专利名称：一种快速分离纯化小球藻的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及ー种快速分离纯化小球藻的方法。
背景技术：
众所周知，自然生态系统中的微生物往往是多个种群组成的复杂共生体系，同时，实验室内小球藻培养过程中也因染菌成为菌藻共生体系。藻种分离和纯化是指从天然水域的混杂生物群中，用一定方法把所需微藻个体从菌藻共生体系中分离出来，而获得纯种培养，即在排除包括细菌在内的一切生物的条件下进行的培养，这是进行科学研究不可缺少的技木。同样，利用小球藻进行生理生态、生物工程、生命科学、医学药物以及环境污染治理等研究，小球藻的分离纯化是必须首先解决的问题。目前，具体用于微藻分离纯化的方法有样品系列稀释分离法、微吸管分离法、水滴分离法和固体培养基分离法。具体介绍如下。(I)样品系列稀释分离法取一定量混杂有其他生物、含有目标微藻的水样，用培养液稀释到每一滴含有ー个左右的生物细胞，分别加入到20只装有1/4容量培养液的试管，摇匀培养，镜检检查。此法操作简便，设备简単，适合于各种藻的分离，特别是从天然水域中初歩分离各种藻，但该法盲目性强，要真正达到分离纯化的时间长。(2)微吸管分离法先制作口径极细的玻璃微细管，取稀释适度的藻液水样置浅凹载玻片上，在显微镜下仔细地用微吸管虹吸吸出要分离的藻体，放入另ー浅凹载片上，镜检是否达到纯分离的目的，然后移入经灭菌的培养液中培养，镜检检查。该分离法的特点是易找到特定的种类，所用的设备也较简単。但操作过程繁琐，对实验操作要求很高，往往吸取ー个单细胞需要几次至十几次才能成功。适于分离个体较大或丝状的藻类，如螺旋藻、骨条藻等，较小的藻类用此方法很困难。分离时间长，操作过程中还有细菌污染的可能。(3)水滴分离法用微吸管吸取经稀释适度的藻液，间隔一定距离滴到消毒过的载玻片上，显微镜下若ー个水滴中只有ー个藻细胞(无其他生物混杂)，即用移液管吸取培养液将水滴冲入装有灭菌过的培养液试管或小三角瓶中，摇匀培养。此法简便易行，适宜于分离己在培养液中占优势藻类，比如分离受少量生物污染的微藻。但操作时同样要求细致、认真，分离时间长，操作过程中还有细菌污染的可能。(4)固体培养基分离法(喷雾法、涂布法、划线法)
固体培养基分离法有喷雾法、涂布法和划线法等。该类方法的培养基制备和分离方法，与菌类的平板分离法基本相同，只是培养基配方不同。其中，稀释平板分离法依次取5个
I.5ml灭菌后离心管，每个加入O. 9ml灭菌后培养液，吸取O. Iml待分离的藻液加入第一个离心管中，摇均后，再吸取O. Iml藻液倒入第一个平板中，用涂布棒涂抹均匀后，正置放好，再从第一个离心管中吸取O. Iml藻液转入第二个离心管中，依此操作继续进行。涂抹好的平板放置一段时间后放入光照培养箱中倒置培养；平板喷雾法将稀释藻液装入消毒过的小型喷雾器中，把藻液均匀喷射在培养基平面上，形成薄层水珠，光照下培养；平板划线法将接种环升入藻液中，然后在平板上划线，先平行划线后垂直划线，再在光照培养箱中继续培养。以上方法一般在培养2 3周后，平板上会长出互相隔离的、緑色或者黄色的凸圆形藻类菌落，通过显微镜检查，寻找需要的纯藻群落，然后用消毒过的接种环移植到另一平板培养基培养，也可直接移植到装有经过灭菌的培养液试管或小三角烧瓶中，进行培养。固体培养基分离法优点是操作简单，适用于绝大部分藻种的分离，且效果最好，很容易得到単一的纯种藻类菌落。缺点是工作量十分大，且培养的时间太长，平均广2个月才有可能得到纯种藻类。中途易受污染，特别是存在霉菌生长时，则影响纯化分离。适合于分离污染杂菌的微藻，特别是緑藻，但不适合分离喜欢群体生活的藻类细胞。
综上所述，每种方法各有优势和适用范围。当进行小球藻分离纯化时由于小球藻个体小，微吸管分离法操作难度很大，并存在染菌的可能；样品系列稀释分离法由于目的性不强，分离过程漫长，且不一定保证能分离到所需的单种；水滴分离法操作简单，对于只是受菌污染的小球藻分离较为适用，但分离过程漫长，并存在细菌污染的可能。可见，以上小球藻分离纯化的方法要么是工作量十分大，培养时间漫长，中途易受污染；要么是操作困难，难以实现。平板固体分离法虽操作简单，较易达到分离单种的目的，适用于小球藻的分离，但由于所用的培养基一般为无机物培养基，小球藻生长缓慢，培养时间漫长，工作量大，当感染有霉菌时，分离纯化更困难。可见，目前用于分离纯化小球藻的培养基限制了平板固体分离法的应用。由于小球藻具有异养和混养特性，当培养基中存在葡萄糖、こ酸盐、蛋白胨等有机物时，小球藻可实现快速增长。因此，通过在固体培养基中加入有机物，则可能大大的促进小球藻的生长速率，从而较好地发挥固体培养基分离法的长处，实现小球藻快速分离和纯化的目的。如何针对小球藻生长特性，通过固体培养基的创新，发明适于快速、简易分离纯化小球藻的方法十分必要。
发明内容
本发明的目的在于提供ー种快速分离纯化小球藻的方法。为实现上述目的，本发明者确认分离纯化小球藻的适宜方法为平板分离，并进ー步提供了ー种快速、简易分离纯化小球藻的方法，能够在较短时间内、较小工作量下得到较高浓度小球藻。本发明提出的ー种快速分离纯化小球藻的方法，具体步骤如下
(I)制作固体培养基
固体培养基配方
I液碳源Glucose.H20 5000^30000 mg,无机氮源尿素 372 2100mg、KNO31250^5000 mg 或酵母粉 300(Tll000mg 中任ー种，无机盐KH2PO4 100 2000 mg, MgSO4JH2O200 2000 mg, Na2.EDTA 50 500 mg, H3BO3 11. 4 114. 2 mg, CaCl2. 2H20 11. Till mg,FeSO4JH2O 5·0 49·8 mg, ZnSO4JH2O 8· 8 88. 2 mg,微量元素MnCl2 ·4Η20 I. 4 14. 2 mg,MoO3 O. Tl. I mg, CuSO4.5H20 I. 6 15. 7 mg, Co (NO3)2.6H20 0. 5 4. 9 mg，水500mL，溶液pH值为 6. Γ9. 0 ；
II液500ml水中加入16 40 g琼脂，混匀；
固体培养基的制作方法为分别将I液和II液经121°C、20 min高压灭菌，在生物超净工作台中紫外灭菌>20 min ;当灭菌后的I液和II液冷却至45飞(TC吋，将I液和II液混匀，倾入无菌平皿，凝固后存放于冰箱内备用；(2)藻种的分离纯化
①在水体中采集可能含有目标藻种的水样，并在显微镜下观察藻类及数目。当水样的颜色为绿色时，即可判断微藻为优势种群，可直接进行接种分离，特别是分离受杂菌污染的微藻；当微藻数目不足时进行藻类富集和藻数目扩大培养。②藻类富集；取40 mL水样,8000 r/min离心10 min,弃去上清液。补加水样至40mL离心，重复操作几次，后用SE培养液悬浮并定容至5 mL，混匀，经筛絹过滤除去大型浮游生物，从而实现目标藻类的富集。③接种藻数目扩大培养用三角烧瓶作培养容器，加入SE培养液，SE培养液的加入量为三角烧瓶体积的1/4 1/2，以20% (V/V)以上接种量将富集后的藻类接种到三角烧瓶中，于光照強度2000-4000 lux、光暗比=12:12、温度25_28°C的光照培养箱中培养广2周，得到较高浓度的藻液，藻液顔色为绿色。每天应至少摇动一次藻液；
④接种取5-10个I. 5ml离心管，依次编号后分别加入O. 9mL SE培养液，首先取O. ImL经扩大培养后的藻液(摇均)加入第一个离心管中，摇匀后从第一管中取O. ImL藻液加入第ニ个离心管中混匀。随后，依次按10倍的稀释梯度进行同样操作，以确保藻液稀释至目标微藻浓度为1(Γ100个/mL ;从最后3个梯度的离心管中取O. ImL藻液涂布接种到步骤(I)所得的固体培养基上。⑤培养接种后的平板倒置于光照培养箱，培养时间为4 5 d，平板上会长出绿色或者黄色的藻类菌落，群落会呈现凸圆形。8 10 d后，藻落直径则可长到4.8 — 5. 2_，可用接种环挑取单个藻类斑点在新平板上进行划线纯化，3^4d后可从划线平板通过接种环转移藻落至三角烧瓶培养基中培养。平板培养过程中，应注意观察细菌及霉菌等菌落斑点与藻类斑点的生长状況，如果前者生长过快，将覆盖藻落，则需及时挑取藻类；反之，则可让藻落斑点增长后再挑取。⑥纯种检验平板培养过程中，可在显微镜下定期观察藻落生长情況。挑取的藻落转移至三角烧瓶培养基中培养，一天后可吸取样品于显微镜下观察，如发现是同一藻种，则基本分离成功。为确保菌藻分离成功，可将三角烧瓶中的藻液涂布到装有适合于细菌生长的通用固体培养基的平板上，在28 37°C的生化培养箱中培养2Γ48 h，如无细菌生长则表明菌藻分离成功。以上所有的实验用品都经过高温灭菌(121で、20 min)和紫外灭菌(>20min)后冷
却待用。本发明中，光照培养箱的光强2000-4000 lux、光暗比为12:12、温度控制在25-28 °C。与一般的固体培养基分离小球藻法相比，本发明的有益效果是
(I)解决了制作分离纯化小球藻固体培养基时，加入有机物不易凝固的难题。(2)解决了一般无机固体培养基分离纯化小球藻不理想的问题，小球藻非常适合在本发明的固体培养基上快速生长，通过试验，可在短时间内形成直径大的单克隆藻落，即本方法可在霉菌及其他细菌未覆盖小球藻藻落之前就可形成满足分离要求的小球藻藻落，因此，本方法进行菌藻分离效果好，且分离纯化小球藻周期短，非常适于实验室内细菌污染小球藻的快速分离。亦可与物理、化学诱变小球藻基因工作結合，实现快速获得满意的改良藻种。
(3)本发明可实现小球藻藻落的短期大生物量生长，进行划线生长时，一般2 4天即可形成大的藻落，非常有利于后续溶液快速培养，一般在10天左右即可得到较高浓度的纯种小球藻藻液。而其他固体培养基平均广2个月才有可能得到纯种藻类，分离周期长，还容易受霉菌等其他因素影响。(4)本发明的优点是分离纯化小球藻操作简易，分离纯化小球藻效果非常好，克服了之前一般固体培养基分离小球藻法工作量十分大的缺点。比毛细管提纯等方法，操作人员更容易掌握。(5)本发明亦可适用于生产小球藻时藻种纯化需要，可极大缩短生产周期和实现预防细菌污染问题。(6)本发明还可适用于斜生栅藻及其他可异养微藻的分离纯化，适用面广。
图I为实施例I中利用本发明的固体培养基分离纯化小球藻效果图。其中(a)为污染了细菌的C. pyrenoidosa藻液分离结果；(b)为污染了细菌的C. sorokiniana藻液分离結果。图2为实施例2中正交试验结果对比图。其中(&)、(13)、(。)、((1)、(6)、(0、(8)和(h)分别为试验号I号、4号、5号、7号、8号、10号、11号和12号的试验结果图。图3为实施例3中不同固体培养基培养不同小球藻效果对比图。其中(a)、(b)和(c)分别为SE固体培养基、BD固体培养基和KS固体培养基分离纯化C. sorokiniana结果图；(d)、(e)和(f)分别为SE固体培养基、BD固体培养基和KS固体培养基分离纯化Cpyrenoidosa结果图；(g)、(h)和(i )分别为SE固体培养基、BD固体培养基和KS固体培养基分离纯化C. vulgaris结果图；(k)、(I)和(m)分别为SE固体培养基、BD固体培养基和KS固体培养基分离纯化斜生栅藻结果图。图4为实施例3中不同小球藻在不同固体培养基上划线生长情况图。其中(a)为C. pro to thecides分别在SE固体培养基、BG固体培养基和KS固体培养基上划线生长情况；(b)为C. pyrenoidosa分别在SE固体培养基、BG固体培养基和KS固体培养基上划线生长情况；(c)为C. sorokiniana分别在SE固体培养基、BG固体培养基和KS固体培养基上划线生长情况；(c)为斜生栅藻在KS固体培养基上划线生长情況。
具体实施例方式本发明涉及分离纯化小球藻的固体培养基制作方法，该方法包括固体培养基的配方及制作方法。在本发明所述的培养基中，培养基的各组分可在一定范围内变化而不会对培养基分离纯化小球藻结果有很大的影响。例如，作为无机氮源可以为KNO3、尿素或酵母粉，其中KNO3的范围为O. 5 3g/L，尿素的范围为O. Γ2. I g/L，作为有机氮源的酵母粉可在3 Ilg/L之间；作为碳源的葡萄糖可在5 30g/L之间；作为磷源的KH2PO4可在O. l 2g/L之间。因此，这些组分的用量不应受实施例的限制。如本领域技术人员所熟知的，培养基中还应加入少量无机盐，例如硫酸镁、碳酸·15、铁离子等以及少量微量元素如Mn、Zn、B、M、Cu、Co等。在 本发明中较佳的微量元素组分宜选自MnCl2、Mo03、CuSO4 . 5H20、Co (NO3) 2. 6H20。
所述培养基基本上由以下组分组成Glucose.H2O 5000^30000 mg,尿素/KNO31250 5000 mg, KH2PO4 100^2000 mg, MgSO4. 7H20 200 2000 mg, Na2. EDTA 50 500 mg,H3BO3 11. 4 114. 2 mg, CaCL2. 2H20 11. Till mg, FeSO4. 7H20 5· 0 49· 8 mg, ZnSO4. 7Η208.8 88. 2 mg, MnCl2. 4Η20 I. 4 14. 2 mg, MoO3 O. Tl. I mg, CuSO4. 5Η20 I. 6 15. 7 mg,Co (NO3) 2. 6Η20 O. 5 4.9 mg，水 500mL，溶液 pH 值 6· I 9· O ; II 液500ml 水中加入 16 40 g琼脂，混匀。在一个更佳的方案中，所述培养基的组成为500ml蒸馏水中分别加入以下物质，碳源Glucose.H2O 1000 mg。氮源KNO3 1250 mg。无机盐=KH2PO4 1000 mg,MgSO4JH2O 1000mg，Na2-EDTA 100 mg，H3BO3 114.2 mg，CaCl2.2H20 111 mg，FeSO4.7Η20 49. 8 mg，ZnSO4.7H2088. 2 mg。微量元素MnCl2.4H20 14. 2 mg，Mo03 7. I mg，CuSO4.5H20 15. 7 mg，Co (NO3) 2.6H20
4.9 mg。pH值调为6. 5 ； II液将琼脂加入500ml琼脂1%水中，混匀。分别将I液和II液经121°C、20 min高压灭菌，在生物超净工作台中紫外灭菌>20 min。当培养基溶液冷却至45 50°C，将I液和II液混匀，倾入无菌平皿，凝固后存放于冰箱内备用。下面将通过实施例进ー步阐明本发明。然而，本领域技术人员应当明白，本发明并不局限于这些实施例中的具体数值和手段。实施例I :
(I)分离小球藻有机固体培养基制作
配制I液配制固体培养基。营养成分500ml蒸懼水中分别加入以下物质，碳源Glucose. H2O 1000 mg。氮源KNO3 1250 mg。无机盐ΚΗ2Ρ04 1 000 mg，MgSO4. 7H20 1000mg，Na2—EDTA 100 mg，H3BO3 114.2 mg，CaCl2.2H20 111 mg，FeSO4.7H20 49. 8 mg，ZnSO4.7H2088. 2 mg。微量元素MnCl2.4H20 14. 2 mg，Mo03 7. I mg，CuSO4.5H20 15. 7 mg，Co (NO3) 2.6H20
4.9 mg。pH值调为6. 5 ； II液将琼脂加入500ml琼脂1%水中，混匀。固体培养基的制作方法为分别将I液和II液经121°C、20 min高压灭菌，在生物超净工作台中紫外灭菌>20 min ;当灭菌后的I液和II液冷却至45飞(TC吋，将I液和II液混匀，倾入无菌平皿，紫外灯下冷却凝固后备用。(2)污染细菌的藻种分离纯化
本试验用于分离纯化的小球藻均受到霉菌和杆菌等细菌的污染，采用本发明固体培养基及分离方法进行菌藻分离。操作如下①接种取5-7个经过灭菌的I. 5ml离心管，每个加入O. 9ml SE培养液，将待分离的污染细菌的藻液摇均后，吸取O. Iml藻液加入第一个离心管中，摇均后，再吸取O. Iml经过扩大培养后的藻液加入第二个离心管中，即将经过扩大培养后的藻液依次稀释成10 1UO 2、10 3、10 4、10 5、10 6和10 7倍，取后3个梯度涂布到已凝固的固体培养基上；②培养接种后的平板倒置于光照培养箱(光强2000-4000lux、光暗比=12:12、温度25-28で)，培养时间为4 5 d，平板上会长出绿色或者黄色的藻类菌落，群落会呈现凸圆形。8 10 d后，藻落直径则可长到3. (Γ5. 2mm。③纯种检验平板培 养过程中，可在显微镜下定期观察藻落生长情況。挑取②的藻落转移至三角烧瓶培养基中培养7天，重复以上操作步骤①接种和②培养，得到如图I所示的单藻落，经显微镜镜检和细菌培养观察，菌藻分离成功。可见，本发明方法可实现污染细菌的小球藻快速分离纯化。实施例2 :分离小球藻的有机固体培养基优化制作
如表I设计正交实验，控制各因素对应培养基配方中药品种类和用量，其中Glucose.H2O lOOOOmg/L,其他营养成分为MgSO4.7H201000mg/L, H3BO3 114.2，CaCl2.2H20lllmg/L, FeSO4. 7H20 49. 8mg/L, ZnSO4. 7H20 88. 2mg/L, MnCl2. 4H20 14. 2mg/L, MoO37. lmg/L, CuSO4JH2O 15. 7mg/L, Co (NO3)2.6H20 4. 9mg/L。如表 I 和表 2 配制不同试验号的I液，并调节PH 6.5 ;II液按表I和表2将琼脂加入500ml琼脂1%水中，混匀配制不同试验号的II液。固体培养基的制作方法为分别将I液和II液经121°C、20 min高压灭菌，在生物超净工作台中紫外灭菌>20 min ;当灭菌后的I液和II液冷却至45飞(TC时，将对应试验号的I液和II液混匀，倾入无菌平皿，紫外灯下冷却凝固后备用。
表I正交试验因素及其水平
权利要求
1.ー种快速分离纯化小球藻的方法，其特征在于具体步骤如下 (1)制作固体培养基 固体培养基配方 I 液碳源Glucose.H20 5000^30000 mg,无机氮源尿素 372 2100mg、KNO31250^5000 mg 或酵母粉 300(Tll000mg 中任ー种，无机盐KH2PO4 100 2000 mg, MgSO4JH2O200 2000 mg, Na2.EDTA 50 500 mg, H3BO3 11. 4 114. 2 mg, CaCl2. 2H20 11. Till mg,FeSO4JH2O 5·0 49·8 mg, ZnSO4JH2O 8· 8 88. 2 mg,微量元素MnCl2 ·4Η20 I. 4 14. 2 mg,MoO3 O. Tl. I mg, CuSO4.5H20 I. 6 15. 7 mg, Co (NO3)2.6H20 0. 5 4. 9 mg，水500mL，溶液pH值为 6. Γ9. 0 ； II液500ml水中加入16 40 g琼脂，混匀； 固体培养基的制作方法为分别将I液和II液经121°C、20 min高压灭菌，在生物超净工作台中紫外灭菌>20 min ;当灭菌后的I液和II液冷却至45飞(TC吋，将I液和II液混匀，倾入无菌平皿，凝固后存放于冰箱内备用； (2)藻种的分离纯化 ①在水体中采集可能含有目标藻种的水样，并在显微镜下观察藻类及数目；当水样的颜色为绿色时，即可判断微藻为优势种群，直接分离，当微藻数目不足时进行藻类富集和藻数目扩大培养； ②藻类富集；取40mL水样,8000 r/min离心10 min,弃去上清液；补加水样至40 mL离心，重复操作几次，后用SE培养液悬浮并定容至5 mL，混匀，经筛絹过滤除去大型浮游生物，从而实现目标藻类的富集； ③接种藻数目扩大培养用三角烧瓶作培养容器，加入SE培养液，SE培养液的加入量为三角烧瓶体积的1/4 1/2，以20% (V/V)以上接种量将富集后的藻类接种到三角烧瓶中，于光照強度2000-4000 lux、光暗比=12:12、温度25_28°C的光照培养箱中培养f 2周，得到较高浓度的藻液，藻液顔色为绿色；每天应至少摇动一次藻液； ④接种取5-10个I.5ml离心管，依次编号后分别加入O. 9mL SE培养液，首先取O. ImL经扩大培养后的藻液摇均加入第一个离心管中，摇匀后从第一管中取O. ImL藻液加入第二个离心管中混匀；随后，依次按10倍的稀释梯度进行同样操作，以确保藻液稀释至目标微藻浓度为1(Γ100个/mL ;从最后3个梯度的离心管中取O. ImL藻液涂布接种到步骤⑴所得的固体培养基上； ⑤培养接种后的平板倒置于光照培养箱，培养时间为4 5d，平板上会长出绿色或者黄色的藻类菌落，群落会呈现凸圆形；8 10 d后，藻落直径则长到4. 8 — 5. 2mm,用接种环挑取单个藻类斑点在新平板上进行划线纯化，3^4d可从划线平板通过接种环转移藻落至三角烧瓶培养基中培养； ⑥纯种检验平板培养过程中，在显微镜下定期观察藻落生长情况；挑取的藻落转移至三角烧瓶培养基中培养，一天后可吸取样品于显微镜下观察，如发现是同一藻种，则基本分离成功；将三角烧瓶中的藻液涂布到装有适合于细菌生长的通用固体培养基的平板上，在28 37°C的生化培养箱中培养2Γ48 h，如无细菌生长则表明菌藻分离成功。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于光照培养箱的光强2000-4000lux、光暗比为12:12、温度控制在25-28 0C ο
全文摘要
本发明提供了一种固体培养基分离小球藻的方法，包括培养基配方的配制和具体操作方法，属生物技术领域。利用此培养基，在模拟自然光照下分离纯化小球藻，短时间内得到大量纯化的小球藻。其中，涂布分离时间5-7天，划线分离所用时间为2-4天。本发明的优点在于所用时间短、操作简单、分离效果好、所得藻浓度高，适用于从自然水体中或受菌污染的小球藻分离纯化。
文档编号C12N1/12GK102643751SQ20121012273
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月25日 优先权日2012年4月25日
发明者周雪飞, 孙振, 张亚雷, 苏鸿洋, 钟云娜, 闫刚 申请人:同济大学