专利名称：一种Ⅱ型糖尿病基因易感性和预警检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及遗传学，分子生物学，临床医学及预防医学技术领域，具体地说，本发明涉及一种II型糖尿病基因易感性和预警检测试剂盒，其特征是联合检测多个核酸(DNA 和 RNA)分子标记，包括:APM1 (+45)、CDKALl (rs 10946398)、TCF7L2 (rs7903146)、CDKN2A/2B (rs 10811661), KCNQl (rs2237892)、VDR (Fok I)、SLC30A8 (rsl3266634)上基因多态性位点，在经过风险评估模型的计算分析，可以评估和筛选受检者的II糖尿病易感性(susceptibility)。
背景技术：
在2000年全球有糖尿病患者1.51亿，而目前全球有糖尿病患者2.85亿，按目前的增长速率，估计到2030年全世界糖尿病人口将增长到5亿，其中发达国家将由5100万增长到7200万，增长率为42 %，而发展中国家将由8400万增长到2亿3000万，增长率达到了170%。近年我国糖尿病发病率持续升高，由1980年的I %上升至2008年9.7%。目前糖尿病患者突破9800万人，其中90%以上是II型糖尿病，所以也是最常见的糖尿病。其特点是胰岛素抵抗，即体内组织对胰岛素的作用不敏感，正常量的胰岛素起不到正常的降血糖作用，或胰岛素分泌不足。包括中国人在内的亚洲人种的II型糖尿病患者往往并不伴有肥胖等特征。研究表明，在未来20年里，中国糖尿病人群以高于2倍的速度增长，亚洲将会成为最严重的发病区域。糖尿病及其慢性并发症严重威胁人类健康和生命。大量研究表明，II型糖尿病(T2DM)是一种多基因遗传病，是由遗传和环境因素相互作用而导致的，以胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能障碍为特点的疾病。遗传因素增加了机体发生II型糖尿病的危险性。其中主效基因起主要作用，次效基因起较小作用，不同基因之间还可能存在交互作用。脂联素(A diponectin)是由脂肪细胞特异性分泌一种胶原样细胞因子，存在于血循环中的一种激素蛋白。脂联素由244个氨基酸组成，脂联素在血浆中含量丰富。有研究表明，血浆脂联素具有抗动脉粥样硬化、改善胰岛素抵抗、降血糖、抗炎等生物学作用。低脂联素浓度可增加代谢综合征及II型糖尿病的风险。人脂联素基因(Adiponectin gene或者APM1)是单拷贝基因，定位于染色体3q27，大小为17kb，由3个外显子和2个内含子组成。全基因组扫描显示该区域存在II型糖尿病(T2DM)和代谢综合征的易感位点。Q)K5 (细胞周期素依赖激酶5, cyclin-dependent kinase 5)在高糖毒性的作用下可导致β细胞变性。Q3KAL1 (Q)K5调节亚单位相关蛋白I类似物I, cyclin-dependentkinase 5 regulatory subunit associated protein 1-like I)基因编码的蛋白质能够抑制CDK5的活化。若CDKALl基因发生变异，则对CDK5失去抑制作用，会导致β细胞功能受损，胰岛素分泌减少。可见，⑶KALl基因位点发生变异，与人群中胰岛素分泌缺乏有关。rs57754840位于⑶KALl基因的第五个内含子，是与II型糖尿病遗传易感性密切相关的SNP。⑶KALl基因rs7754840有G、C两种等位基因。G为主效基因，C为次要基因，出现G-C变异，则CDKALl对CDK5的抑制作用减弱，会导致β细胞功能受损，因此C为导致糖尿病出现的高风险等位基因。正常人群中c%的发生频率在40%左右。TCF7L2(转录因子 7 类似物 2，transcription factor 7 like2)基因可能是 T2DM的主要致病基因之一。TCF7L2基因位于染色体10q25，全长217，226bp。由14个外显子和13个内含子组成。共编码619个氨基酸。其表达产物是一组具有高度变异性的转录因子，这些转录因子在维持血浆葡萄糖的稳态中起重要作用。2006年Florez等通过3年的前瞻性研究发现rsl2255372和rs7903146两个位点与糖尿病病情的进展有关，它们可以增加那些糖耐量减低患者患糖尿病的风险。Sale等发现位点rs7903146和rs7901695与居住在美国的非洲人的糖尿病肾病有关。我们的研究发现，rs7903146的基因变异型是与II型糖尿病发病风险相关性最强的基因。TCF7L2是目前为止发现的与II型糖尿病的发病关系最密切的易感基因之一，并且在不同种族的人群中有很好的重复性。TCF7L2基因变异增加II型糖尿病的发病风险，可能是通过其在糖尿病患者的胰岛β细胞中的过表达，fct信号通路异常以及胰岛β细胞对前胰岛素加工障碍等途径最终导致了胰岛素分泌障碍和胰岛素作用下降。CDKN2A和CDKN2B定位于第9号染色体9Ρ21上，CDKN2A/CDKN2B分别编码抑癌因子pl5INK4a和pl6INK4b。后者能抑制⑶K4活性。而⑶K4 (细胞周期素依赖激酶4)能有效调节胰腺β细胞增殖。若CDKN2A /2B基因附近的rsl0811661发生变异，使得CDKN2A/2B基因产物过度表达，将会显著抑制CDK4活性，进一步会影响β细胞的分泌功能，使胰岛素分泌减少，导致II型糖尿病的发生风险升高。有临床研究表明，⑶ΚΝ2Α/2Β基因rsl0811661有T/T、T/C、C/C三种基因型，II型糖尿病组危险等位基因T/T纯合子频率为37.5%，危险等位基因T%为59.5%，均显著高于正常对照组。T等位基因携带者患糖尿病的风险为C等位基因携带者1.38倍。KCNQl基因定位于第11号染色体11ρ5，编码676个氨基酸组成的蛋白，其生理作用是电压依赖性钾离子通道家族的成员之一。以Yasuda等为首的日本国际医疗中心研究小组比较II型糖尿病患者和普通人，发现位于KCNQl基因内区的rs2237892的变异，使II型糖尿病的发病风险将增加1.3-1.4倍。黎怀星和林旭等人以3210名汉族居民作为研究人群，系统地分析了 KCNQl 基因上的 rs2074196, rs2237892, rs52237895 和 rs522375973多态性位点与II型糖尿病及其相关表现型的关联关系。发现:rs2237892、rs52237895和rs2237s973位点均与II型糖尿病的患病风险存在着显著的关联关系,其增加患病风险分别高达32.5%，18.8%和35.8%。这些位点均与β细胞功能受损相关联。由这些多态性位点的危险等位基因所组成的单倍体型也与II型糖尿病患病风险和β细胞功能指数之间存在着很强的关联关系。研究结果提示，KCNQl基因是中国汉族人群的一个主要的II型糖尿病基因。张留伟等研究共纳入7篇论文，得到7764例II型糖尿病患者和8937例对照，经Meta分析结果显示，KCNQl基因rs2237892位点C等位基因能够增加T2DM的发病风险(OR =1.300,95% Cl:1.234 1.366)，CC/TC基因型是II型糖尿病的危险基因型(0R =1.453,95% Cl:1.279 1.651)。人VDR基因全长约4605个碱基对，包括一段115bp非编码的前导序列，一段1281bp的编码序列以及一段3209bp的3端非编码序列。VDR基因位于染色体第12ql3，由9个外显子和8个内含子组成。维生素D通过与VDR结合发挥其生物活性作用，例如胰岛β细胞表达维生素D受体和维生素D依赖性钙结合蛋白(calbindinD28k，CB)，这提示维生素D可影响胰岛素分泌及控制β细胞生长与分化。研究显示，VDR基因多态性位点(FokI)与口服葡萄糖耐量后胰岛素分泌增加或减少有关。VDR基因位点单核苷酸多态性可影响VDR转录活性的变化。因此，VDR(Fok I)基因已经作为II型糖尿病的候选基因。SLC30A8 (solute carrier family 30, member 8,锋转运蛋白 _8)基因核苷酸序列全长41617bp，含8个外显子，在染色体上定位在8q24.11。SLC30A8基因编码369个氨基酸的蛋白质。研究表明SLC30A8编码的是一种在胰岛细胞大量表达的锌离子转运蛋白，是一种多次跨膜蛋白，并且蛋白经过了多种形式的修饰。其主要功能是将胞浆内的锌离子转运到胰岛素分泌囊泡中，参与胰岛素合成、储存和分泌的重要功能。多项GWAS研究发现，SLC30A8基因rsl3266634多态性位点的C等位基因是中国人II型糖尿病的风险等位基因。
发明内容
基于循证医学的基本原则，采用病例-对照研究和队列研究相结合的方法，并将回顾性研究与前瞻性研究相结合，通过文献检索、证据评价、信息提取、H-W遗传平衡检验、同质性检验、大样本Meta分析等一系列严格的筛选和实验验证过程，综合考虑和分析各个基因位点与II糖尿病的关联度(0R值)、人群中基因型发生频率、发病机理、信号通路等，最后确定七个II糖尿病相关的易感性基因多态性位点。本发明提供一种II糖尿病基因易感性和预警检测试剂盒，通过联合检测多个核酸(DNA 和 RNA)分子标记，包括:APM1 (+45)、CDKALl (rs 10946398)、TCF7L2 (rs7903146)、CDKN2A/2B (rs 10811661) ,KCNQl (rs2237892)、VDR(Fok I)、SLC30A8 (rsl3266634)上基因多态性位点，来评估和筛选II糖尿病的遗传易感性。该试剂盒的特征是上述基因位点的特异性扩增引物对及DNA测序引物对包括:用于检测APMI基因上+45基因多态性位点的特异性引物对及DNA测序引物对；用于检测⑶KALl基因上rsl0946398基因多态性位点的特异性引物对及DNA测序引物对；用于检测TCF7L2基因上rs7903146多基因多态性位点的特异性引物对及DNA测序引物对；用于检测⑶KN2A/2B基因上rsl0811661基因多态性位点的特异性引物对及DNA测序引物对；用于检测KCNQl基因上rs2237892基因多态性位点的特异性引物对及DNA测序弓I物对；用于检测VDR基因上Fok I基因多态性位点的特异性引物对及DNA测序引物对；用于检测SLC30A8基因上rsl3266634基因多态性位点的特异性引物对及DNA测序引物对；PCR反应试液(包括:缓冲液，MgCl2溶液，UdNTPs, dNTPs，特异性引物对，Taq DNA聚合酶，UNG酶，模板DNA，纯水等)；PCR产物酶解液(包括:SAP酶，ExoL酶MIX，纯水等);DNA测序反应液组份(包括:EDTA，无水乙醇，70%预冷乙醇，去离子甲酰胺(H1-DiFormamide)，PCR酶解产物，BigDye Mix, DNA测序引物，纯水等)。
本试剂盒所述的特征是APMl (+45)、CDKALl (rs 10946398)、TCF7L2 (rs7903146)、CDKN2A/2B(rsl0811661) ,KCNQl (rs2237892) ,VDR(Fok I)、SLC30A8 (rsl3266634)上七个基因多态性位点同时进行联合检测。本试剂盒所述的特征是七个特异性扩增引物对分别针对APMl (+45)、CDKALl (rsl0946398)、TCF7L2 (rs7903146)、CDKN2A/2B (rs 10811661)、KCNQl (rs2237892)、VDR(Fok I)、SLC30A8(rsl3266634)上基因多态性位点，能特异性扩增出DNA片段。本发明的七个特异性引物可用常规的合成方法进行合成，这些引物本领域的技术人员可以轻易地进行设计、合成和使用等。本试剂盒所述的特征是七个DNA测序引物对分别针对APMl (+45)、CDKALl (rsl0946398)、TCF7L2 (rs7903146)、CDKN2A/2B (rs 10811661)、KCNQl (rs2237892)、VDR (Fok I)、SLC30A8 (rsl3266634)上基因多态性位点，能特异性进行DNA片段的序列检测。本发明的七个DNA测序引物对可用常规的合成方法进行合成，这些引物本领域的技术人员可以轻易地进行设计、合成和使用等。本试剂盒所述的特征是所述试剂盒的组成与含量包括:(I)PCR反应试液:单个PCR反应体系包括:10XPCR缓冲液2.5μ l，25mM MgCl2溶液 2.5μ1，25πιΜ UdNTPs 0.2 μ l,25mM dNTPs 0.2 μ 1，20 μ M 特异性引物对中的一对引物
0.5 μ I, 5U/μ I混合酶(Taq DNA聚合酶与UNG酶)I μ I，模板DNA 3 μ I (50ng)，加纯水至25 μ I。其中，使用UdNTPs-尿苷酶(UNG)防污染体系，经加热可以选择性地降解U-DNA，以防止PCR扩增产物的污染。 (2) PCR 产物酶解液:2 μ I SAP 酶 +ExoL 酶 MIX。(3) DNA测序反应液:有两部分组成:测序反应体系和测序产物纯化。单个DNA测序反应体系包括:3 μ I PCR酶解产物，I μ I测序试剂(25% BigDye Mix)，I μ I DNA测序引物对(只使用其中一个引物)，I μ I纯水。测序产物纯化包括:100mM EDTA 2 μ 1，16 μ I无水乙醇，70%预冷乙醇70μ 1X2,10μ I去离子甲酰胺(H1-Di Formamide)等。上述三个组份的保存温度为-20°C。
具体实施例方式下面结合具体实施例进一步阐述本发明，实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。下列实施例中未做详细说明和具体描述的实验条件和实验方法，应为常规实验条件和方法，或按厂家提供的操作步骤和方法进行。实施例本试剂盒的使用1、样本基因组DNA的获取:用清水漱口一到二次，去除口腔中的食物残渣，并注意咽尽口腔中剩余的清水。用棉签刮取口腔粘膜脱落细胞并将其放入Eppendorf管的细胞固定液中，拧紧瓶盖备用。2、DNA抽提及纯化:用细胞裂解法提取中的DNA，悬浮于Iml生理盐水中，2000 Xg离心IOmin ;弃上清，每管加Iml生理盐水重复洗涤一次，再2000 X g离心IOmin ;弃上清，每管加 400 μ I 细胞裂解缓冲液(10mmol/L Tris-HCl, PH 8.0 ；0.1mol EDTA, PH 8.0 ；0.5%SDS)，放在50°C水浴中温育30分钟；然后冷却至室温，加等体积的酚一氯仿一异戊醇(体积比25: 24:1),混勻，5000Xg离心IOmin ;转移上层水相到另一 Eppendorf管中，重复抽提一次；再转移上层水相到另一 Eppendorf管中，加1/10体积的3M NaAc (pH5.2)，混匀;加入2.5倍体积的95%冷乙醇，混匀，-20°C沉淀DNA 30分钟；10000Xg离心15分钟，弃上清；加Iml 70%冷乙醇清洗沉淀，10000 Xg离心分钟，弃上清；37°C温箱30分钟烘干；将DNA沉淀溶于20 μ I TE缓冲液中，加20 μ g/ml胰RNA酶I μ I，37°C温浴30分钟，置于-20°C保存。3、采用PCR方法扩增目标DNA片段:(I)本试剂盒的特点是使用UdNTPs-尿苷酶(UNG)防污染体系，经加热可以选择性地降解U-DNA，以防止PCR扩增产物的污染。(2)本试剂盒的PCR反应试剂组份由PCR反应液体积21 μ 1、5U/ μ I混合酶(TaqDNA聚合酶与UNG酶)I μ I，模板DNA 3 μ I (约50ng)组成。PCR反应液包括:10 X PCR缓冲液 2.5 μ I，25mMMgCl2 溶液 2.5 μ I，25mM UdNTPs 0.2 μ I，25mM dNTPs 0.2 μ I。(3)PCR反应试剂组份准备:试剂开管前请完全解冻后充分混匀并短暂离心。建议在DNA提取结束后配制混合反应液，并立即加样。如特殊情况，可将下述分装好的混合反应液短期存于4°C,并在3小时内使用。(4)PCR反应试剂组份配制:按每个PCR反应液体积21 μ1、混合酶I μ 1，模板DNA3μ 1，乘以所需的反应管数，计算试剂的量，加于一个无菌离心管中，振荡混匀。再用微量加样器在每一 PCR反应管内加入25 μ I上述混匀的混合反应液。(5) PCR反应试剂组份加样:在上述分装好的装有混合反应液的PCR反应管中分别加入模板DNA和阴性对照各3 μ I。S卩:单个PCR反应体系组分，见表1:
表I单个PCR反应试剂组份
权利要求
1.本发明提供了一种II型糖尿病基因易感性和预警检测试剂盒，其特征是包括以下步骤: 获得受检者的体液，毛发，血液或细胞组织等样本； 提取样本中的核酸(DNA和RNA)； 通过联合检测多个核酸(DNA和RNA)分子标记的方法获得受检者的遗传信息； 对相关的生物信息进行数据处理与统计分析，从而评估该健康受检者的II糖尿病易感性，并对已经患有II型糖尿病人群的个性化治疗和个性化保健也有指导意义。
2.根据权利要求1所述的一种II型糖尿病基因易感性和预警检测试剂盒，其特征是联合检测多个核酸(DNA和RNA)分子标记，包括=APMl (+45)、CDKALl (rs 10946398)、TCF7L2 (rs7903146)、CDKN2A/2B(rsl0811661)、KCNQl(rs2237892)、VDR (Fok I)、SLC30A8(rsl3266634)。
3.根据权利要求1所述的一种II型糖尿病基因易感性和预警检测试剂盒，其特征是所述核酸(DNA和RNA)分子标记的检测方法包括: 各种DNA测序的方法； 各种荧光定量PCR方法； 各种生物芯片检测方法； 通过各种突光标记与杂交技术检测核酸(DNA和RNA)分子标记的方法。
4.根据权利要求1所述的一种II型糖尿病基因易感性和预警检测试剂盒，其特征是所述核酸(DNA和RNA)分子标记包括: 单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)； 拷贝数多态性(copy number polymorphism, CNP)；微卫星 DNA (short tandem repeat, STR)； 限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)； 随机扩增多态性 DNA(random amplified polymorphic DNA, RAPD)； 特定序列位点(sequence-tagged site, STS)； 扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP)。
5.根据权利要求1所述的一种II型糖尿病基因易感性和预警检测试剂盒，其特征是所述七个核酸(DNA和RNA)分子标记的特异性扩增引物对及DNA测序引物对。
6.根据权利要求1所述的一种II型糖尿病基因易感性和预警检测试剂盒，其特征是所述试剂盒的组成与含量包括:(I)PCR反应试剂组份；(2) PCR产物酶解试剂组份；(3) DNA测序反应试剂组份。
7.根据权利要求1所述的一种II型糖尿病基因易感性和预警检测试剂盒，其特征是所述试剂盒的可应用于健康受检者个体肥胖的遗传风险评估，有利于专家和受检者根据基因分型的结果，进行个性化的健康管理及干预指导。
8.根据权利要求1所述的一种II型糖尿病基因易感性和预警检测试剂盒，其特征是所述试剂盒的可应用于已经患 有II型糖尿病人群的检测，有利于专家和受检者根据基因分型的结果实现个性化治疗和个性化保健。
全文摘要
本发明提供了一种II型糖尿病基因易感性和预警检测试剂盒，其特征是联合检测七个核酸(DNA和RNA)分子标记，包括APM1(+45)、CDKAL1(rs10946398)、TCF7L2(rs7903146)、CDKN2A/2B(rs10811661)、KCNQ1(rs2237892)、VDR(FokI)、SLC30A8(rs13266634)。该试剂盒包括上述基因多态性位点的特异性扩增引物对及DNA测序引物对，以及PCR反应液、PCR产物酶解液、DNA测序反应液。通过本试剂盒的检测，并对基因信息进行处理与分析，评估健康受检者的II型糖尿病易感性，并对已患病人群的个性化治疗和保健具有指导意义。
文档编号C12Q1/68GK103074414SQ20121012833
公开日2013年5月1日 申请日期2012年4月27日 优先权日2012年4月27日
发明者崔春黎, 肖自力, 纪燕燕 申请人:上海金防生物科技有限公司