专利名称：产中性植酸酶菌株的制备和发酵条件的制作方法
技术领域：
本发明所属微生物发酵研究开发技术领域。本发明涉及产植酸酶菌株的制备和发酵条件的研究，适合发酵エ业研究或エ业化生产。
背景技术：
植酸是1872年由prefer首先发现的，又名肌醇六磷酸酷，属于有机磷酸酯化合 物。为淡黄色或淡褐色浆状液体，几乎不以游离状态存在，在生物体内常以植酸盐的形式存在。它广泛地存在于植物种子中，尤以米糠中含量最高。植酸是从植物中或植物加工后剩余物中提取的，对人类健康不会产生不良影响，研究发现它具有广泛的用途，如在食品中有以下几方面的用途具有抗氧化作用，可与三价Fe鳌合防止豆油氧化、水解，抑制含油脂食品的酸败，所以可用其保存食油；植酸可以吸收微量金属，用于豆油的精炼，使之纯度增加；植酸作为蛋白质凝固剂，用于制作豆腐，加入O. 20-0. 10%，使之具有独特结构和风味，提高成品率、质量、保存性.在蛋及蛋制品加热过程中，可以消除因发生硫化氢而造成的变黑现象；植酸在腌咸白菜、罗卜时，加入O. 1%，使之色泽明亮，质量改善；植酸用于青豆、玉米豆等水煮罐头，具有很强保鲜作用，同时植酸可以防止罐头食品在加热杀菌过程中产生的硫化氢与食物本身存在铁、铜元素及从罐头表面溶解下来的锡等金属结合生成硫化物可导致食品变色；植酸钙可作为葡萄酒发酵期，发泡期的发酵助长剂，善色、香味；植酸在速溶咖啡中能抗浮渣，抗泡沫，还可以增进酱油、豆浆及腌制品风味，防止变色等。虽然植酸在食品エ业中具有较多作用，但由于人和动物的消化道不能产植酸酶，大量未被利用的植酸磷排入环境，造成水域的富营养化；同吋，植酸是一种广谱性的抗营养因子，可与钙、镁、锌、钾等矿物质元素结合成不溶性盐类，而降低了植物的营养和价值，它还可以络合蛋白质，抑制多种消化酶的活性。植酸酶(phytase)也称肌醇六憐酸酶(myo-inositolhexaphoshatephosphohydrotase),它是催化植酸及其植酸盐水解产生肌醇和磷酸(或者磷酸盐)ー类酶的总称。它分两类，ー是3-植酸酶(EC 3. I. 3. 8)，ニ是6-植酸酶(EC 3. I. 2. 6)。它是ー种新型、绿色环保的饲料用酶。植酸酶可释放植酸中磷份，提高了人和动物对磷的吸收利用率，减少排泄物中有机磷的含量。目前，对酸性植酸酶研究较多，酸性植酸酶有效作用范围在2. 5 5. 5之间，所以它仅适用于单胃动物畜禽及少数鱼类如虹鳟等，但不适于消化道为中性的鲤科鱼类。对中性植酸酶目前还缺乏较深入的研究，故我们从土壤筛选出产中性植酸酶的高产菌株，对其进行分子生物学鉴定，并对其产酶的发酵条件进行了研究。
发明内容
I.本发明涉及产中性植酸酶菌株的制备和产中性植酸酶的发酵方法，其特征在产中性植酸酶菌株的制备和产中性植酸酶的发酵方法，包括以下过程步骤(一)土壤样品稀释到10_4或10_5并均匀涂布到筛选培养基，培养3 4d，挑选带透明圈的菌株接种于细菌营养肉汁平板培养基，划线分离；步骤(ニ)将步骤(一)单菌落点种于筛选培养基，培养3 4d，选择直径比大的单菌落，编号后接入斜面种子培养基，以备复筛和鉴定；步骤(三)挑取步骤(ニ)编号为phy7的初筛菌株接种于细菌营养肉汁培养基，30°C摇振培养3-5d，提取菌株的总DNA作为模板，利用细菌通用引物进行PCR反应，纯化；步骤(四)将步骤(三)纯化后的PCR产物送上海生エ生物技术公司测序。将测得的核苷酸序列输入GenBank数据库，进行Blast比对，获取与试验菌16S rDNA基因序列相似度高的菌种。采用ClustalW进行多序列比对，通过Mega4. O. 2软件计算出序列的系统进化距离，Neighbor-Joining法构建系统进化树；
步骤(五)挑取步骤(ニ)编号为phy7的初筛菌株接种于发酵培养基，改变碳源、氮源、磷源、金属离子的种类，在30-40°C、150r/min振荡发酵培养20-24h，分别測定其发酵液酶活，再以对产酶影响最大的4个因子的3个水平，采用L9 (34)正交表进行实验分析；步骤(六)挑取步骤(ニ)编号为phy7的初筛菌株接种于发酵培养基，改变发酵温度、培养时间、接种量、培养基初始pH、三角瓶装液量，在30-40°C、150r/min振荡发酵培养20-24h分别测定其发酵液酶活，再以对产酶影响最大的3个因子的3个水平，采用L9 (33)正交表进行实验分析。2.根据本发明所述，phy7菌株的16S rDNA序列长度为1489bp，GenBank登陆号为JN408760,属于绿脓假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)属。该菌株分泌中性植酸酶,其最适反应pH为7. O、最适反应温度为40°C，在40°C、以植酸钠为底物的Km值为0. 26mmol/L, Vmax为0. 0506nmol/min。金属离子Zn2+、Al3+、Cu2+、Mn2+等对该酶有抑制作用，而Fe2+等则有一定的激活作用。3.根据本发明所述，phy7菌株的优化培养基为(g/L):可溶性淀粉40、胰蛋白胨10、NaN02 8 . 6, NH4NO3 5. (KK2HPO4 0. 10, KCl 0. 10、MgCl2O. 10、MnCl2 0·09，ρΗ6·0。在发酵温度30°C，150r/min,装液量IOOmL (250ml三角瓶)，接种量7 %，发酵24h后酶活最高，为230. 2U/mL,比未优化前提高了 2. 13倍。
图I是菌phy7 16S rDNA PCR扩增结果的图；图2是邻接法构建的菌株phy7 16S rDNA的系统发育树图；图3是不同pH对酶活的影响图；图4是pH对酶稳定性的影响图；图5是温度对产酶的影响图；图6是温度对酶稳定性的影响；图7是植酸酶的Km和Vmax ;图8是金属离子对植酸酶活性的影响图；图9是不同碳源对产酶的影响图；图10是不同碳源对产酶的影响图；图11是不同磷源对产酶的影响图；图12是不同金属离子对产酶的影响图；图13是起始pH对产酶的影响图；图14是发酵温度对产酶的影响图；图15是接种量对产酶的影响图；图16是装液量对产酶的影响图。
具体实施例方式本发明所述的涉及产植酸酶菌株的制备和发酵条件包括以下实施例，下面的实施例可进ー步说明本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例I :步骤(一)土壤样品稀释到10_4并均匀涂布到筛选培养基，培养3d，挑选带透明圈的菌株接种于细菌营养肉汁平板培养基，划线分离；步骤(ニ)将步骤(一)单菌落点种于筛选培养基，培养3d，选择直径比大的单菌落，编号后接入斜面种子培养基，以备复筛和鉴定；步骤(三)挑取步骤(ニ)编号为phy7的初筛菌株接种于细菌营养肉汁培养基，30°C摇振培养3d，提取菌株的总DNA作为模板，利用细菌通用引物进行PCR反应，纯化；步骤(四)将步骤(三)纯化后的PCR产物送上海生エ生物技术公司测序。将测得的核苷酸序列输入GenBank数据库，进行Blast比对，获取与试验菌16S rDNA基因序列相似度高的菌种。采用ClustalW进行多序列比对，通过Mega4. O. 2软件计算出序列的系统进化距离，Neighbor-Joining法构建系统进化树； 步骤(五)挑取步骤(ニ)编号为phy7的初筛菌株接种于发酵培养基，改变碳源、氮源、磷源、金属离子的种类，在30°C、150r/min振荡发酵培养20h，分别测定其发酵液酶活，再以对产酶影响最大的4个因子的3个水平，采用L9(34)正交表进行实验分析；步骤(六)挑取步骤(ニ)编号为phy7的初筛菌株接种于发酵培养基，改变发酵温度、培养时间、接种量、培养基初始pH、三角瓶装液量，在30°C、150r/min振荡发酵培养20h，分别测定其发酵液酶活，再以对产酶影响最大的3个因子的3个水平，采用L9 (33)正交表进行实验分析。实施例2 步骤(一)土壤样品稀释到10_6并均匀涂布到筛选培养基，培养4d，挑选带透明圈的菌株接种于细菌营养肉汁平板培养基，划线分离；步骤(ニ)将步骤(一)单菌落点种于筛选培养基，培养4d，选择直径比大的单菌落，编号后接入斜面种子培养基，以备复筛和鉴定；步骤(三)挑取步骤(ニ)编号为phy7的初筛菌株接种于细菌营养肉汁培养基，30°C摇振培养5d，提取菌株的总DNA作为模板，利用细菌通用引物进行PCR反应，纯化；步骤(四)将步骤(三)纯化后的PCR产物送上海生エ生物技术公司测序。将测得的核苷酸序列输入GenBank数据库，进行Blast比对，获取与试验菌16S rDNA基因序列相似度高的菌种。采用ClustalW进行多序列比对，通过Mega4. O. 2软件计算出序列的系统进化距离，Neighbor-Joining法构建系统进化树；步骤(五)挑取步骤(ニ)编号为phy7的初筛菌株接种于发酵培养基，改变碳源、氮源、磷源、金属离子的种类，在40°C、150r/min振荡发酵培养24h，分别测定其发酵液酶活，再以对产酶影响最大的4个因子的3个水平，采用L9(34)正交表进行实验分析；步骤(六)挑取步骤(ニ)编号为phy7的初筛菌株接种于发酵培养基，改变发酵温度、培养时间、接种量、培养基初始pH、三角瓶装液量，在40°C、150r/min振荡发酵培养24h分别测定其发酵液酶活，再以对产酶影响最大的3个因子的3个水平，采用L9(33)正交表进行实验分析。附实验例证I中性植酸酶菌株的筛选及鉴定I材料与方法
I. I材料与试剂I. I. I产植酸酶菌株分离样品威海郊区玉米地肥沃土壌、麸皮、发芽小麦混匀并放置20余天后的混合物。I. I. 2试剂植酸钠p-0109 (sigma公司)，植酸钙(湖北三鑫生物工程有限公司)，DNA分子标准及试剂盒、Taq DNA聚合酶和DNase I (TaKaRa公司)，其他试剂均为分析纯。1.1.3 培养基细菌营养肉汁平板(g/L):蛋白胨10、牛肉膏3、NaCl 5、琼脂15 20，ρΗ7· O植酸钙筛选平板(g/L):葡萄糖20、CaCl2 2、NH4N03 5,KCl O. 5、MgS04 · 7H20 0.5、FeSO4 · 7H20 0. Olg、MnSO4 · H2O 0. Olg、植酸钙 I、琼脂 15、ρΗ7· 0 产酶培养基(g/L):可溶性淀粉40、胰蛋白胨 10、NaNO2 8. 6、NH4NO3 5. O、K2HPO4O. 10、KCl O. 10、MgCl2 O. 10、MnCl2 O. 09，ρΗ7· OI. 2 方法I. 2. I产中性植酸酶菌株的初筛将士壤样品稀释到10_4或10_5并均匀涂布到筛选培养基，培养3 4d后将产生透明圈的菌株接种于细菌营养肉汁平板培养基，划线分离。然后将单菌落点种于筛选培养基，培养3 4d后測量直径比(直径比=透明圈直径/菌落直径)。选择直径比大的单菌落，编号后接入斜面种子培养基，以备复筛和鉴定。I. 2. 2菌株的复筛挑取初筛菌株接种于细菌营养肉汁培养基，30°C摇振培养24h后，按10%接种量接种于IOOml的产酶培养基中，300C、150r/min摇振培养5d，每24h取5mL培养液，3000r/min离心去菌体，上清液利用截留分子量为10000U的透析袋在去离子水中透析3 4h，将得到的去除无机磷m的酶液用于酶活性測定。I. 2. 3菌种鉴定提取菌株的总DNA作为模板[8_9]，利用细菌通用引物上游引物Bac. 27-F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和下游引物为Bac. 1492-R(5’_GGTTACCTTACGACTT-3，)[10]扩增菌株 16S rDNA 片段。PCR 的反应体系为 25 μ L 12. 5μ L ddH20, 2. 5 μ L10XPCR反应缓冲液，2μ L dNTP混合物，I μ L上游引物，I μ L下游引物，5μ L总DNA，I μ L TaqTMDNA聚合酶。PCR反应条件94°C预变性5min，94°C变性30s，55. 4°C退火30s，72°C延伸90s，30个循环；72°C延伸10min，4°C保存。纯化后PCR产物送上海生エ生物技术公司测序。将测得的核苷酸序列输入GenBank数据库，进行Blast比对，获取与试验菌16S rDNA基因序列相似度高的菌种。采用ClustalW进行多序列比对，通过Mega4. O. 2软件计算出序列的系统进化距离，Neighbor -Joining法构建系统进化树。I. 2. 4酶活測定方法采用硫酸亚铁-钥蓝法測定酶活m。酶活性単位(U)定义为在一定条件下，毎分钟释放出Inmol无机磷所需的酶量为ー个酶活性単位，用U表示，单1AA为 nmol/min。I. 2. 5植酸酶的部分性质I. 2. 5. I最适pH和pH稳定性酶作用的最适pH值和pH值稳定性将植酸钠用缓冲液配制成不同pH(3. 0-9.0)值的底物溶液进行酶促反应，測定粗酶液的酶活。最高酶活カ时的pH值即为最适pH值。采用不同pH值(3.0-10.0)的缓冲液在37°C条件下处理酶溶液30min，在常规条件下测定酶活力，并计算相对酶活力，考察酶在37 °C条件下的pH值稳定性。
I. 2. 5. 2酶作用的最适温度和酶的热稳定性在不同温度条件下(25_60°C )进行酶促反应，測定酶活力。最高酶活力时的温度即为酶作用的最适温度。在不同温度条件下(30-550C )处理粗酶液60min，再在40°C下进行反应后测定剩余酶活，计算相对酶活，考察酶在不同温度下处理60min后的稳定性。I. 2. 5. 3在植酸钠溶液中添加不同的无机金属离子(Mn2+、Mg2+、Fe2+、Cu2+、Zn2+、Al3+)使其终浓度达到2mmol/L，以不加离子时所测得酶活作为对照，在40°C下反应30min后测酶活，然后计算出相对酶活，研究金属离子对酶活力的影响。2结果与分析2. I菌株筛选初筛土样经过筛选培养基涂布、富集培养、多次划线分离和点种筛选，共初筛出21株植酸酶产生菌，其中透明圈与菌落直径比值较大的有10株(以phy代表植酸酶菌株)。 然后对初筛菌株进行摇瓶复筛，测其酶活。结果如表I。表I各菌株直径比和酶活对照(酶活单位IU/ml)
菌株phy. I phy. 2Phy3Phy4Phy5
直径比-1.92.52.02.12.3
酶活86.1 _97.4 _84.8 _ 91.4 _87.4 _
菌株 Phy 6 Phy 7 Phy8 Phy 9 PhylO直径比 2.5 2.5 2.4 2.0 2.2_酶活ー 68.58 _100.9_91. 2 _72.3 _108.9由表I可以看出，所筛选出的10个菌株的透明圈与菌落直径比均在I. 9 2. 5之间。得到酶活大于100IU/mL的菌株有2株，即菌株phy7和phy 10。2. 2菌株鉴定根据透明圈大小和酶活大小综合考虑，我们选择phy7为研究菌，并对其进行分子生物学鉴定。2. 2. IPCR 扩增结果对phy7染色体DNA进行PCR扩增后，在1500bp左右处有一明亮的特征条带(细菌16S rDNA平均大小为1540bp)，经过琼脂糖凝胶电泳验证了该扩增产物的存在和大小(图I)，从图I可以得出phy7的16S rDNA序列长度为1489bp。2. 2. 2测序结果及同源性分析测序结果表明，phy7的16S rDNA序列长度为1489bp，将其序列送交GenBank，其登陆号为JN408760。将该株细菌测序结果在GenBank数据库中进行Blast，下载与phy7的16S rDNA相似性高的菌株的序列，进行系统发育树分析，结果见图2。根据16S rDNA的序列分析与系统发育树的构建结果可以得出该菌属于假单胞菌属(pseudomonas),并且从系统发育树看出phy7与绿脓假单胞菌位于同一分支上,相似度近100 %，所以该菌可能是绿脓假单胞菌的ー个相似种。2. 3植酸酶的部分性质研究2. 3. I植酸酶的最适pH和pH稳定性底物植酸钠用不同pH的含lmmol/L CaCl2的0. 25mmol/L的缓冲液配制。ρΗ3· O、4. O、5. O、6. O、7. O为磷酸氢ニ钠-柠檬酸缓冲液；ρΗ7. 5、8. 0、8. 5、9. O为Tris-HCl缓冲液；pH 9. 5、10. O、10. 5为碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液。每组三个平行，于37°C下反应30min后测定酶活性，结果见图3。并在上述各种不同pH的缓冲液中，于37°C条件下处理30min后测定相对酶活性，以研究酶的PH稳定性，结果见图4。由图3可以看出，该酶作用的最适pH为7. 0，高于或低于7. O酶活都会降低，所以菌株phy7所产植酸酶为中性植酸酶。由图4可以看出，该酶在pH5 8. O的范围内，剩余酶活性保持在80%以上，而pH低于5. O和高于8. 5时酶活性迅速下降，到pH3. O和9. 5时，酶活性已经剩余不到15%,pH10时已基本无酶活。说明该酶pH耐受范围为也近中性pH附近。2. 3. 2最适温度及热稳定性在不同温度(25°C 60°C )下进行酶促反应，每组三个平行，反应30min后测其酶活性，结果见图5。将中性植酸酶在不同温度(30°C 55°C )下处理60min，再在37°C下进行反应后测定剩余酶活，计算相对酶活(三个平行实验的平均值)，结果见图6。由图5可以看出，该酶作用的最适温度为40°C，高于或低于此温度酶活都会降低。由图6可以看出40°C以下处理60min后，酶活基本不变，相对酶活仍近100% ;45°C处理60min仍保持约93%的相对酶活；而高于45°C时酶的剩余活性开始迅速下降；到55°C时剩余酶活性已经很低了(约20%)。所以该酶不耐45°C以上的高温。2. 3. 3 植酸酶的 Km 与 Vmax用不同浓度(O. 1-0. 5mmol/L)的植酸钠为底物，在Tris-HCl (pH7. 5)缓冲液体系中，40°C下测定酶活性，利用双倒数作图法得图7.由图7可以得出该酶在本实验条件下，以植酸钠为底物的Km为O. 26mmol/L,Vmax为 O. 0506nmol/min。2. 3. 4金属离子对中性植酸酶活性的影响在酶促反应体系中加入不同的无机金属离子(Mn2+、Mg2+、Fe2+、CU2+、Zn2+、Al3+)使其终浓度达到2mmol/L，以不加离子时所测得酶活作为对照，在40°C下反应30min后测酶活，然后计算出相对酶活，得到不同离子对酶活性的影响，结果见图8。由图8可以看出，Fe2+对该酶有促进作用，它可能是该中性植酸酶的激活剂；Mg2+、Mn2+对酶活有抑制作用，但作用强度较弱；而Zn2+、Al3+、Cu2+对酶有很大的抑制作用，能够使12-20%的酶活丧失，可能是由于这些离子能和植酸发生很强的络合作用所制。3 结论从天然土壤中筛选出20余株产中性植酸酶活性的菌株，对其中一株(phy7)经16S rDNA分子学鉴定,该菌属于假单胞菌属(pseudomonas),初步确定为该属的绿脓假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)的相似种；该菌所产植酸酶为中性,其反应最适pH为7. O,最适温度为40°C ;在40°C下以植酸钠(p-0109)为底物的Km值为0. 26mmol/L、Vmax为0. 0506nmol/min ;金属离子Zn2+、Al3+、Cu2+、Mg2+、Mn2+等对该酶有抑制作用，而Fe2+等则有一定的激活作用。实验例证2—株绿脓假单胞菌产中性植酸酶发酵条件研究I材料与方法I. I材料与试剂
I. I. I菌株从土壤分离出产中性植酸酶高产菌株，选用经16S rDNA鉴定为假单胞杆菌属的ー株(Phy7)为实验菌。I. I. 2主要试剂植酸钠p-0109 (购自sigma公司)，植酸钙(湖北三鑫生物工程有限公司)，其他试剂均为分析纯。I. I. 3 培养基(g/L):麸皮 100，(NH4)2SO4 O. 4，MgSO4 · 7H20 O. 2，KH2PO4 O. 05，K2HPO4 O. 1，CaCl22，胰蛋白胨 10，ρΗ7· O.I. 2 方法
I. 2. I培养基成分对产酶的影响用不同的碳源、氮源、磷源、金属离子作单因子实验，再以对产酶影响最大的4个因子的3个水平，采用L9(34)正交表进行实验分析。I. 2. 2培养条件对产酶的影响用不同的发酵温度、培养时间、接种量、培养基初始pH、三角瓶装液量做单因子实验，再以对产酶影响最大的3个因子的3个水平，采用L9(33)正交表进行实验分析。I. 2. 3酶活測定方法采用硫酸亚铁-钥蓝法測定酶活M，略加修改。酶活性単位(U)定义为在一定条件下，毎分钟释放出Inmol无机磷所需的酶量为ー个酶活性単位，用U表不，单位为nmol/min。2结果与分析2. I培养基组成对产酶的影响2. I. I不同碳源对产酶的影响以质量分数为4%的麦芽糖、壳聚糖、蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、麸皮分别代替产酶培养基中的碳源，在30°C、150r/min振荡发酵培养24h，測定其发酵液酶活，结果见图9。图9表明可溶性淀粉作为碳源，酶活最高，可达183U/mL，其它几种影响差异不大。2. I. 2不同氮源对产酶的影响以酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母浸出粉、尿素、(NH4)2SO4 · 7H20、NH4NO3,NaNO2分别代替产酶培养基中的氮源。以O. 5 %的NH4NO3中的含氮量为标准来添加其他氮源。在30°C、150r/min振荡发酵培养24h，测定其发酵液酶活，结果见图10。由图10可以看出，用NaNO2作为氮源，酶活最高，活力单位可达218. 6u/mL酶液。胰蛋白胨和NH4NO3效果也较好，其他氮源酶活略低。较好的几个氮源顺序为=NaNO2 >胰蛋白胨> NH4NO3 >牛肉膏。2. I. 3不同磷源对产酶的影响以Na3P04、KH2PO4、K2HPO4、ΚΗ2Ρ04+Κ2ΗΡ04及空白作为产酶培养基中的磷源。以O. 01 %的K2HPO4中的含磷量为标准来添加其他磷源。在30°C、150r/min振荡发酵培养24h，測定其发酵液酶活，结果见图11。由图11看出只有K2HPO4对产中性植酸酶有促进作用，其他组合都对酶活有抑制作用，因此选用K2HPO4作为添加的磷源。2. I. 4不同金属离子对产酶的影响分别添加O. 5mmol/L 的 Mn2+、Mg2+、Fe2+、Cu2+、Ca2+、K+、Zn2+、Ba2+ 到产酶培养基，在同一条件下进行发酵培养，測定其发酵液酶活。结果如图12。由图11看出K+、Mg2+、Mn2+、Ca2+对酶有激活作用，使酶的活性分别提高35. 8%、16.4%、13. 4%和 11.9% ;Cu2+、Fe2+、Zn2+、Ba2+对酶活性具有抑制作用。
2. I. 5四因素正交试验根据单因素试验結果，选取对酶活影响较大的可溶性淀粉(A)、胰蛋白胨(B)、K2HPO4(C)和K+(D)四因素的3水平正交试验，结果见表I。表I可溶性淀粉、胰蛋白胨、KH2PO4, K+三因素正交实验数据
权利要求
1.本发明涉及产中性植酸酶菌株的制备和产中性植酸酶的发酵方法，其特征在产中性植酸酶菌株的制备和产中性植酸酶的发酵方法，包括以下过程 步骤(一)土壤样品稀释到10_4或10_5并均匀涂布到筛选培养基，培养3 4d，挑选带透明圈的菌株接种于细菌营养肉汁平板培养基，划线分离； 步骤(二)将步骤(一)单菌落点种于筛选培养基，培养3 4d，选择直径比大的单菌落，编号后接入斜面种子培养基，以备复筛和鉴定； 步骤(三)挑取步骤(二)编号为phy7的初筛菌株接种于细菌营养肉汁培养基，30°C摇振培养3-5d，提取菌株的总DNA作为模板，利用细菌通用引物进行PCR反应，纯化； 步骤(四)将步骤(三)纯化后的PCR产物送上海生工生物技术公司测序。将测得的核苷酸序列输入GenBank数据库，进行Blast比对，获取与试验菌16S rDNA基因序列相似度高的菌种。采用ClustalW进行多序列比对，通过Mega4. 0. 2软件计算出序列的系统进化距离，Neighbor-Joining法构建系统进化树； 步骤(五)挑取步骤(二)编号为Phy7的初筛菌株接种于发酵培养基，改变碳源、氮源、磷源、金属离子的种类，在30-40°C、150r/min振荡发酵培养20_24h，分别测定其发酵液酶活，再以对产酶影响最大的4个因子的3个水平，采用L9(34)正交表进行实验分析；步骤(六)挑取步骤(二)编号为Phy7的初筛菌株接种于发酵培养基，改变发酵温度、培养时间、接种量、培养基初始pH、三角瓶装液量，在30-40°C、150r/min振荡发酵培养20-24h分别测定其发酵液酶活，再以对产酶影响最大的3个因子的3个水平，采用L9 (33)正交表进行实验分析。
2.根据本发明所述，phy7菌株的16SrDNA序列长度为1489bp，GenBank登陆号为JN408760,属于绿脓假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)属。该菌株分泌中性植酸酶,其最适反应pH为7. O、最适反应温度为40°C，在40°C、以植酸钠为底物的Km值为0. 26mmol/L, Vmax为0. 0506nmol/min。金属离子Zn2+、Al3+、Cu2+、Mn2+等对该酶有抑制作用，而Fe2+等则有一定的激活作用。
3.根据本发明所述，phy7菌株的优化培养基为(g/L):可溶性淀粉40、胰蛋白胨10、NaNO2 8. 6、NH4NO3 5. O、K2HPO4 0. 10、KCl 0. 10、MgCl2O. 10、MnCl2O. 09，pH6. O。在发酵温度30°C，150r/min，装液量IOOmL(250ml三角瓶)，接种量7 %，发酵24h后酶活最高，为.230. 2U/mL,比未优化前提高了 2. 13倍。
全文摘要
本发明所属微生物发酵研究开发领域。本发明涉及产植酸酶菌株的制备和发酵条件土壤样品稀释到10-4或10-5并均匀涂布到筛选培养基，经复筛得到菌株phy7；phy7经16S rDNA鉴定，得到该菌株的16S rDNA序列长度为1489bp，GenBank登陆号为JN408760，属于绿脓假单胞菌属；该菌株分泌中性植酸酶，其最适反应pH为7.0、最适反应温度为40℃，以植酸钠为底物的Km值为0.26mmol/L，Vmax为0.0506nmol/min；菌株的优化培养基为(g/L)可溶性淀粉40、胰蛋白胨10、NaNO28.6、NH4NO35.0、K2HPO40.10、KCl0.10、MgCl20.10、MnCl20.09，pH6.0。在发酵温度30℃，150r/min，装液量100mL(250ml三角瓶)，接种量7％，发酵24h后酶活最高，为230.2U/mL，比未优化前提高了2.13倍。本发明制备方法简单，操作方便，得到的菌株反应条件温和，酶活高，用途广泛。
文档编号C12N9/16GK102676428SQ20121014393
公开日2012年9月19日 申请日期2012年4月29日 优先权日2012年4月29日
发明者朱启忠 申请人:山东大学威海分校