糖和可溶性淀粉中的一种或两种的混合；所述氮源为乙酸铵和硫酸铵中的一种或两种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐中的一种或几种的混合。所述种子培养基包含如下质量百分数的组分碳源2. 0% 3. 0%、氮源2. 0% 4. 0%、微量元素O. 0001% O. 0004%，淀粉酶3 5u/g淀粉，其余为水，pH7. O 7. 2 ;其中所述碳源为玉米淀粉和葡萄糖中的一种或两种的混合；所述氮源为花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆、酵母粉和酵母膏中的一种或几种的混合；所述的微量元素为氯化钴。
所述发酵培养基包含如下质量百分数的组分碳源5. O % 15. O %、氮源2. O % 4. O %、微量元素O. 0001% O. 0004%，淀粉酶3 5u/g淀粉，其余为水，pH7. O 7. 2 ;其中所述碳源为玉米淀粉、葡萄糖和麦芽糖中的一种或几种的混合；所述氮源为花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆、酵母粉中的一种或几种的混合；所述的微量元素为氯化钴。本发明有益效果本发明采用低能氮离子注入-氯化锂复合诱变和紫外线-氯化锂复合诱变相结合，最终筛选获得一株阿维菌素Bla高产菌株阿维链霉菌AVE07-N2-16515，可较大幅度提高发酵产物中阿维菌素Bla组分并减少其他组分，且遗传稳定性好，菌株连续传代5次后效价并无明显变化。在5L发酵罐中，以葡萄糖为速效碳源，玉米淀粉为迟效碳源，发酵产阿维菌素Bla效价达到3048 μ g/mL，相比原始出发菌株提高了 23. 4%。本技术发明完全符合工业化阿维菌素生产菌株的诱变和筛选需要，并可应用于工业化发酵生产，具有重大的社会意义和经济价值。
图I :阿维链霉菌复合诱变图谱；图2 :为低能氮离子注入诱变不同能量、剂量下菌株的正负突变率，从图中可以看出，10KeV、14KeV以及18KeV下菌株的正突变率普遍低于16KeV，可以确定16KeV为菌种的最佳诱变能量，另外在诱变剂量为160X1014ionS/cm2下正突变率最高，容易筛选出效价提高幅度超过10%的菌株，所以确定诱变能量16KeV，诱变剂量160X1014ionS/cm2为本发明中所用最佳低能氮离子注入诱变条件；图3 :为紫外诱变的正负突变率，从图中可以看出，随着紫外诱变时间的延长，正突变率先上升后下降，在60s时，菌株的正突变率最高，达到18. I %，确定60s为本发明中所用紫外诱变最佳时间；图4 :实施例3发酵液中阿维菌素Bla色谱图，其中第3个峰为阿维菌素Bla色谱峰。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例I :本实施例说明将阿维链霉菌出发菌株进行诱变的方法。
以实验室保存的阿维链霉菌AVE07为出发菌株，进行诱变，具体步骤如下(a)、单孢子悬浮液制备取26 30°C恒温培养6 7d的阿维链霉菌新鲜斜面加无菌水10mL，刮洗下孢子倾于带有一定玻璃珠的250mL三角瓶内震荡摇匀20min (250rpm)，打散孢子链，三层脱脂纱布过滤，滤液用血球计数板计数，调整孢子浓度IO6个/毫升。(b)、低能氮离子注入-氯化锂复合诱变取0. ImL的步骤(a)中孢子悬液均匀涂布于无菌空平皿上，镜检无细胞重叠者进行低能氮离子注入。本实验低能氮离子注入机为多功能注入机。分别在10KeV、14KeV、16KeV、18KeV的能 量下对阿维链霉菌进行离子注入。注入剂量分别为 40 X 1014ions/cm2、80 X 1014ions/cm2、120 X 1014ions/cm2、160 X 1014ions/cm2、200X 1014ions/cm2、240X 1014ions/cm2。革巴室真空度为 10 3Pa,以 20S 脉冲式注入，间隔15s，靶室内放置不接受注入的对照样。实验结果见图2，确定诱变能量16KeV，诱变剂量160 X 1014ionS/cm2为最佳低能氮离子注入诱变条件。离子注入完毕后，取出平皿，在无菌环境下用Iml无菌水洗脱，涂布到氯化锂平板培养基上，在26 30°C下倒置培养6 7d。(c)、紫外线-氯化锂复合诱变取5mL步骤(a)中孢子悬液移入含有磁力转子的无菌空平板中，至于磁力搅拌器上。先开启20W紫外灯预热20min，再调整培养皿高度于紫外灯下30cm处，打开平皿盖，分别照射30S、45S、60S、75S、90S，诱变结束后取菌悬液涂布于氯化锂平板培养基上，于26 30°C条件下倒置避光恒温培养6 7d。实验结果见图3，确定60s为紫外诱变最佳时间，此时正突变率最高，达到18. I %。(d)、诱变菌株的筛选初筛将步骤(b)和步骤(C)诱变得到的单菌落接至斜面培养基上，在26 30°C下培养6 7d后，铲取二分之一的菌体于离心管中，用0. 5mL丙酮浸泡12 15h，然后加入0. 25mL乙酸乙酯，快速混匀，3000rpm离心lOmin，取上清液，取上清液测定各菌株浸取液中阿维菌素Bla效价，留取50%的高效价菌株上摇瓶发酵进行复筛。复筛将初筛筛选到的菌株经斜面培养后接入种子培养基中于26 30°C、180 220rmp摇床转速下扩大培养30 45h，以2 10% (v/v)的接种量接入发酵培养基，在26 30°C、180 240rpm摇床转速下培养8 IOd下摇床，取3mL发酵液于离心管中，3500rpm高速离心IOmin,弃上清液,加入甲醇至9mL,在快速混勻器上震荡30min ；3500rpm高速离心lOmin，取上清液测定发酵液中阿维菌素Bla效价。取发酵液阿维菌素Bla效价最高的菌株作为下次诱变的出发菌株，重复步骤(a) (d)，如图I所示。最后筛选出阿维菌素 Bla 产量高的目标菌株 streptomyces avermitilis AVE07-N2-16515。步骤(b)和步骤(C)中所用的氯化锂平板培养基为可溶性淀粉I. 0%，(NH4)2SO4
0.25%,NaCl 0. 05 %, MgSO4 7H20 0. 12 %, K2HPO4 3H20 0.3 %, CaCO3O. 3 %，氯化锂
1.OmoL L—1，琼脂粉I. 5%，pH 7. 2 7. 4，蒸馏水配置。步骤(a)及(d)中所用的斜面培养基为可溶性淀粉I. 0%，(NH4)2SO4O. 25%,NaCl0. 05%, MgSO4 7H20 0. 12%, K2HPO4 3H20 0. 3%, CaCO3O. 3%，琼脂粉 I. 5%, pH 7. 2 7. 4，蒸馏水配置。步骤⑷中所用的种子培养基为玉米淀粉1.5%，葡萄糖1.0%，花生饼粉1.0%，黄豆饼粉 0. 8%,酵母粉 0.5%，CoCl2 6H20 0. 0003 %，淀粉酶 4u/g 淀粉，pH 7. 0 7. 2，自来水配置。步骤(d)中所用的发酵培养基为玉米淀粉6%，葡萄糖2%，花生饼粉1.4%，黄豆饼粉I. 2%，酵母粉O. 3%, CoCl2 · 6H20 O. 0003%，淀粉酶4u/g淀粉，ρΗ7· O 7. 2，自来
水配置。实施例2 :本实施例说明突变株的传代稳定性。在以葡萄糖为速效碳源、玉米淀粉为迟效碳源的发酵培养基中，检测突变株阿维链霉菌AVE07-N2-16515的传代稳定性，菌株传代发酵试验结果如表I所示表I高产突变菌株阿维链霉菌AVE07-N2-16515遗传稳定性试验
权利要求
1.ー种阿维菌素Bla高产菌株，其分类命名为阿维链霉菌istreptomycesavermitills)AVE07_N2_16515，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号CCTCCNO M 2012094。
2.权利要求I所述的阿维菌素Bla高产菌株在发酵生产阿维菌素Bla中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的发酵生产阿维菌素Bla的方法包含如下步骤 (1)、平板培养将阿维链霉菌AVE07-N2-16515接种于平板培养基上，培养温度为26 30°C，培养时间为6 7d ； (2)、斜面培养将步骤(I)平板培养的阿维链霉菌AVE07-N2-16515接种到斜面培养基上，培养温度为26 30°C，培养时间为6 7d ； (3)、种子培养将步骤(2)斜面培养的阿维链霉菌AVE07-N2-16515接种到种子培养基中，250mL培养瓶中装液量为2(T50mL，培养温度为26 30°C，18(T220rpm摇床转速下培养3(T45h ； (4)、发酵培养将步骤(3)中的种子培养液接种到发酵培养基中，接种量为2 10%(v/v)，250mL培养瓶中装液量为35 65mL，培养温度为26 30°C，18(T240rpm摇床转速下培养8 IOcL
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述平板培养基包含如下质量百分数的组分碳源 O. 59Γ1. 5%、氮源 O. 19Π). 3%、无机盐 O. 5°/Γ . 0%、琼脂 I. 2°/Γ . 8%、其余为水，pH7.2^7. 4 ;其中所述碳源为葡萄糖和可溶性淀粉中的ー种或两种的混合；所述氮源为こ酸铵和硫酸铵中的ー种或两种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐中的ー种或几种的混合。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述斜面培养基包含如下质量百分数的组分碳源 O. 59Γ1. 5%、氮源 O. 19Π). 3%、无机盐 O. 5°/Γ . 0%、琼脂 I. 2°/Γ . 8%、其余为水，pH7.2^7. 4 ;其中所述碳源为葡萄糖和可溶性淀粉中的ー种或两种的混合；所述氮源为こ酸铵和硫酸铵中的ー种或两种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐中的ー种或几种的混合。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述种子培养基包含如下质量百分数的组分碳源2. 0% 3. 0%、氮源2. 0% 4. 0%、微量元素O. 0001% O. 0004%,淀粉酶3 5u/g淀粉，其余为水，pH 7. (Γ7. 2 ;其中所述碳源为玉米淀粉和葡萄糖中的ー种或两种的混合；所述氮源为花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆、酵母粉和酵母膏中的ー种或几种的混合；所述的微量元素为氯化钴。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述发酵培养基包含如下质量百分数的组分碳源5. 09Γ15. 0%、氮源2. 0% 4. 0%、微量元素O. ΟΟΟΡ/ΓΟ. 0004%,淀粉酶3 5u/g淀粉，其余为水，pH 7. (Γ7. 2 ;其中所述碳源为玉米淀粉、葡萄糖和麦芽糖中的ー种或几种的混合；所述氮源为花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆、酵母粉中的ー种或几种的混合；所述的微量元素为氯化钴。
全文摘要
本发明公开了一种阿维菌素B1a高产菌株，其分类命名为阿维链霉菌streptomycesavermitilisAVE07-N2-16515，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号CCTCC NOM2012094，本发明以低能氮离子注入-氯化锂(N+-LiCl)复合诱变结合紫外线-氯化锂(UV-LiCl)复合诱变，通过初筛、摇瓶发酵复筛选获阿维菌素B1a产量高的菌株作为下一轮诱变的出发菌株，最终筛选出目标菌株AVE07-N2-16515，该菌株可较大幅度提高发酵产物中阿维菌素B1a组分并减少其他组分，且遗传稳定性良好。该菌株利用葡萄糖为速效碳源，玉米淀粉为迟效碳源，在5L发酵罐中发酵产阿维菌素B1a效价可达3048μg/mL，相对于原始出发菌株AVE07提高了23.4%，可应用于工业生产并大幅度提高发酵单位，具有重大的经济应用价值。
文档编号C12N1/20GK102634471SQ201210113850
公开日2012年8月15日 申请日期2012年4月18日 优先权日2012年4月18日
发明者崔莉, 虞龙, 陈晓双, 黄思思, 龚文静 申请人:南京工业大学