专利名称：一种非解乳糖链球菌及其应用的制作方法
一种非解乳糖链球菌及其应用技术领域
本发明首次发现了一株非解乳糖链球菌LZMYFGM9，该菌株的拉丁文分类命名为Streptococcus alactolyticus ,该菌株已于2010年10月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏单位简称<6110，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏编号为CGMCC No. 4227。本发明涉及发酵领域，具体地，涉及一种非解乳糖链球菌{Streptococcusalactolyticus ) LZMYFGM9 CGMCC No. 4227 及其应用。
背景技术：
对非解乳糖链球菌的相关研究还较少，《伯杰氏细菌鉴定手册》也没有收录非解乳糖链球菌，1984年由Farraw等首次发现。1984年，Farrow等人利用遗传学分类方法将马肠链球菌/牛链球菌复合群(Streptococcus bovis/Streptococcus equinuscomplex)划分为6个不同的DNA群，其中，DNA群I包含马肠链球菌和牛链球菌。马肠链球菌与牛链球菌的全基因组和16SrDNA序列高度同源，属于同一个种。但命名上却难以统一，因为马肠链球菌的命名较早，而在医学中广泛用于代表这类菌株的是牛链球菌。DNA群2、3、4则对应于三个不同的未命名的基因种。DNA群5命名为解糖链球菌，DNA群6命名为非解乳糖链球菌。Schlegel等人将马肠链球菌/牛链球菌复合群进行了重新划分，认为该复合群包括7个不同的种和亚种，即马肠链球菌(S. equinus)、解没食子酸链球菌解没食子酸亚种(S. gallolyticus subsp. gallolyticus)、解没食子酸链球菌巴氏亚种(S. gallolyticus subsp. pasteurianus)、解没食子酸链球菌马其顿亚种(S.gallolyticus subsp . macedonicus)、婴儿链球菌婴儿亚种(S. infantarius subsp.infantarius)、婴儿链球菌结肠亚种(S. infantariussubsp. coli)和非解乳链球菌(S.alactolyticus)。而对于非解乳链球菌的变异种及应用则少之又少。黄芪多糖是中药黄芪有效成分，由a-糖甙键连接而成的分子量为37 500左右的植物多糖，水解后可检出葡萄糖、丰乳糖和阿拉伯糖，三种糖克分子比为1:0. 95:0. 70。黄芪多糖是一种有效免疫增强剂，并能诱导机体益生菌增殖，促进机体微生态平衡。研究报道表明黄芪多糖还具有增强细胞新陈代谢、促进血液循环、抗病毒、抗肿瘤、抗应激等保健功效，已被广泛应用作功能性配料或直接服用。目前，国内外市场上的黄芪多糖均靠提取而来，据资料查新可知的黄芪多糖提取方法有8种，包括传统的水提醇沉法、超微粉碎法、超声细胞粉碎法、超滤法、微波提取法、纤维素酶法、碱水提取法、醇碱提取法。传统水提醇沉法是目前最常用的提取方法，黄芪多糖的提取率平均为5. 34%左右；超微粉碎法，超微粉中黄芪多糖的提取率为4. 69%左右，而粗粉中黄芪多糖的提取率仅为2. 16%左右；超声细胞粉碎法黄芪多糖的提取率为7. 6%左右；微波提取法黄芪多糖的提取率为6. 55%左右；超滤法提黄芪多糖得率低于水提醇沉法，但产物中多糖含量高；碱水提取法得黄芪多糖的提取率在4. 7-19. 2%之间，稳定性较差；醇喊提取法得黄苗多糖的提取率最闻可达19. 15% ;纤维素酶法的黄苗多糖提取率闻于水提醇沉法，提取物多糖含量高，但因提取不稳定而没有科学的提取率参考数据。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供了一种非解乳糖链球菌及生产用的包含该菌株的发酵菌剂
一种非解乳糖链球菌{Streptococcus alactolyticus^) LZMYFGM9,该菌株的保藏编号为 CGMCC No. 4227。一种包含非解乳糖链球菌(Stre/ (ococctts alactoIyti cus) LZMYFGM9 CGMCCNo. 4227的发酵菌剂，所述发酵菌剂经以下步骤制得
(1)将非解乳糖链球菌alactolyticus) LZMYFGM9 CGMCC No. 4227 菌株接入MRS培养基斜面进行培养，接种量为IO3Cfu ；
(2)将步骤(I)得到的培养物接入一级或二级种子培养基，培养后得到发酵菌剂，接种量为 103cfu。具体地，所述步骤(I)的培养条件为时间16-20小时；环境厌氧发酵 ’温度:36. 5-37. 50C ;初始 pH :6. 0-6. 4。具体地，所述步骤(2)的培养条件为时间16-20小时；环境厌氧发酵 ’温度:
36.5-37. 50C ;初始 pH :5. 5-5. 9。非解乳糖链球菌(Stre/ (ococctts alac toIyticus )LZMYFGM9 CGMCC No. 4227 在提取黄芪多糖中的应用。相关实验
(一)非解乳糖链球菌alactoIyticus^LlWLVQW CGMCC No. 4227 的分离和筛选
准备6支无菌试管并编号后，分别加入9. 5mL样品稀释液(质量浓度0. 9%的生理盐水)。将兰州市上西园村16月龄健康蛋用土鸡宰杀后，从盲肠中取肠内容物，准确称取0. 50g加入编号I的试管中快速振荡混勻。从I号试管中吸取0. 5mL液体加入2号试管,快速振荡混匀后吸取0. 5mL加入3号试管，以此类推。将样品稀释成10'10_2、10_3、10_4、10_5、10_6 6个稀释度。准确吸取10_4、10_5、10_6 3个稀释度样品50 L接入事先准备好的改良GAM琼脂平板上，用涂布器快速涂布均匀后，放入厌氧罐。在厌氧罐中加入指示剂(美兰试纸)、催化齐IJ (钯粒)和产气袋(产气袋中主要成分为硼氢化钠、碳酸氢钠、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾)后密封培养，培养至平板长出成熟菌落。鉴定并分离纯化(溶血试验出现a溶血，生化鉴定出现苦杏仁苷、纤维二糖、七叶灵、果糖、半乳糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、甘露糖、蜜二糖、棉子糖、水杨苷、鹿糖和海藻糖的阳性反应；乳糖、接触酶、氧化酶、阿拉伯糖、葡萄糖酸钠、松三糖鼠李糖、核糖、山梨醇和木糖的阴性反应，并用划线培养挑单个菌落的方法纯化菌种)非解乳糖链球菌落，将菌落接种MRS琼脂斜面，并接种摇瓶，初筛利用硫酸-蒽酮法测定产黄芪多糖的转化率，根据摇瓶产黄芪多糖的转化率水平，选择转化率最高者，筛选出斜面出发菌种非解乳糖链球菌种FGMl。采用紫外线诱变处理，通过产黄芪多糖的转化率测定筛选得到优良的高产菌株，用于厌氧发酵黄芪多糖的生产。具体操作步骤如下菌种紫外诱变接种环挑取非解乳糖链球菌种FGMl斜面菌种于装有无菌水的三角瓶中，置于磁力搅拌器振荡均匀。将菌悬液倒入无菌平皿。打开平皿盖，在事先预热好的15W的紫外灯下30cm处照射0s、30s、60s、90s、120s、150s、180s、210s，不同照射剂量菌悬液稀释到10'再用生理盐水分别稀释菌悬液到10_3，吸取稀释好的菌悬液0. 05mL涂布5%黄芪MRS平板，每个稀释度涂布3个平板。置于厌氧罐中培养至长出成熟菌落，统计致死率。筛选选取平板菌落进行摇瓶培养，利用硫酸-蒽酮法测定转化率。转化率测定以5%黄芪粉溶液为底物，加入适量菌体细胞，总体积为20mL，置于三角瓶中在最适反应温度，转速为120r/min的恒温摇床中反应48h,取出于4000r/min台式离心机离心lOmin，取上清液，乙醇沉淀，取沉淀作为测定黄芪多糖含量物。从中筛选出黄芪多糖提取率稳定在10. 06%-15. 46%的高转化率菌株非解乳糖链球菌种(St印
alac tolyticus ) LZMYFGM9。
(二)利用非解乳糖链球菌(Stre/ (ococctts alactolyticus)LlWYQW 制备生产用的包含非解乳糖链球菌alac tolyti cus )LZMYFGM9 CGMCC No. 4227 的发酵菌剂
(I)将非解乳糖链球菌alactolyticus ) LZMYFGM9 CGMCC No. 4227 菌株(接种量为IO3Cfu)接入MRS培养基斜面进行培养时间16-20小时；环境厌氧发酵；温度36. 5-37. 50C ;初始 pH :6. 0-6. 4。MRS斜面培养基为市售商品，(生产厂家广东环凯微生物科技有限公司；批号200904172)其成份为1%蛋白胨，1%牛肉浸膏，0. 5%酵母粉，0. 2%枸橼酸二铵，2%葡萄糖，0. 5% 乙酸钠，0. 2% 磷酸氢二钾，0. 058% 的 MgSO4 7H20，0. 025% 的 MnSO4 4H20，0. 1% (V/V)的吐温80，pH6. 5，3%琼脂。(2)将上步得到的培养物(接种量为IO3Cfu)接入一级或二级种子培养基培养时间16-20小时；环境厌氧发酵；温度:36. 5-37. 5°C ;初始pH :5. 5-5. 9，培养后得到发酵菌剂。种子培养基为市售商品(生产厂家广东环凯微生物科技有限公司；批号201106293)，其成份为1%蛋白胨，1%牛肉浸膏，0. 5%酵母粉，0. 2%枸橼酸二铵，2%葡萄糖，0. 5% 乙酸钠，0. 2% 磷酸氢二钾，0. 058% 的 MgSO4 7H20，0. 025% 的 MnSO4 4H20，0. 1% (V/V)的吐温80，pH6. 5。本发明具有以下有益效果
本发明首次提出了非解乳糖链球菌alac tolyti cus ) LZMYFGM9 CGMCCNo. 4227，并将其扩大培养为生产用的发酵菌剂，该菌剂能够用于提取黄芪多糖，具有较高的提取率。本发明实用性强，操作简便，对发酵设备及生产条件没有特殊要求，利用一般发酵厂的设备和生产条件即可生产，投资少、见效快、效益高，不但适合于大规模的生产还适合于小批量的生产，具有广阔的实际应用前景。保藏信息
非解乳糖链球菌LZMYFGM9的拉丁文分类命名为Stre/ (ococctts alactolyticus ；
保藏日期2010年10月19日；
保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位简称=CGMCC ；
保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号；
保藏编号CGMCC No. 4227。
具体实施例方式(一)菌种实施例
非解乳糖链球菌{Streptococcus alactolyticus^) LZMYFGM9,该菌株的保藏编号为 CGMCC No. 4227，其形态为革兰氏阳性，镜检为球状或椭圆，呈链状排布，不形成芽孢。生理生化特性溶血试验出现a溶血，生化鉴定出现苦杏仁苷、纤维二糖、七叶灵、果糖、半乳糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、甘露糖、蜜二糖、棉子糖、水杨苷、蔗糖和海藻糖的阳性反应；乳糖、接触酶、氧化酶、阿拉伯糖、葡萄糖酸钠、松三糖鼠李糖、核糖、山梨醇和木糖的阴性反应。(二)包含非解乳糖链球菌LZMYFGM9的发酵菌剂的制备实施例 实施例I
(I)将非解乳糖链球菌alactolyticus ) LZMYFGM9 CGMCC No. 4227 菌株(接种量为IO3Cfu)接入MRS培养基斜面进行培养时间16小时；环境厌氧发酵；温度
37.50C ;初始 pH :6. 4。(2)将上步得到的培养物(接种量为IO3Cfu)接入一级或二级种子培养基培养时间16小时；环境厌氧发酵；温度37. 5°C ;初始pH 5. 9，培养后得到发酵菌剂。实施例2
(I)将非解乳糖链球菌alactolyticus ) LZMYFGM9 CGMCC No. 4227 菌株(接种量为IO3Cfu)接入MRS培养基斜面进行培养时间20小时；环境厌氧发酵；温度36. 50C ;初始 pH :6. O。(2)将上步得到的培养物(接种量为IO3Cfu)接入一级或二级种子培养基培养时间20小时；环境厌氧发酵；温度36. 5°C ;初始pH 5. 5，培养后得到发酵菌剂。实施例3
(I)将非解乳糖链球菌alactolyticus ) LZMYFGM9 CGMCC No. 4227 菌株(接种量为IO3Cfu)接入MRS培养基斜面进行培养时间18小时；环境厌氧发酵；温度370C ;初始 pH :6. 2。(2)将上步得到的培养物(接种量为IO3Cfu)接入一级或二级种子培养基培养时间18小时；环境厌氧发酵；温度37°C ;初始pH 5. 7，培养后得到发酵菌剂。(三)应用实施例
非解乳糖链球菌LZMYFGM9用于在发酵反应中提取黄芪多糖，具体如下
(I)将制备的包含非解乳糖链球菌alac tolyti cus ) LZMYFGM9 CGMCCNo. 4227的发酵菌剂转入提取黄芪多糖的发酵培养基，接入量为2%(V/V体积百分数)，置于厌氧罐中，于37摄氏度、120转/分条件下反应60小时，得到发酵产物。上述提取黄芪多糖的发酵培养基的成分及指标为乳清粉5. 158 g ;蛋白胨0. 456 g ;葡萄糖:0. 12 g ;酵母粉:0. 312 g ;无机盐(磷酸二氢钾和磷酸氢二钾):0. 194 g ；黄芪粉16 g;水200 ml，加入500ml的三角瓶，于高压锅中121 °C，20min灭菌，调整pH至6.9备用。(2)发酵完毕后，将发酵产物离心法将固液分离，分离后，上清部分用95%乙醇沉淀2次；沉淀部分用水煮后离心，取液体部分浓缩，再用95%乙醇沉淀2次；两部分沉淀提取物合并后冰冻干燥，称得提取物的重量为2. 365克，提取率为14. 78%，黄芪多糖含量为31. 22%。最后应说明的是以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明， 尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种非解乳糖链球菌(Stre/ (ococcys alactoIyticus) LZMYFGM9,该菌株的保藏编号为 CGMCC No. 4227。
2.一种包含非解乳糖链球菌(Stre/ (ococctts alac toIyticus ) LZMYFGM9 CGMCCNo. 4227的发酵菌剂，所述发酵菌剂经以下步骤制得 (1)将非解乳糖链球菌alactolyticus) LZMYFGM9 CGMCC No. 4227 菌株接入MRS培养基斜面进行培养，接种量为IO3Cfu ； (2)将步骤(I)得到的培养物接入一级或二级种子培养基，培养后得到发酵菌剂，接种量为 103cfu。
3.根据权利要求2所述的发酵菌剂，所述步骤(I)的培养条件为时间16-20小时；环境厌氧发酵；温度:36. 5-37. 50C ;初始pH :6. 0-6. 4。
4.根据权利要求2所述的发酵菌剂，所述步骤(2)的培养条件为时间16-20小时；环 境厌氧发酵；温度:36. 5-37. 5 0C ;初始pH :5. 5-5. 9。
5.权利要求I 所述非解乳糖链球菌alac toIyticus )LZMYFGM9 CGMCCNo. 4227在提取黄芪多糖中的应用。
全文摘要
本发明首次公开了一种非解乳糖链球菌(Streptococcusalactolyticus)LZMYFGM9，该菌株的保藏编号为CGMCCNo.4227，同时公开了包含该菌株的发酵菌剂及其应用。本发明提出的非解乳糖链球菌(Streptococcusalactolyticus)LZMYFGM9CGMCCNo.4227可用于黄芪多糖的提取，该方法具有实用性强、操作简便、效益高的优点，具有广阔的实际应用前景。
文档编号C12R1/46GK102676427SQ20121014182
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月9日 优先权日2012年5月9日
发明者孟嘉仁, 张凯, 张景艳, 李建喜, 杨志强, 王学智 申请人:中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所