专利名称：对bZIP类转录因子具有调控作用的基因、其克隆方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种对bZIP类转录因子具有调控作用的基因、其克隆方法及其应用。
背景技术：
玉米(Zea mays)是世界上种植面积最大并且产量最大的禾本科作物之一，大多用于动物饲料，食物以及エ业原料，在エ农业中均有着广泛的应用。玉米对于现代社会的发展起到了重要作用。但是，由于玉米蛋白质中必需氨基酸含量不完整，尤其是胚乳中含量最高的a醇溶蛋白(22kD醇溶蛋白和19kD醇溶蛋白)的赖氨酸和色氨酸严重缺乏，导致玉米本身的营养价值较差，长期以玉米为单ー粮食会导致严重的营养不良。为了改进玉米的蛋白质质量，人们进行了大量的科学研究。Opaque-2是ー个含有bZIP结构域的转录因子，并且在1987年被人们通过转座子标签技术克隆。突变体表现出了典型的粉质胚乳(图I)，并且在生化成分含量中，ベ 相对于野生型籽粒表现出了高含量的赖氨酸和色氨酸。因此，Opaque-2是ー个著名的籽粒高赖氨酸突变体。目前研究表明，转录因子Opaque-2在玉米胚乳中专ー的调控22kD醇溶蛋白的表达，并且部分调控19kD醇溶蛋白的表达。由于之前的研究中已经发现，Opaque-2可以和ー些非醇溶蛋白产生物理結合，因此，可以认为，Opaque-2在玉米籽粒发育过程中可能还担负着一些其他的重要使命。从Opaque-2克隆至今，人们通过ー些方法找到了ー些疑似和Opaque-2有关的基因，如PBF、OHPU GCN5，但是对于Opaque-2在玉米籽粒发育中具体的调控机制依然不为人知。鉴于Opaque-2本身转录因子的分子结构以及其调控的下游蛋白在玉米籽粒中的重要作用，人们普遍认为Opaque-2是ー个在籽粒发育中起到重要作用的转录因子。解释Opaque-2的具体功能对于人们改进玉米蛋白质品质具有极为重要的意义。根据之前研究的经验来看，通过蛋白相互作用的方法在转录后水平来寻找调控Opaque-2的蛋白不失为一个重要的手段。蛋白相互作用的方法包括酵母双杂筛库、体外的Pul 1-down、体内的免疫共沉淀(CoIP)等。酵母双杂实验是基于酵母体系在酵母体内筛选可能有互作的两个蛋白的方法。该实验可以大范围地筛选可能有直接互作的两个蛋白。但是，其背景信号较高，会有一些假阳性的情况出现。Pull-down是基于免疫沉淀和Western技术发展来的体外或者半体内来检测蛋白互作的ー门技木。该技术通过抗体的特异性吸附以及互作蛋白之间的相互物理性的结合来进行互作验证。该实验方法相对于酵母双杂可以大幅降低背景，但是还是不能完全体内地来验证蛋白互作。由Pull-down技术发展而来的免疫共沉淀技术可以在体内情况下验证蛋白互作。 该技术原理和Pull-down —致,都是利用了免疫沉淀和Western技术来检测蛋白互作。但是和Pull-down不同的是免疫共沉淀完全采取了内源的组织细胞表达的蛋白。因此，免疫共沉淀的难度更大对抗体的要求更高，但是结果更可靠。此外，一些其他的实验方法也可以用来进行蛋白互作之后的功能分析。包括亚细胞定位以及蛋白在植物细胞瞬时表达的酶活測定等。亚细胞定位主要是基于以荧光蛋白为标签的瞬时转化技木。可以通过基因枪对洋葱表皮细胞瞬时转化以及农杆菌侵染烟草表皮细胞或者原生质体等方法来实现对蛋白的亚细胞定位。在对互作蛋白的功能分析中，采取以⑶S为报道基因，荧光素酶为内參通过酶标仪来测定酶活的方法来对互作蛋白的功能分析进行定量检测。
发明内容
本发明的目的之一在于通过酵母双杂技术筛选出了ー个对bZIP类转录因子具有调控作用的基因，称为ZmTaxilin。该基因在酵母中和Opaque-2有相互作用。 本发明的目的之ニ在于提供该基因的克隆方法。本发明的目的之三在于提供其应用价值。为达到上述目的，本发明采用如下技术方案为
ー种对bZIP类转录因子具有调控作用的基因，其特征在于该基因为SEQ ID N0:1所示的碱基序列。一种克隆上述的对bZIP类转录因子具有调控作用的基因，其特征在于该方法的具体步骤为
a.将均一化的玉米籽粒cDNA片段与单杂载体pGADI7-Rec连接转化,构建馆质粒,选取其中包含bZIP结构域以及核定位信号又屏蔽了其转录激活结构域02-2片段，将其连入PGBKT7载体中，构建库质粒；
b.将步骤a所得的库质粒以及饵质粒转入酵母AH109中，得到酵母转化子，通过DDO与QDO的筛选，共获得了疑似阳性克隆，对该克隆质粒抽提、测序分析以及回转酵母，筛选出一个与Taxilin同源的基因，即得到对bZIP类转录因子具有调控作用的基因。上述的对bZIP类转录因子具有调控作用的基因在对转录因子下游靶标基因的转录中的调控作用。上述的对bZIP类转录因子具有调控作用的基因在和bZIP类转录因子发生相互结合并且改变转录因子在细胞内分布中的应用。上述的对bZIP类转录因子在调控bZIP类转录因子转录激活能力中作用。上述的对bZIP类转录因子具有调控作用的基因在抑制被调控转录因子对下游靶标基因的基因表达中的应用。通过RT-PCR与Real-time PCR的方法证明了本发明的基因ZmTaxilin与Opaque-2的表达具有时空重叠性。通过瞬时转化洋葱表皮细胞发现ZmTaxilin与Opaque-2具有一致的共定位。ZmTaxilin在洋葱表皮细胞中通过改变Opaque-2的亚细胞定位抑制了Opaque-2的功能。由于Opaque-2是ー个能够调控22kD醇溶蛋白启动子表达的转录因子。因此，将22kD醇溶蛋白启动子，Opaque-2, ZmTaxilin以及荧光素酶一同转入洋葱表皮细胞中，通过酶标仪分别检测GUS与荧光素酶的酶活。通过研究和bZIP类转录因子有互作的蛋白为线索，利用酵母双杂的方法，以Opaque-2为馆质粒,筛选出了一个含有Taxilin结构域的蛋白。通过NCBI预测，该蛋白是一个疑似的细胞骨架蛋白。通过酵母回转验证以及半体内的GST Pull-down实验,证明了和Opaque-2的互作。此外,通过对ZmTaxilin的时空表达分析发现，该蛋白和Opaque-2具有时空重叠性。在对ZmTaxilin调控Opaque-2的亚细胞定位以及功能分析中发现，ZmTaxilin在洋葱表皮细胞中可以改变Opaque-2的亚细胞定位,从而降低Opaque-2对22kD醇溶蛋白启动子的转录调控。本发明首次发现细胞骨架蛋白能够和bZIP类的转录因子Opaque-2发生互作，从而改变了 Opaque-2的亚细胞定位,并且抑制Opaque-2的转录调控能力。对于解释Opaque-2的具体转录后调控机制具有极为重要的意义，为高品质玉米的大规模生产奠定理论基础。本专利适用于一般玉米常规品种，具体以W22自交系为例说明。
图I是野生型与Opaque-2突变体杂交的F2代籽粒。黑色箭头分别指出了由于Opaque-2突变而导致的不透明的Opaque表型籽粒以及野生型的透明的籽粒；
图2是酵母双杂筛库中馆质粒构建的示意图。由于Opaque-2本身就是一个转录因子，具有较强的转录激活能力，所以利用Opaque-2全长基因筛库会有很高的自激活背景。因此，根据Opaque-2的序列特性，将Opaque-2全长分为三段，选择第二段02_2(即包括了 bZIP结构域又屏蔽了转录激活结构域)作为饵，和已经成功构建的库质粒进行筛库；
图3是酵母双杂筛库获得的阳性克隆滴板验证结果图，其中3-42即为ZmTaxilin在筛库中使用的编号，AD+02-2以及3-42+BD都为负对照；
图4是通过RT PCR与Real-time PCR检测ZmTaxilin在根、茎、叶、雄花、须、穗与籽粒中的表达，并且还检测了籽粒授粉后不同时期的表达情况；
图5是通过半体内的GST Pull-down实验验证ZmTaxilin与Opaque-2的相互作用。GST +kernel extracts 与单独的 kernel extracts 为负对照；
图6是利用基因枪瞬时转化洋葱表皮细胞来检测ZmTaxilin与Opaque-2的亚细胞定
位；
图7同样利用基因枪瞬时转化洋葱表皮细胞来检测ZmTaxilin对Opaque-2调控22kD醇溶蛋白启动子的影响。其中，ZlC启动子+YFP、Z1C启动子+CFP为负对照。
具体实施例方式下面结合具体实施事例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆(Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3rd ed.)或植物分子生物学一实验手册(Plant Molecular Biology — A Laboratory Manual, Melody S. Clark编’ Springer-verlag Berlin Heidelberg, 1997)中所述条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例一利用酵母双杂实验筛选和0paque-2有互作的蛋白
首先采取了 SMART方法，获得了均一化的玉米籽粒cDNA片段。将该cDNA片段与单杂载体pGADI7-Rec连接转化，获得了约I. OX IO6个克隆。在饵质粒的构建中，由于全长Opaque-2转录背景较高，因此选取了包含bZIP结构域以及核定位信号又屏蔽了其转录激活结构域的02-2片段，参见图2)，将其连入pGBKI7载体中。通过 PEG/LiAc法将构建的库质粒以及饵质粒转入酵母AH109中，得到IO6个酵母转化子。通过DDO与QDO的筛选，共获得了 50个疑似阳性克隆。对这些克隆质粒抽提、测序分析以及回转酵母，筛选出一个与Taxilin同源的基因，参见图3。实施例二 ZmTaxilin和Opaque-2的半体内互作验证
为了进一步验证ZmTaxilin和Opaque-2的互作,采取了优化的GST Pull-down方法。首先利用pGEX-4t-l的大肠杆菌外源表达载体构建了含有GST标签的ZmTaxilin。扩增GST-taxilin的特异引物的碱基序列为
正向引物从 5'端至 3'端为GCGAAITCATGGAAGGCTCGCCGGTGGC ( + )
反向引物从 5'端至 3'端为GCCCCGGGTTAAGATTCTTGACTTGTCG (-)
将构建完的GST-taxilin转入BL21大肠杆菌外源表达菌株中进行诱导。经过诱导条件的摸索，确定最佳的诱导条件为30摄氏度，ImM IPTG在OD为0. 6时诱导6小时。利用超声破碎的方法裂解大肠杆菌获得含有GST-taxilin的总蛋白。Pull-down 的过程是基于PIERCE 的GST Pull-down试剂盒(ProFound Pull-DownGST Protein:Protein Interaction Kit)来进行的。首先利用已去头的枪头吸取50 u I含有谷胱甘肽的琼脂糖珠子(Immobilized Glutathione)至离心柱中，利用事先配置的缓冲液(ProFound 裂解液TBS=1:1)洗涤5遍，每遍800 y I。其次，在含有GST-taxilin的总蛋白中加入等量的ProFound 裂解液,取800 ii I的总蛋白至离心柱中，使其与珠子一起4°C孵育I小时。I小时后首先同样利用800 u I缓冲液清洗珠子3遍，随后用自配的蛋白抽提buffer清洗珠子3遍。保存于4°C备用。蛋白抽提buffer的配方为
25mM Tris-Cl pH7. 4-7. 5 IOmM EDTA pH7. 4-7. 5 120mM NaCl
0. 2% NP-40ImM PMSF
0.1%蛋白酶抑制剂(Sigma)
同样利用蛋白抽提buffer抽提授粉后15天(15DAP)的玉米野生型籽粒。抽提方法为取5-6颗15DAP的玉米野生型籽粒液氮研磨，加入800 U I的蛋白抽提buffer。冰上静置30分钟后，4°C离心取上清，即为玉米籽粒总蛋白溶液。将获得的总蛋白加入已经处理的珠子中，使总蛋白与珠子在4°C孵育2小时。2小时后离心回收珠子，用蛋白抽提buffer清洗珠子5遍去除非特异结合的蛋白。将清洗干净的珠子按照说明书的指示加入用蛋白抽提buffer溶解的谷胱甘肽溶液，洗脱结合在珠子上的蛋白，离心收集蛋白溶液用于Western检测。Western使用的抗体分别为GST抗体(Abcam)以及02抗体(自备)。经过GST Pull-down实验发现，GST-Taxilin可以在体外非常稳定地和Opaque-2发生直接的结合。由于我们在Pull-down过程中，使用的是玉米籽粒内源的未变性的0paque-2复合物代替了大肠杆菌外源表达的Opaque-2，因此反应条件更接近体内的实际情况，结果更为可靠。实施例三ZmTaxilin在玉米组织中的时空表达分析
首先收取玉米各组织器官的材料，包括根、茎、叶、雄穗、须、雌穗以及从3DAP至36DAP的籽粒，抽提并且反转录RNA为cDNA。以ZmUBQ(GenBank Accession BT018032)为内参，对所有反转录的cDNA进行定量PCR ( (MJ Research)。以玉米籽粒授粉后18天(18DAP)的表达量为参照(设定为I )，对其他的样品进行相对表达分析。定量PCR中使用到的ZmTaxi I in以及ZmUBQ的弓丨物碱基序列为ZmTaxilin :正向引物从 5'端至 3'端为TCAACCTACCGTCCGTCTCAG ( + )
反向引物从 5'端至 3'端为GTAGGAATGCACCACTAGGCTCT (-)
ZmUBQ :正向引物从 5'端至 3'端为CTGGTGCCCTCTCCATATGG ( + )
反向引物从 5'端至 3'端为CAACACTGACACGACTCATGACA (-)
经过定量分析发现，ZmTaxilin虽然在所有组织中均有表达，但是在籽粒胚乳约授粉后10天左右的时期具有表达高峰。因此，可以认为，ZmTaxilin与Opaque-2在表达的时间和空间上具有重叠性，参见图4。实施例四ZmTaxilin和Opaque-2在洋葱表皮细胞中的单独定位与共定位
将ZmTaxilin和Opaque-2基因全长通过GATEWAY体系分别连入pB7CWG2和pB7YWG2载体中，使其N端带有荧光蛋白标签。载体鉴定正确后分别大抽质粒，并且将质粒浓度稀释至Li I U g/U I。利用基因枪轰击洋葱表皮细胞的方法通过Biolistic PDS-1000/He Gene GunSystem (Bio-Rad)基因枪将这两个载体分别打入已经在MS固体培养基中25°C暗培养至少8小时的洋葱表皮细胞中。MS固体培养基配方为
MS salt 4.33g/L
鹿糖30g/L 琼脂粉7g/L
用 1M/L KOH 调 pH 至 5. 8
轰击完毕后，继续25°C暗培养I天。将洋葱表皮细胞在载玻片中制备成样本在共聚焦显微镜(Carl Zeiss LSM 710)中观察ZmTaxilin和Opaque-2的单独定位与共定位。在共聚焦显微镜的观察中，采用了 433nm激发波长以及458nm发射波长来检测CFP的信号，采用了 513nm激发波长和530nm发射波长来检测YFP的信号。在共聚焦显微镜的观察过程中发现，YFP-02主要定位在细胞核，但在细胞质中有一定弥散分布(图6A)。相比于YFP-02，CFP-Taxilin并没有定位于细胞核，并在细胞核附近聚集分布(图6B)。从这两个蛋白单独定位的结果中可以很明显的观察到，YFP-02和CFP-Taxilin在单独表达的时候具有各自不同的定位。而当这两个蛋白共表达的时候，YFP-02非但和CFP-Taxilin有非常一致的共定位，而且共定位信号类似于CFP — Taxilin单独定位的部位(图6C)。同时，原本主要定位于细胞核，并且在细胞质中呈现弥散分布的YFP-02主要在细胞质中表达。因此，可以认为，CFP-Taxilin可以改变YFP-02的定位。实施例五在洋葱表皮细胞中检测ZmTaxilin对Opaque-2调控22kD醇溶蛋白启动子的影响
由于在实施例四中发现CFP-Taxilin可以改变YFP-02的定位，为了查清ZmTaxilin在Opaque-2调控22kD醇溶蛋白的过程中起到了什么作用。我们利用洋葱活细胞系统来检测ZmTaxilin的功能。为了和实施例四的结果具有可比较性，因此继续选择CFP-Taxilin和YFP-02这两个载体，并且重新构建pUC18-P22kD:⑶S和pUC18_35S: Luciferase载体。pUC18-P22kD:⑶S载体中的22kD醇溶蛋白启动子包含了 I个Prolamin box和3个Opaque-2结合位点。pUC18_P22kD:⑶S构建的引物碱基序列为
正向引物从 5’ 至 3’ 端为GCCCCGGGGGAITTCAATTAGTCTATA 反向引物从 5’ 至 3’ 端为GCGAAITCTGTTGTTAGGTTGITGCTA
此外，选择荧光素酶作为该实验体系的内参，将荧光素酶基因全长连入pUC18-35S中。pUC18_35S:Luciferase构建的引物喊基序列为正向引物从 5’ 至 3’ 端为GCGGATCCATGGAAGACGCCAAAAACAT 反向引物从 5’ 至 3’ 端为GCGAAITCTTACACGGCGATCTTTCCG
载体构建完成后，大抽质粒并且打基因枪。步骤同亚细胞定位。培养一天后，进行酶活测定。酶活测定步骤为
I.将已培养的洋葱表皮细胞从MS培养基中小心取出放入I. 5ml离心管中，并且液氮研磨。2.加入⑶S裂解缓冲液，并且12000rpm 4度离心5分钟，取上清；
GUS裂解缓冲液配方为
IOOmM 磷酸钾 pH7.8 ImM EDTA 1% Triton X-100 10%甘油
7mM 巯基乙醇
3.BCA定量；
4.取50ill上清加入到180 u I经过37°C预热的⑶S活性检测液(2mM 4-MUG)中，迅速混匀，并立刻取出IOiU加入到190 ill反应终止液(0. 2M Na2C03)中，将该管作为酶促反应的0点，其余的反应液继续37°C孵育，并且计时；
5.⑶S活性检测液(2mM4-MUG)配方为将50mg 4-MUG溶解到72ml⑶S酶提取液中，配制成2mM工作液。6.在10分钟，30分钟，60分钟时分别取出10 U I反应液，转入190 U I反应终止
液中；
7.用酶标仪在365nm激发波长，455nm发射波长下，测定不同时间点的GUS吸光度；
8.在测定荧光素酶活性的实验中，首先配制荧光素酶反应缓冲液，配方为
20mM Tricine pH7. 8
5mM MgC12
0.ImM EDTA
3.3mM DTT
0.27mM 辅酶 A500mM荧光素500mM ATP
9.取10 ill蛋白样品加入190 ill荧光素酶反应缓冲液中，用酶标仪测定不同样品的荧光素酶吸光度。 通过3次重复试验发现，ZmTaxilin本身不具有对祀标启动子的激活活性,但是可以抑制Opaque-2对祀标启动子(22kD醇溶蛋白)的转录激活功能。综合在实施例四中CFP-Taxi I in可以改变YFP-02的定位的结果，我们得出以下结论=ZmTaxi I in可以通过改变bZIP类转录因子Opaque-2的亚细胞定位，从而起到抑制下游被调控基因(22kD醇溶蛋白)启动子的表达。
序列表
<110>上海大学
〈120〉对bZIP类转录因子具有调控作用的基因、其克隆方法及其应用
〈160〉 I
〈210〉 I
〈211〉 1278
〈212〉 DNA
〈213〉基因序列
〈400〉 I
Atgga aggct cgccg gtggc gcgcc tcccg gaggc taatt ctctc cccga cggct tcgtc60
cccga cagcg agagc tcaga cacgg acgcg gctcc tccct cctcc gcgcc catag ttgac120
gatgc aatcg actcc gatag tcccg acgcc accaa ccccg gtggt gagga aaccc taagt180
gatcc ctccc ttccc gcgtc caccg ccgaa gatgc ctcct cagcc gccgc tgctg aagca240
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cccac cactg ctgca agagg tgaag gatcc ttgaa ggaaa atcgt gcatc agagc aagtg360
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aaggc tgctc aggaa catac acaaa tgcag ttgta tgctg aacaa gtttc tcagc ttatg900
actac tgaga agaac ctgcg gttgc aacta gcttc tgacg gggaa agatt tcagc acttt960
cagga tgcct tgtca aaaag caatg aagtc tttga aactt acaag cagga gatgg aaaag1020
atgat ttcag tgata aagaa tctta agaag gagaa cgaat ttctg aaggg aaaat gtgag080
aactc agata ttgct attgt gaagc tcatt gaaga gcgtg agcta acaaa gaagc aaata1140
gagaa attga aaaat caaag ggaga agctc gaatc cctgt gtcga acact acagg cagaa1200
aggaa acaag gcccc tccgc cagta ttcca gatgc ccctt ctagc caaga agtgt cagcg1260 acaag tcaag aatct taa1278
权利要求
1.ー种对bZIP类转录因子具有调控作用的基因，其特征在于该基因为SEQ ID N0:1所不的喊基序列。
2.一种克隆根据权利要求I所述的对bZIP类转录因子具有调控作用的基因，其特征在于该方法的具体步骤为 将均一化的玉米籽粒cDNA片段与单杂载体pGADH-Rec连接转化，构建饵质粒，选取其中包含bZIP结构域以及核定位信号又屏蔽了其转录激活结构域02-2片段，将其连入PGBKT7载体中，构建库质粒； b.将步骤a所得的库质粒以及饵质粒转入酵母AH109中，得到酵母转化子，通过DDO与QDO的筛选，共获得了疑似阳性克隆，对该克隆 质粒抽提、测序分析以及回转酵母，筛选出一个与Taxilin同源的基因，即得到对bZIP类转录因子具有调控作用的基因。
3.ー种根据权利要求I所述的对bZIP类转录因子具有调控作用的基因在对转录因子下游靶标基因的转录中的调控作用。
4.ー种根据权利要求I所述的对bZIP类转录因子具有调控作用的基因在和bZIP类转录因子发生相互结合并且改变转录因子在细胞内分布中的应用。
5.ー种根据权利要求I所述的对bZIP类转录因子在调控bZIP类转录因子转录激活能力中作用。
6.ー种根据权利要求I所述的对bZIP类转录因子具有调控作用的基因在抑制被调控转录因子对下游靶标基因的基因表达中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种对bZIP类转录因子具有调控作用的基因、其克隆方法及其应用。该基因为SEQIDNO1所示的碱基序列。该序列可以和bZIP类转录因子(如Opaque-2)发生蛋白互作，和互作转录因子(以Opaque-2为例)具有时空表达重叠性；在ZmTaxilin和互作转录因子(以Opaque-2为例)的亚细胞定位以及共定位中发现，ZmTaxilin可以明显改变互作转录因子(以Opaque－2为例)的亚细胞定位；在植物活细胞体系中进行转录激活活性检测，发现ZmTaxilin可以抑制互作转录因子(以Opaque-2为例)对靶标基因(以22kD醇溶蛋白基因为例)启动子的转录活性。
文档编号C12N15/29GK102653766SQ20121013308
公开日2012年9月5日 申请日期2012年5月3日 优先权日2012年5月3日
发明者乔祯逸, 宋任涛, 张男, 梁铮, 许政暟 申请人:上海大学