专利名称：一种通过cd226基因检测胃癌易感性的试剂盒及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种疾病易感性检测用的试剂盒，具体地说是一种通过⑶226基因检测胃癌易感性的试剂盒及其用途，其通过检测丝裂原活化蛋白激酶激酶4(CD226)的单核苷酸多态性(SNP)位点来预测胃癌的易感性，属于医疗研究技术领域。
背景技术：
胃癌发病率居消化道肿瘤的首位，列全部恶性肿瘤的第三位。我国每年死于胃癌者约为16万人。癌症的发生是一个多因素、多阶段、多基因变异的过程。肿瘤细胞和机体免疫系统的相互作用一直贯穿于整个过程中。作为调节T细胞和NK细胞功能的关键分子，CD226参与了对机体免疫系统对肿瘤的调控。大量的研究表明，肿瘤免疫调控相关基因的单核苷酸多态可以通过改变这些基因的表达水平的方式，影响这些基因在肿瘤发生、发展中的作用。SNP(Single nucleotide polymorphism),即单核苷酸多态性,是人类基因组作图的第三代遗传标记，主要是指一类基于单碱基变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基转换、颠换，以及单碱基的插入/缺失等。它是基因组最广泛存在的一类多态性标记，已成为研究基因组多态性和识别、定位疾病相关的一种工具。1996年成功研制了 SNP检测的实时荧光定量PCR技术，实现了 PCR从定性到定量的飞跃，还实现了判断结果的自动性。可利用荧光定量PCR技术研发检测疾病易感性的试剂盒。⑶226是由Shibuya等人于1996克隆成功的，并在2000年第七届人类白细胞分化抗原协作组大会上获得了⑶226的编号。人⑶226基因定位于染色体18q22_23上，成熟的蛋白由318个氨基酸组成。该分子为一个67kD大小的I型跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族成员，胞膜外区由232个氨基酸组成，含有2个V样结构域；胞浆区有61个氨基酸，胞浆区尾部含有一段EIYVNY基序，可作为非受体型蛋白酪氨酸激酶的底物，并可以和蛋白酪氨酸激酶2氨基端的SH2结构域结合。另外，在CD226胞浆区还存在着酪氨酸激酶II和PKC作用的底物S/T结构。⑶226主要表达于活化的T细胞、NK细胞、巨核/血小板谱系以及活化的血管内皮细胞。结合胞浆的上述结构和基序，提示CD226分子可能参与T细胞、NK和血小板活化的信号转导过程。将⑶226特异性单抗Leo-AlmAb或其F(ab’)2片段加入MCL或T细胞培养体系中能抑制T细胞向细胞毒T细胞分化，且只能在MLC初期发挥作用。在杀伤阶段，针对CD226另一功能表位的特异性单抗DXllmAb能在杀伤相抑制CTL对多种肿瘤细胞的杀伤。此外，共聚焦显微镜观察发现CD226集中分布与T细胞与APC或靶细胞的接触面，目前所发现的能与CD226发生相互作用的分子都是与细胞骨架结构及免疫突触形成有关的分子，这些都提示⑶226参与了 T细胞免疫突触的形成。而且研究还发现，⑶226是一种NK细胞活化性膜受体，主要表达于活化的NK细胞。在重导向杀伤系统中，加入LeoAI-mAb,能明显提高NK细胞对靶细胞的杀伤率。rs57613010是位于第18号染色体⑶226基因启动子区域的一个T > G多态。其在世界人群的频率分布，T占0.62，G占0.38左右。中国人群的分布T占0. 45，G占0. 25左右。分子生物学研究表明，T > G的替代可增加CD226基因启动子与核蛋白的结合，增加⑶226基因的表达。通过大规模人群的胃 癌病例对照研究，⑶226基因启动子区域的T > G多态与胃癌发生相关，并且呈基因剂量-反应关系。即使在调整年龄、性别、吸烟、肿瘤家族史等多种混杂因素后，这种相关性仍然存在。发明人的研究还显示rs57613010与散发性肠癌及鼻咽癌的发生相关，均表现为rs57613010基因型为G时肿瘤发生率降低。这个SNP的多态可用于评估个体胃癌的易感性。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述不足，提供一种通过⑶226基因检测胃癌易感性的试剂盒及其用途，其通过检测丝裂原活化蛋白激酶激酶4(CD226)的单核苷酸多态性(SNP)位点来预测胃癌的易感性。按照本发明提供的技术方案一种通过⑶226基因检测胃癌易感性的试剂盒，包括盒体和装于盒体内的物质，其特征在于所述盒体内的物质包括检测CD226基因上的rs57613010号SNP位点的特异性引物及特异性荧光探针、Taq DNA聚合酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液和去离子水；所述特异性引物中的正义引物和反义引物的序列为正义引物5，-AACTAGTATCTAAGGTAGACCTTGGGTAGTG-3，，反义引物5’-CCTTCTCTCGCAGACCAAAGAC-3’ ；所述特异性荧光探针包括野生型探针和突变性探针，它们的序列为野生型探针5，-CCATGCATGAGTACATA-3，，突变型探针5，-CCATGCATCAGTACATA-3，。作为本发明的进一步改进，所述盒体中各物质的含量为浓度为IOiiM的特异性引物共0. 45 iil，其中正义引物和反义引物各0. 225 u I ;浓度为5 ii M的特异性荧光探针共0. 2iU，其中野生型探针和突变型探针各0. Iiil ;浓度为5单位/iil的Taq DNA聚合酶0. 02 ill ;浓度为20mM的dNTP混合液0. I ;浓度为25mM的MgCl2溶液0. 5 yl ;5X荧光定量PCR反应缓冲液2 u I ;去离子水4. 73 ill。作为本发明的进一步改进，所述特异性引物中，正义引物的Tm值为60°C，反义引物的Tm值为58°C ;所述特异性荧光探针中，野生型探针的Tm值为66°C，突变型探针的Tm值为67V。作为本发明的进一步改进，所述试剂盒的保存温度为-20°C。一种通过⑶226基因检测胃癌易感性的试剂盒的用途，其物征在于所述试剂盒用于检测DNA的CD226基因上的rs57613010号SNP位点的基因型。本发明与现有技术相比，优点在于本发明的试剂盒用于检测DNA的CD226基因上的rs57613010号SNP位点的基因型，试剂盒盒体中的特异性引物是针对⑶226基因上的rs57613010号SNP位点而设计，能特异性扩增出包含针对CD226基因上的rs57613010号SNP位点的DNA引物；试剂盒盒体中的特异性荧光探针是针对⑶226基因上的rs57613010号SNP位点而设计，能特异性扩增出包含针对⑶226基因上的rs57613010号SNP位点的DNA探针；本发明既适用于检测个体胃癌的易感性，又适用于对乳腺癌、前列腺癌及卵巢癌的预后检测，更可广泛应用于医疗研究。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明本发明所述的通过CD226基因检测胃癌易感性的试剂盒，包括盒体和装于盒体内的物质，所述物质包括检测CD226基因上的rs57613010号SNP位点的特异性引物及特异性荧光探针、Taq DNA聚合酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液和去离子水。所述试剂盒的保存温度为_20°C。所述特异性引物中的正义引物和反义引物的序列为正义引物5’-AACTAGTATCTAAGGTAGACCTTGGGTAGTG-3’，反义引物5’-CCTTCTCTCGCAGACCAAAGAC-3’(序列表SEQ ID NO :2所示)；所述特异性引物是针对⑶226基因上的rs57613010号SNP位点而设计，能特异性扩增出包含针对⑶226基因上的rs57613010号SNP位点的DNA引物；其中正义引物的Tm值为60°C，反义引物的Tm值为58。。。所述特异性荧光探针包括野生型探针和突变性探针，它们的序列为野生型探针5’ -CCATGCATGAGTACATA-3’ (序列表SEQ ID NO 3所示)，突变型探针5’-CCATGCATCAGTACATA-3’(序列表SEQ ID NO :4所示)；所述特异性荧光探针是针对⑶226基因上的rs57613010号SNP位点而设计，能特异性扩增出包含针对⑶226基因上的rs57613010号SNP位点的DNA探针；其中野生型探针的Tm值为66°C，突变型探针的Tm值为 67V。所述Taq DNA聚合酶、dNTP (脱氧核糖核苷三磷酸)混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液和去离子水，均采用外购的常规标注产品，本发明实施例中，上述药品及试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司。本发明中，所述盒体(供一人份使用)中各物质的含量如下浓度为IOyM的特异性引物共0. 45 iil，其中正义引物和反义引物各0. 225 u I ;浓度为5 ii M的特异性荧光探针共0. 2iU，其中野生型探针和突变型探针各0. Iiil ;浓度为5单位/iil的Taq DNA聚合酶0. 02 ill ;浓度为20mM的dNTP混合液0. I ;浓度为25mM的MgCl2溶液0. 5 yl ;5X荧光定量PCR反应缓冲液2 u I ;去离子水4. 73 ill。本发明中所述的特异性引物是针对⑶226基因上的rs57613010号SNP位点而设计，能特异性扩增出包含针对⑶226基因上的rs57613010号SNP位点的DNA引物；所述特异性引物的设计与合成均采用常规的技术，可以理解的是，本发明的保护范围并不限于序列表SEQ ID NO :1和2所示的引物。对于本领域的普通技术人员来说，利用本发明所给予的技术启示设计出来的所有可用于荧光定量PCR检测⑶226基因上的rs57613010号SNP位点的引物均在本发明范围内。本发明所述的特异性荧光探针是针对⑶226基因上的rs57613010号SNP位点而设计，能特异性扩增出包含针对⑶226基因上的rs57613010号SNP位点的DNA探针。所述特异性荧光探针的设计与合成均采用常规的技术，可以理解的是，本发明的保护范围并不限于序列表SEQ ID NO :3和4所示的荧光探针。对于本领域的普通技术人员来说，利用本发明所给予的技术启示设计出来的所有可用于荧光定量PCR检测CD226基因上的rs57613010号SNP位点的荧光探针均在本发明范围内。试剂盒使用说明步骤I :DNA模板的提取用硅胶吸附法提取血液标本的基因组DNA ；步骤2 荧光定量PCR反应荧光定量PCR反应体系总体积为10 ill，包括浓度为20ng/ U I的DNA模板2 yl、浓度为IOuM的特异性引物共0. 45 iil，其中正义引物和反义引物各0. 225 u I ;浓度为5 u M的特异性荧光探针共0. 2 u I，其中野生型探针和突变型探针各0. I ;浓度为5单位
/ 的Taq DNA聚合酶0. 02 ;浓度为20mM的dNTP混合液0. I ;浓度为25mM的MgCl2溶液0. 5 ill ;5X荧光定量PCR反应缓冲液2 u I ;去离子水4. 73 ill。在ABI 7900HT型荧光定量PCR仪上进行反应，反应条件为50°C下2min，95°C下lOmin，再进行40 55个PCR循环(92°C下15s，60°C下Imin)，反应结束后在ABI 7900HT型荧光定量PCR仪读取荧光量。步骤3 :基因型分析及确定基因型米用ABI 7900HT 型突光定量 PCR 仪自带软件 SDS (Sequence DetectionSystems)V2. 3判读基因型，自动分析结果。被检测DNA的⑶226基因上的rs57613010号SNP位点携带有T时，为胃癌易感型。本发明可以指导人们主动预防胃癌，先对被检测者进行服务前咨询，由被检测者签署知情同意书，填写生活饮食习惯问卷表。常规方法抽取被检测者EDTA抗凝血5ml。用硅胶吸附法提取血液标本的基因组DNA。再使用本发明提供的试剂盒，对被检测者DNA的⑶226基因上的rs57613010号SNP位点进行荧光定量PCR检测，确定该位点的基因型。最后通过对被检测者基因型的分析，出具基因分型检测报告和对被检测者个体化健康指导报告。基因分型检测报告详细说明了被检测者胃癌易感程度的高低以及患病概率大小。个体化健康指导报告以被检测者的基因分型检测结果为基础，结合其生活饮食习惯问卷调查结果，评估被检测这胃癌遗传易感的相对风险。同时制定出针对被检测者的个性化健康行动方案，包括在饮食习惯、生活方式生活的改进建议等，并为被检测者普及预防胃癌的健康知识。序列表〈110〉无锡市第二人民医院〈120〉一种通过⑶226基因检测胃癌易感性的试剂盒及其用途<160>4<210>SEQ ID NO 1〈211 >31<212>DNA〈213〉人工序列〈221〉正义引物〈400〉Iaactagtatc taaggtagac cttgggtagt g 31<210>SEQ ID NO 2
<211>22<212>DNA〈213〉人工序列〈221〉正义引物
<400>2ccttctctcg cagaccaaag ac22<210>SEQ ID NO 3〈211〉17<212>DNA〈213〉人工序列〈221〉野生型探针<400>3ccatgcatga gtacata17<210>SEQ ID NO 4〈211〉17<212>DNA〈213〉人工序列〈221〉突变型探针<400>4ccatgcatca gtacata 1权利要求
1.一种通过CD226基因检测胃癌易感性的试剂盒，包括盒体和装于盒体内的物质，其特征在于所述盒体内的物质包括检测⑶226基因上的rs57613010号SNP位点的特异性引物及特异性荧光探针、Taq DNA聚合酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液和去离子水； 所述特异性引物中的正义引物和反义弓I物的序列为 正义引物5’ - AACTAGTATCTAAGGTAGACCTTGGGTAGTG -3’， 反义引物5’ - CCTTCTCTCGCAGACCAAAGAC -3’ ； 所述特异性荧光探针包括野生型探针和突变性探针，它们的序列为 野生型探针5’ - CCATGCATGAGTACATA -3’， 突变型探针5’ - CCATGCATCAGTACATA -3’。
2.如权利要求I所述的通过CD226基因检测胃癌易感性的试剂盒，其特征在于所述盒体中各物质的含量为浓度为10 μ M的特异性引物共O. 45 μ 1，其中正义引物和反义引物各O. 225 μ I ;浓度为5μ M的特异性荧光探针共O. 2 μ 1，其中野生型探针和突变型探针各O. I μ I ;浓度为5单位/ μ I的Taq DNA聚合酶O. 02 μ I ;浓度为20mM的dNTP混合液O.1μ I ;浓度为25mM的MgCl2溶液O. 5μ I ;5Χ荧光定量PCR反应缓冲液2 μ I ;去离子水4.73 μ I。
3.如权利要求I所述的通过CD226基因检测胃癌易感性的试剂盒，其特征在于所述特异性引物中，正义引物的Tm值为60 °C，反义引物的Tm值为58 °C;所述特异性荧光探针中，野生型探针的Tm值为66 °C，突变型探针的Tm值为67 °C。
4.如权利要求I所述的通过CD226基因检测胃癌易感性的试剂盒，其特征在于所述试剂盒的保存温度为_20°C。
5.一种通过CD226基因检测胃癌易感性的试剂盒的用途，其物征在于所述试剂盒用于检测DNA的CD226基因上的rs57613010号SNP位点的基因型。
全文摘要
本发明涉及一种通过CD226基因检测胃癌易感性的试剂盒，包括盒体和装于盒体内的物质，其特征在于所述盒体内的物质包括检测CD226基因上的rs57613010号SNP位点的特异性引物及特异性荧光探针、TaqDNA聚合酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液和去离子水。本发明的试剂盒用于检测DNA的CD226基因上的rs57613010号SNP位点的基因型，既适用于检测个体胃癌的易感性，又适用于对乳腺癌、前列腺癌及卵巢癌的预后检测，更可广泛应用于医疗研究。
文档编号C12Q1/68GK102660643SQ201210124430
公开日2012年9月12日 申请日期2012年4月25日 优先权日2012年4月25日
发明者吕国强, 周萍, 张淳, 李建平, 李成万 申请人:无锡市第三人民医院