专利名称：焦磷酸测序法检测egfr基因多态性的试剂盒及方法
技术领域：
发明属于分子生物学领域，具体涉及焦磷酸测序法检测EGFR基因多态性的试剂盒及方法。
背景技术：
吉非替尼(Gefitinib)(商品名Iressa易瑞沙)是2003年美国FDA批准的第二个信号转导抑制剂，主要用于治疗既往接受过化学治疗或不适 于化疗的局部晩期或转移性非小细胞肺癌(NSCLC) ο厄洛替尼(Erlotinib)(商品名Tareeva特罗凯)于2004年通过美国FDA审批在美国上市，作为ニ线或三线药物用于治疗晩期或其他方案无效的非小细胞肺癌患者。埃克替尼(Icotinib)(商品名Conmana,凯美钠)是我国食品药品监瞀管理局(SFDA)于2011年6月8日批准上市的小分子肿瘤靶向治疗药物，主要用于非小细胞肺癌的治疗。三者为同类药物，其作用祀点均为人类表皮生长因子受体(印idermal growthfactor receptor family, EGFR)。在体内主要是同三磷酸腺苷竞争性地与EGFR细胞内酪氨酸激酶结合域结合，选择性抑制EGFR相关的活性及细胞内磷酸化过程来发挥其抗肿瘤作用，通过对EGFR酪氨酸激酶活性的抑制，阻滞下游信号转导通路，拮抗血管生成、细胞迁移扩散及増殖作用，阻断肿瘤组织的生长。上述三种EGFR酪氨酸激酶抑制药，是目前NSCLC患者最有效的靶向药物。但EGFR-TKI并非对所有患者都有效。EGFR外显子18、19或21发生突变的患者，吉非替尼有效率可高达80%，而野生型患者基本无效。EGFR敏感突变是药物有效的前提。但部分EGFR-TKI初始治疗有效的患者后期会发生耐药，与EGFR20号外显子突变密切相关。以NSCLC为例，EGFR20号外显子突变发生率为I. 6%,约占EGFR突变9%，50%的EGFR-TKI耐药由EGFR20号外显子的T790M点突变所致。由此可见，对EGFR基因18、19、20和21外显子进行分型检测可预测患者对吉非替尼和埃罗替尼的反应性，为临床医生给非小细胞肺癌初次治疗制定药物治疗方案提供依据，也可以根据20号基因型判断患者是否会产生继发耐药。综上所述，对EGFR基因18、19、20和21外显子进行分型检测可预测患者对吉非替尼和埃罗替尼的反应性，为临床医生给非小细胞肺癌初次治疗制定药物治疗方案提供依据，也可以根据20号基因型判断患者是否会产生继发耐药。开发快速、高效、准确、便捷、经济的检测EGFR基因多态性的试剂盒将为酪氨酸激酶抑制药的临床个体化治疗起到积极的推动作用。焦磷酸测序(Pyro sequencing)技术是新一代DNA序列分析技术,该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，是ー种通用型技术平台。该技术具有操作简便、检测成本低、所需样品量小、快捷、准确、高通量等特点，符合临床大样本检测要求。
发明内容
EGFR基因多态性是影响酪氨酸激酶抑制剂能否使用的最主要因素。本发明提供一种临床检测使用酪氨酸激酶抑制剂生物标志物的用药基因EGFR多态性的试剂盒及方法，以实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测酪氨酸激酶抑制剂个体化用药相关基因SNP。为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为
一种焦磷酸测序法检测EGFR基因多态性的试剂盒，包括如下引物 (1)扩增引物
EGFR exonl8 (SEQ ID NO. I)上游引物5、GTG ACC CTT GTC TCT GTG TTC TTG_3,(SEQ ID NO. 5)；
EGFR exonl9 (SEQ ID NO. 2)上游引物5、AGA TCA CTG GGC AGC ATG -3, (SEQ IDNO. 6)；
EGFR exon20 (SEQ ID NO. 3)上游引物5、TCT GCC TCA CCT CCA CCG T -3^ (SEQID NO. 7)；
EGFR exon21 (SEQ ID NO. 4)上游引物5,- CCA GGA ACG TAC TGG TGA AA -3, (SEQID NO. 8)；
EGFR exonl8 下游引物5、TTA TAC ACC GTG CCG AAC GC~3r (SEQ ID NO. 9)；
EGFR exonl9 下游引物5,- CCA CAC AGC AAA GCA GAA AC -3, (SEQ ID NO. 10)；EGFR exon20下游引物5、CTC CTT ATC TCC CCT CCC CGT ATC -3乂SEQ ID NO. 11)；EGFR exon21 下游引物5、TGA CCT AAA GCC ACC TCC TT -3^ (SEQ ID NO. 12)；
其中，下游引物的5,进行生物素标记；
(2)测序引物
EGFR exonl8 测序引物5Λ- AAA AAG ATC AAA GTG CTG -3^ (SEQ ID NO. 13)；
EGFR exonl9 测序引物5、TCC CGT CGC TAT CAA -3, (SEQ ID NO. 14)；
EGFR exon20 测序引物5、CCG TGC AGC TCA TCA -3^ (SEQ ID NO. 15)；
EGFR exon21 测序引物5、TTC TCT TCC GCA CCC -3^ (SEQ ID NO. 16)；
试剂盒中其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂。一种应用上述试剂盒检测EGFR基因多态性的方法，包括如下步骤
(O DNA提取；
(2)聚合酶链反应
配制 50 μ I PCR 扩增体系，包含10XPCR buffer O. 5μ I, dNTP 3·0μ1，上游引物
O.5 μ 1，下游引物O. 5 μ 1，rTaqO. 5μ 1，水38. 5μ 1，模板2. Ομ I ;按照下面的循环參数设置扩增仪95 0C 5min预变性；然后依次在95°C 30S, 52°C 30S, 60°C 30S,进行38个循环；再在72°C保持7min，最终保持在4 °C，得扩增产物；
(3)焦磷酸测序单链样本纯化；
(4)焦磷酸测序及结果分析。由于设计了特异性高的引物，并且选择了合适的方法，本发明的试剂盒适用于对酪氨酸抑制剂个体化用药基因进行快速检测，可广泛应用于临床上酪氨酸激酶抑制剂个体化用药方案制定的基因检测。与现有技术相比，其应用焦磷酸测序技术可以快速、准确地进行短DNA序列分析，便于构建标准化操作流程；具有高通量、低成本等特点；PCR产物即可直接用于测序，不需进行产物纯化等二次处理，操作极为简便，所需样品量小。
图I为本发明EGFR exonl8野生型焦磷酸测序结果；
图2为本发明EGFR exonl8突变型焦磷酸测序结果；
图3为本发明EGFR exonl9野生型焦磷酸测序结果；
图4为本发明EGFR exonl9突变型焦磷酸测序结果；
图5为本发明EGFR exon20野生型焦磷酸测序结果；
图6为本发明EGFR exon21野生型型焦磷酸测序结果； 图7为本发明EGFR exon21突变型焦磷酸测序結果。
具体实施例方式下面结合实施例对上述试剂盒及检测方法进行详细描述。实施例I :
EGFR exonl8 上游引物5、GTG ACC CTT GTC TCT GTG TTC TTG_3, (SEQ ID NO. 5)； EGFR exonl9 上游引物5,- AGA TCA CTG GGC AGC ATG -3, (SEQ ID NO. 6)；
EGFR exon20 上游引物5、TCT GCC TCA CCT CCA CCG T -3, (SEQ ID NO. 7)；
EGFR exon21 上游引物5、CCA GGA ACG TAC TGG TGA AA -3^ (SEQ ID NO. 8)； EGFR exonl8 下游引物5、TTA TAC ACC GTG CCG AAC GC~3r (SEQ ID NO. 9)；
EGFR exonl9 下游引物5,- CCA CAC AGC AAA GCA GAA AC -3, (SEQ ID NO. 10)；EGFR exon20下游引物5、CTC CTT ATC TCC CCT CCC CGT ATC -3乂SEQ ID NO. 11)；EGFR exon21 下游引物5、TGA CCT AAA GCC ACC TCC TT -3^ (SEQ ID NO. 12)；
其中，下游引物的5,进行生物素标记；
EGFR exonl8 测序引物5Λ- AAA AAG ATC AAA GTG CTG -3^ (SEQ ID NO. 13)；
EGFR exonl9 测序引物5、TCC CGT CGC TAT CAA -3, (SEQ ID NO. 14)；
EGFR exon20 测序引物5、CCG TGC AGC TCA TCA -3^ (SEQ ID NO. 15)；
EGFR exon21 测序引物5、TTC TCT TCC GCA CCC -3^ (SEQ ID NO. 16)；
I. DNA提取
I. I实验前试剂材料准备与检查工作如下
(I)检查试剂盒保质期以及确保Wash Buffer I和2中已添加こ醇，并在瓶上相应标识处打勾V; (2)异丙醇(如无，可用无水こ醇替代)和75%こ醇；(3)高压灭菌有效期内的I. 5mL Eppendorf管和各类移液枪头。I. 2从4°C冰箱中取出装有全血的EDTA抗凝管，上下颠倒数次混匀；
I. 3在I. 5mL Eppendorf管对应标本卩隹一性标识做好标记；
I. 4 分别移取 900uL Cell Lysis Solution 加至灭菌的 I. 5mL Eppendorf 管；
I. 5小心移取300uL全血转移至上述加有Cell Lysis Solution的I. 5mL EP管；
I.6盖上Eppendorf管盖，室温孵育IOmin ；
I.713, OOOrpm室温离心20秒；
I.8取出Eppendorf管,观察白色沉淀；
I.9开Eppendorf管盖，手持管底部，倾斜EP管ロ弃去部分红色上清，尽量将红色上清吸尽；
I. 10盖上Eppendorf管,用手指弹击EP管底部,使白色沉淀重悬；
1.11移取30011しNuclei Lysis Solution入上述Eppendorf管中，盖上管，上下颠倒数次混匀；
I. 12 打开 Eppendorf 管，移取 IOOuL Protein Precipitation Solution 入上述Eppendorf管中，盖上管管，振荡器上剧烈振荡20秒；13，OOOrpm室温离心3min ；
I. 13移取上清转移到新的已灭菌I. 5mL Eppendorf管；
I. 14移取300uL异丙醇入EP管，盖上管盖，上下颠倒数次混匀，可见白色絮状gDNA析
出； I. 15 13, OOOrpm 室温离心 Imin ；
I. 16打开Eppendorf管，手捏管底部，倾斜管ロ弃去上清；
I. 17移取300uL 75%こ醇加入Eppendorf管，盖上管盖，轻柔上下颠倒洗涤沉淀；
I. 18 13, OOOrpm 室温离心 Imin ；
I.19打开Eppendorf管，手持管底部，倾斜管ロ弃去上清；
I.20在实验台上放置新滤纸,倒扣Eppendorf管，吸干液体,将Eppendorf管开盖侧放风干；
I.21目测沉淀大小，加入50 IOOul DNA Rehydration Solution至沉淀；
1.22过夜溶解后用Nano-Space紫外分光光度计进行核酸浓度測定，核酸浓度大于50ng/ul视为合格，如浓度不够，加入こ醇再次沉淀DNA，然后重新加适量的DNARehydration Solution 溶解 DNA。I. 23在管壁和管盖上再次标清样本唯一性编号，并用透明胶带缠绕保护；
1.24保存核酸标本至4°C冰箱；
2.聚合酶链反应
2.I在试剂准备区配制50 μ I PCR扩增体系(模板添加除外)，各组分及添加量如下表
权利要求
1.一种焦磷酸测序法检测EGFR基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下引物 (1)扩增引物 上游引物GTG ACC CTT GTC TCT GTG TTC TTG -3^ ； 5r~ AGA TCA CTG GGC AGC ATG -3^ ； 5,- TCT GCC TCA CCT CCA CCG T -3,; 5r~ CCA GGA ACG TAC TGG TGA AA -3^ ； 下游引物5TTA TAC ACC GTG CCG AAC GC-3,； 5、CCA CAC AGC AAA GCA GAA AC -3,; 5r~ CTC CTT ATC TCC CCT CCC CGT ATC -3^ ； 5,- TGA CCT AAA GCC ACC TCC TT -3,;其中，下游引物的5,进行生物素标记； (2)测序引物5、AAAAAG ATC AAA GTG CTG -3^ ； 5,- TCC CGT CGC TAT CAA -3,； 5,- CCG TGC AGC TCA TCA -3,； 5,- TTC TCT TCC GCA CCC -3,。
2.ー种应用权利要求I所述的试剂盒检测EGFR基因多态性多态性的方法，包括如下步骤 (O DNA提取； (2)聚合酶链反应 配制 50 μ I PCR 扩增体系，包含10XPCR buffer O. 5μ I, dNTP 3·0μ1，上游引物O.5 μ I，下游引物O. 5 μ I，rTaqO. 5 μ I，水38. 5 μ I，模板2. O μ I ;按照下面的循环參数设置扩增仪95 0C 5min预变性；然后依次在95°C 30S, 52°C 30S, 60°C 30S,进行38个循环；再在72°C保持7min，最终保持在4 °C，得扩增产物； (3)焦磷酸测序单链样本纯化； (4)焦磷酸测序及结果分析。
全文摘要
本发明公开了一种焦磷酸测序法检测酪氨酸激酶抑制剂个体化用药基因多态性试剂盒及方法。具体是指EGFR外显子18、19、20、21多态性。试剂盒包含如SEQIDNO.3—16所示的引物。本发明的试剂盒，可以实现准确、快捷、高通量对EGFR突变进行检测，从而达到对酪氨酸激酶抑制剂用药实现安全合理有效的个体化给药。
文档编号C12Q1/68GK102676668SQ20121013536
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月4日 优先权日2012年5月4日
发明者周宏灏 申请人:周宏灏