专利名称：一种获取α-亚麻酸的内生菌发酵工艺技术的制作方法
技术领域：
本发明属于天然食药原料的制备技术及其应用领域，具体涉及的是α-亚麻酸原料的制备技术与方法。
背景技术：
α -亚麻酸，学名 9,12,15-十八碳三烯酸(cis 9,12,15-oc-tadecatrienoicacid)，为全顺式，非共轭立体构型，分子式为C18H3tlO2,性状为淡黄色油状液体。α -亚麻酸作为人体必需脂肪酸，是体内各组织生物膜的结构材料，也是合成人体一系列前列腺素的前体。正常人体从食物中摄取α-亚麻酸后，经Λ6-脱氢酶、碳链延长酶等的作用，生成一系列代谢产物，其中最重要的是ΕΡΑ(全顺式-5，8，11，14，17-二十二碳五烯酸)和DHA (全顺式-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸)。EPA是体内三烯前列腺素(如PGI3，TXA3)前体，DHA是大脑、视网膜等神经系统磷脂的主要成分。当人体摄取过量饱和酸或出现其它代谢紊乱时，体内的△ 6-脱氢酶受到抑制，从而影响亚麻酸的转化，导致各种疾病发生。近年来，通过国内外大量的研究和流行病学调查显示，α -亚麻酸不仅是维持大脑和神经功能必需的因子，同时具有降血脂、预防和治疗冠心病、动脉硬化、某些癌症的发生以及抗氧化、清除自由基等功能，是当前的研究热点之一。因此，及时补充α-亚麻酸对保证体内正常代谢和保持健康具有重要意义。正常人体需每日平均摄取α -亚麻酸约I. 5g。然而，医学和营养学家根据膳食结构的流行病学调查证实，目前人群日摄入量不足世界卫生组织(WHO)推荐量(1.25g)的一半，提示人类普遍缺乏α-亚麻酸。对此，WHO和联合国粮农组织(FAO)曾于1993年发表联合声明鉴于α-亚麻酸的重要性和人类普遍缺乏的现状，决定在世界范围内专项推广膳食补充α-亚麻酸。但迄今为止α-亚麻酸不能人工合成，其人体中α-亚麻酸来源的唯一途径只能依赖从自然食物中摄入，如各种含有α-亚麻酸的籽油等。但与之矛盾主要问题一是α -亚麻酸主要存在于豆科类植物的种籽中，其分离和提纯工艺技术非常困难，且成本很高；二是食物中α-亚麻酸含量指数、结合状态和体内吸收等因素不清，难以制订膳食中α -亚麻酸含量SOP ;三是全球每年食品、医药对高纯度α -亚麻酸原料的需求量缺额高达2千吨。由此可见，探讨和创建高纯度α-亚麻酸原料的制备工艺技术具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于为食品和医药提供α-亚麻酸原料，并通过如下制备工艺实现其目标，以满足市场的巨大需求。为实现上述目的，采用的工艺技术策略是外植体发菌，单克隆菌株发酵液培养，筛选α -亚麻酸高产量菌株，高产菌株发酵培养获得原料液，分离富集α -亚麻酸。
具体实施方案
I、外植体发菌取流水冲净藿香茎杆、叶片若干，蒸馏水冲洗后，浸于70 %乙醇中30s，再浸于
O.I % HgCl2溶液中浸泡5min。取出后经无菌水冲洗三遍，剪成茎段、叶片块，将创口贴于培养基，接种到MS固体培养基上23°C避光发菌5d 15d ;生成大量菌落，取菌落直径3cm左右备用。2、单克隆菌株发酵液培养分别从直径3cm以上的菌群边缘，用接种环挑取菌丝，并接种于PDA液体培养基，230C，120rpm暗培养5d 15d，获得基因一致的单克隆菌液。3、筛选α-亚麻酸高产量菌株通过高效液相色谱法检测内生菌单克隆发酵液中α-亚麻酸含量。色谱条件与系统使用性试验用固定相为C18柱(4.6mmX200mm，5ym);流动相为乙腈I %醋酸溶液(90 10);检测波长为205nm ;流速为I. Oml/min ;柱温25°C;进样量20 μ L，理论塔板数按α -亚麻酸峰计算应不少4000。对照品溶液的制备精密量取α -亚麻酸标准品适量，用乙腈1%醋酸溶液(9 I)制成每Iml含O. 5mg的溶液，即得。供试品溶液的制备，取内生菌发酵液2ml置于IOml的容量瓶中，用流动相进行定容，超声处理20分钟，从IOml容量瓶中取Iml定容到10ml，再从上步取2. 5ml置于5ml的容量瓶中，用流动相定容。测定法，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20ul，注入液相色谱仪进行检测。根据检测结果，从大量候选菌株中筛选得到α-亚麻酸高产量菌株。4、高产菌株发酵培养获得原料液高产菌株发酵培养获得原料液将筛选得到α -亚麻酸高产量菌株接种到到液体PDA培养基中暗培养，23°C、120rpm。在液体培养过程中应注意及时进行继代培养，因为在有限的营养环境中培养物生长到一定时期将进入分裂的静止期。通常在培养到第18d 25d时达到最大密度，此时可以收获原料液，并应进行第一次继代培养。在继代培养时，应将较大的团块和接种物残渣除去。5、分离富集α -亚麻酸 SFE CO2超临界萃取将所得发酵液装入萃取釜，进行超临界CO2萃取。萃取压力为32Mpa，萃取温度为45°C ;分离压力为5 lOMpa，分离温度为35°C ；C02流量为80L/h，萃取3h。将超临界萃取液与丙酮以I : 10的比例混合搅拌lh，60°C冷冻8h，分离得到清液与膏状物。将清液与膏状物分别减压蒸馏回收丙酮溶剂，获得纯度不低于80%的α-亚麻酸原料。
权利要求
1.一种获取α-亚麻酸的内生菌发酵工艺技术，其特征是 (1)外植体发菌取流水冲洗干净的藿香茎杆、叶片若干，蒸馏水冲洗后，浸于70%乙醇中30s，再浸于O. 1% HgCl2溶液中浸泡5min。取出后经无菌水冲洗三遍，剪成茎段、叶片块，将创口贴于培养基，接种到MS固体培养基上23 °C避光发菌5d 15d ;生成大量菌落，取菌落直径3cm左右备用； (2)单克隆菌株发酵液培养分别从直径3cm以上的菌群边缘，用接种环挑取菌丝，并接种于PDA液体培养基，230C，120rpm暗培养5d 15d，获得基因一致的单克隆菌液； (3)筛选α-亚麻酸高产量菌株通过高效液相色谱法检测内生菌单克隆发酵液中α-亚麻酸含量。色谱条件与系统使用性试验用固定相为C18柱(4. 6mmX 200mm，5 μ m)；流动相为乙腈I %醋酸溶液(90 10);检测波长为205nm ;流速为I. Oml/min ;柱温25。。;进样量20 μ L，理论塔板数按α -亚麻酸峰计算应不少4000。对照品溶液的制备精密量取α -亚麻酸标准品适量，用乙腈1%醋酸溶液(9 I)制成每Iml含O. 5mg的溶液，即得。供试品溶液的制备，取内生菌发酵液2ml置于IOml的容量瓶中，用流动相进行定容，超声处理20分钟，从IOml容量瓶中取Iml定容到10ml，再从上步取2. 5ml置于5ml的容量瓶中，用流动相定容。测定法，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20ul，注入液相色谱仪进行检测。根据检测结果，从大量候选菌株中筛选得到α-亚麻酸高产量菌株； (4)高产菌株发酵培养获得原料液将筛选得到α-亚麻酸高产量菌株接种到到液体PDA培养基中暗培养，230C、120rpm。在液体培养过程中应注意及时进行继代培养，因为在有限的营养环境中培养物生长到一定时期将进入分裂的静止期。通常在培养到第18d 25d时达到最大密度，此时可以收获原料液，并应进行第一次继代培养。在继代培养时，应将较大的团块和接种物残渣除去； (5)分离和富集α-亚麻酸将所得发酵液装入萃取釜，进行超临界CO2萃取。萃取压力为32Mpa，萃取温度为45°C ;分离压力为5 lOMpa，分离温度为35°C ；C02流量为80L/h，萃取3h;将超临界萃取液与丙酮以I : 10的比例混合搅拌lh，60°C冷冻8h，分离得到清液与膏状物。将清液与膏状物分别减压蒸馏回收丙酮溶剂，获得纯度不低于80%的α-亚麻酸原料。
2.由权利要求I制备成α-亚麻酸原料，α -亚麻酸作为人体必需脂肪酸，是体内各组织生物膜的结构材料，也是合成人体一系列前列腺素的前体。是维持大脑和神经功能必需的因子，同时具有降血脂、预防和治疗冠心病、动脉硬化、某些癌症的发生以及抗氧化、清除自由基等功能。
全文摘要
本发明是一种获取α-亚麻酸的内生菌发酵工艺技术，主要通过如下制备工艺实现其目标取洗净的藿香茎秆、叶片若干，经70％乙醇和0.1％HgCl2溶液消毒，剪成块，将创口贴于培养基，接种到固体培养基23℃避光发菌5d～15d；从发菌所得菌群中挑取单克隆，接种于PDA液体培养基，23℃，120rpm暗培养5d～15d，获得基因一致的单克隆菌群发酵液；应用高效液相色谱法检测发酵液中α-亚麻酸含量，以挑选生产α-亚麻酸高含量的菌株；之后通过理化诱变，获得生产高产量高纯度α-亚麻酸菌株。将此菌株进行液体培养，18d～25d收获发酵液；对发酵液进行超临界CO2萃取；再将超临界萃取液与丙酮以一定比例混合搅拌1h，60℃冷冻8h，分离得到清液与膏状物。将清液与膏状物分别减压蒸馏回收丙酮溶剂，获得纯度高于80％的α-亚麻酸。
文档编号C12P7/64GK102643877SQ20121014685
公开日2012年8月22日 申请日期2012年5月11日 优先权日2012年5月11日
发明者王剑波, 王四旺, 谢艳华, 邱鹏程 申请人:中国人民解放军第四军医大学