一种预防和治疗肿瘤的效应细胞组合及其制备方法

专利名称：一种预防和治疗肿瘤的效应细胞组合及其制备方法
技术领域：
本发明涉及医药生物技术领域，特别涉及一种预防和治疗肿瘤的效应细胞组合及其制备方法。
背景技术：
恶性肿瘤是严重危害人类健康的常见病和多发病，世界恶性肿瘤的发病率逐年迅速增高，2005年国家卫生部公布癌症的死亡人数已跃居中国城乡居民的十大死因之首，而肿瘤的治疗却任重而道远。美国政府把“向癌症宣战”作为基本国策之一，15年中投资25亿美元。但是肿瘤的防治结果并不令人满意，20年后，美国总统委员会总结“向癌症宣战”
的结果是肿瘤的5年生存率提高了 4%，但是肿瘤的发病率却提高了 7%。所以恶性肿瘤的临床治疗仍是世界各国医务工作者的艰巨任务。国内外均以手术、放疗和化疗作为肿瘤治疗的主要手段，但总体疗效不尽人意。临床上70%的恶性肿瘤患者是死于肿瘤的复发和转移。要彻底清除三大常规治疗后机体内残存的少量肿瘤细胞，才是防止肿瘤复发和转移的关键。要彻底清除体内残留的肿瘤细胞，只有靠机体的免疫系统，也就是说要消灭掉体内最后一个肿瘤细胞要靠病人自己。近年来，肿瘤生物治疗已成为肿瘤综合治疗中第四种模式，而且越来越受到人们的重视。细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer, CIK)已成为恶性肿瘤过继免疫治疗的研究热点。CIK细胞是将人外周血或骨髓的单个核细胞在体外用多种细胞因子共同培养一段时间后获得的一群异质细胞。由于该种细胞同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，故又被称为NK样T淋巴细胞，具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点，是继LAK，TH及⑶3AK细胞之后又一高效的免疫效应细胞。目前，自体CIK细胞作为新一代肿瘤过继免疫治疗方法已经普遍用于肿瘤的临床治疗。然而，肿瘤患者进行自体CIK细胞过继性免疫治疗,绝大多数患者临床疗效未尽人意，资料表明CIK细胞治疗各种恶性实体瘤的有效率在3. 9%-30%之间，平均在30%以下，初步临床结果显示CIK能使少数病例完全缓解，绝大多数病情仅部分缓解。然而,利用自体CIK细胞治疗肿瘤却存在如下缺点
①有部分患者，我们的临床经验是大约40%的晚期瘤患者，其外周血CIK细胞不能诱导成功。原因是这些患者年龄较大(临床上60%的肿瘤患者都是60岁以上的老人)，自身细胞的繁殖能力较差。再加上经过漫长的化学药物和放射治疗，对其本身的血液细胞和免疫能力有进一步损伤，固临床上有40%的患者不能培养出自体的CIK细胞。②即使能勉强培养出自体CIK细胞，其CIK细胞的扩增倍数和杀伤活性也明显不足。我们的临床经验表明，同样培养14天时肿瘤患者CIK扩增倍数为60-100倍，而健康人CIK可扩增到360-800倍。健康人CIK的杀伤活性(92. 7%)也明显高于肿瘤患者CIK的杀伤活性(64. 2%)。③这也是最重要的和最核心的一个缺点。这就是肿瘤患者自体的肿瘤细胞对自体的免疫细胞已形成了 “免疫逃逸”，而躲开自身免疫细胞的杀伤而恶性发展；而肿瘤患者的免疫细胞对自体的肿瘤细胞产生了 “免疫耐受”，见到肿瘤细胞或“视而不见”，或“视为朋友”而不发挥免疫杀伤作用，这样自体免疫细胞对自体肿瘤细胞失去了杀伤作用，才导致肿瘤细胞的恶性发展。这种理论，目前医学上叫“肿瘤免疫编辑”。具体的内容如下
为什么健康人CIK细胞效果优于患者自体CIK细胞？郭坤元教授的一项研究说明了患者自身CIK细胞疗效不理想的原因。他把健康人的NK细胞和红白血病的癌细胞K562按I :I的比例进行共同培养，检测NK细胞对K562细胞的杀伤作用。结果是正常NK细胞对K562的杀伤活性为54. 3%。他把“服过役”的NK细胞和K562细胞的“残存者”再共培养检测“月艮过役”的NK细胞对K562细胞的“残存者”的杀伤作用。结果原代NK细胞对K562细胞的“残存者”杀伤活性为54%，“服过役”的NK细胞对K562细胞的“残存者”的杀伤活性仅有16%。也就是说当免疫细胞和肿瘤细胞第一次战斗时，NK的杀伤活性为54%，这二种细胞第二次战斗时，NK的杀伤活性仅有16%，不足第一次的30%。这说明，NK细胞和肿瘤细胞第二次“见面”时，其杀伤活性降低了 70%强。
这个实验结果在某些方面解释了为什么用患者自体免疫细胞制备的LAK临床有效率只有20%多的现象。美国华盛顿大学医学院教授Dunn等称这种现象为“肿瘤免疫编辑”现象。“肿瘤免疫编辑”学说认为机体免疫系统杀伤肿瘤的同时，肿瘤的恶性程度逐渐增加，导致免疫系统和肿瘤的力量对比失衡，最终可导致机体死亡的过程。免疫系统的这种双重作用被人们认识后，肿瘤免疫编辑学说才正式被提出。通过多年实验和临床观察，华盛顿大学肿瘤研究中心又进一步提出了肿瘤免疫编辑的3个过程，即免疫清除，免疫对抗和免疫逃逸。免疫清除过程是指机体免疫系统识别肿瘤组织，并且通过多种途径杀伤肿瘤细胞的过程。在该阶段，如果机体能成功地清除肿瘤细胞，免疫编辑至此结束，而不涉及到免疫对抗和免疫逃逸过程。免疫对抗过程可能是三个时期中历时最长的阶段，在人类可达数十年之久。很多人类实体瘤从最初的致癌物暴露到临床发病，时间可间隔20年。在此期间，具有异质性的，基因不稳定的肿瘤细胞最终使肿瘤能够抵抗免疫系统的攻击。基因组不稳定使得弱免疫原性的肿瘤突变体的产生成为可能，其中部分肿瘤细胞能够在免疫选择的环境下无限生长，华盛顿大学肿瘤研究中心称这阶段是“残酷的达尔文式选择”。免疫逃逸过程是肿瘤细胞经过免疫重塑绕过机体的免疫防御形成临床肿瘤，即进入免疫逃逸期-肿瘤临床症状出现和恶性发展期。免疫逃逸是肿瘤经过免疫系统重新塑造的结果。综上所述，上述技术背景的缺点核心是临床疗效较差。临床疗效差的原因有以上三个方面。而肿瘤的治疗手段应以临床疗效为最终的也是唯一的目的。为了提高临床疗效，因此，必须克服以上三方面的不足。

发明内容
本发明所解决的技术问题之一在于提供一种预防和治疗肿瘤的效应细胞组合，非肿瘤患者的外源健康人的外周血中提取制备而来的CIK细胞和MSC细胞，打破了自体CIK细胞的治疗常规，提高肿瘤生物治疗，特别是CIK细胞治疗的临床疗效；同时解决了移植物抗宿主反应(GVHD)的难题。本发明所解决的技术问题还在于提供所述效应细胞组合的制备方法，有效地获取了非肿瘤患者的外源健康人的外周血中提取制备而来的CIK细胞和MSC细胞，以便用于临床，提闻疗效。有鉴于此，一方面，本发明提供的一种预防和治疗肿瘤的效应细胞组合，所述效应细胞组合包括依次以细胞悬液形式注射入肿瘤患者体内的CIK细胞和MSC细胞，所述CIK细胞和MSC是从非肿瘤患者的外源健康人的外周血中提取制备而来。优选地，所述CIK细胞是通过以下方法获取的
(1)血液单核细胞采集通过血细胞分离机采集健康供者外周血单个核细胞，用淋巴细胞分离液分离出PBMC，收集血浆56°C水浴灭活，离心后备用；
(2)CIK细胞培养用无血清培养基调细胞浓度为4-6XIO6 / ml，加入RetroNectin和⑶3抗体事先包被的T75培养瓶；置于37°C、5% C02培养箱培养；4天后细胞转移至细胞培养袋，同时加入IFNi 1000U/ml，IL-2 500_1000U/ml，自体血浆3%，继续培养，至12-14天收集CIK细胞；
其中，CIK细胞培养到12-13天时，检测细胞数量，流式细胞仪细胞表型；CD3和CD56双阳性细胞达25%以上，台盼蓝染色细胞活度90%以上，红白血病癌细胞K562为靶细胞，杀伤能力达80%以上，细菌和热源检测合格后方可使用。优选地，所述MSC细胞是通过以下方法获取的
(1)血液单核细胞采集通过血细胞分离机采集健康供者外周血单个核细胞，用淋巴细胞分离液(Ficoll)分离出PBMC，收集血浆56°C水浴灭活，离心后备用；
(2)MSC培养取部分上述分离的PBMC加入IXPBS的离心管中洗涤一次，1500rpm离心5分钟；离心好后尽量去除上清，加入间质干细胞完全培养基，按照I XlO6 / cm 2的密度接种于75cm 2培养瓶中进行原代培养，培养瓶中加入20ml培养液，原代三天之后换液，吸去旧的间质干细胞的完全培养液，加入足量的新鲜的预热至37°C的间质干细胞完全培养液，此后每三天如上换液，至12-14天收集MSC细胞。另一方面，本发明还提供了一种预防和治疗肿瘤的效应细胞组合的制备方法，包括如下步骤
(1)血液单核细胞采集通过血细胞分离机采集健康供者外周血单个核细胞，用淋巴细胞分离液分离出PBMC，收集血浆56°C水浴灭活，离心后备用；
(2)CIK细胞培养用无血清培养基调细胞浓度为4-6XIO6 / ml，加入RetroNectin和⑶3抗体事先包被的T75培养瓶；置于37°C、5% C02培养箱培养；4天后细胞转移至细胞培养袋，同时加入IFN-y 1000U/ml, IL-2 500_1000U/ml，自体血浆3%，继续培养，至12-14天收集CIK细胞；
其中，CIK细胞培养到12-13天时，检测细胞数量，流式细胞仪细胞表型；CD3和CD56双阳性细胞达25%以上，台盼蓝染色细胞活度90%以上，红白血病癌细胞K562为靶细胞，杀伤能力达80%以上，细菌和热源检测合格后方可使用；
(3)MSC培养取部分上述分离的PBMC加入IXPBS的离心管中洗涤一次，1500rpm离心 5分钟；离心好后尽量去除上清，加入间质干细胞完全培养基，按照I XlO6 / cm2的密度接种于75cm 2培养瓶中进行原代培养，培养瓶中加入20ml培养液，原代三天之后换液，吸去旧的间质干细胞的完全培养液 ，加入足量的新鲜的预热至37°C的间质干细胞完全培养液，此后每三天如上换液，至12-14天收集MSC细胞。在临床使用过程中，单次注射所述效应细胞组合的方法为取30-50 X IO8个CIK细胞加入100-150ml左右的含1%的人血白蛋白生理盐水中，用输血器静脉滴注,每分钟60滴为宜；取30-50X IO6个MSC细胞加入100-150ml左右的含1%人血白蛋白的生理盐水中，用输血器静脉滴注，速度同CIK细胞悬液，先输CIK后接着输注MSC，二者之间可不用盐水冲输液管道。每天一次静脉滴注，6-8天一疗程，一年可作2-4疗程，可反复用多年。输注CIK细胞和MSC细胞时按输血规程进行。现有与现有技术，本发明的方案至少具备如下技术效果
I、打破了自体CIK细胞的治疗常规，建立了健康人CIK细胞治疗肿瘤新技术，扩大了CIK细胞的供者范围。同时建立了筛选健康人的条件。通常而言，肿瘤患者自体CIK培养成功率仅有60%，健康人CIK细胞培养成功率接近100% ;另外，患者自体CIK对肿瘤细胞K562的杀伤活性低(从背景技术中的论文数据看为64%)，而健康人CIK对肿瘤细胞K562的杀伤活性高达92%;临床疗效明显提高，原方法肿瘤患者自体CIK的临床有效率不足30%，健康人CIK的临床有效率可达60%。而且有些自体CIK细胞治疗无效的患者，健康人CIK细胞治疗仍有明显疗效，从临床结果看出能够打破“肿瘤免疫编辑”的现象。2、解决了移植物抗宿主反应(GVHD)的难题。异体CIK细胞治疗肿瘤中的最大隐患是GVHD，因为CIK细胞是⑶3和⑶56双阳性细胞，又叫NK样T细胞，再加上输注的细胞群中的大量T淋巴细胞，这些异体的T淋巴细胞是引起GVHD的主要因素，当然这些异体的T淋巴细胞也是抗击癌细胞的关键因素。本发明采用间充质干细胞(MSC)和CIK细胞同时输注，一方面避免了 GVHD的副作用，同时又不降低CIK的杀伤能力，保证了健康人CIK安全有效。分析国内外普遍采用患者自体CIK的原因主要是担心GVHD，我们采用该技术治疗200多例患者，非常安全。3、采用了新的培养技术,如使用RetroNectin (重组人纤维蛋白片段)试剂,使CIK细胞的扩增速度比原来的方法快几乎2倍，这样更有利于临床疗效。我们原来的方法CIK的扩增倍数只有100-200倍，新方法可达300-500倍。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例一、效应细胞组合的制备。I、健康人供者的基本条件
①年龄18-40岁，男、女不限。②血象WBC在5000/mm 3以上，血型不限。③无传染病甲、乙、丙、HIV、梅毒阴性。④流式细胞仪(FCM)测CD45+细胞大于2000/ mm 30
⑤对K562的自然杀伤活性大于80%。⑥血清中 SMICA(major histo-compatibility complex class I relatedprotein)小于 60pg/mlo
2、康人CIK细胞的制备
①包被培养瓶取50ml离心管I支，加入IOml D-PBS (日产)，同时加入CH2962501^1(251^ g / ml)、CD3MAb50W(5l^ g / ml),混匀后移入 T75 培养瓶。4°C冰箱内避光过夜。②细胞单采机(美国Baxter Amicus separater)选择淋巴细胞分离程序,采集健 康人淋巴细胞悬液60ml。③常规淋巴细胞分离液(Ficoll)分离单核细胞，收取血浆于56°C水浴灭活30分钟，再离心，去沉淀备用(自体血浆)。收取中间层单核细胞，再用D-PBS洗涤计数后加入包被瓶2X106 / ml浓度。同时加入IL-2 1000U / ml和IFN-Y 1000U / ml,和自体血浆3%。④T75瓶中培养4天时，用巴氏吸管吹打细胞，混匀细胞悬液并计数后用注射器套箱将细胞转移至细胞培养袋(GT-T610，日本宝日医公司产品)。同时加IL-2 500U / ml，自体血浆达3%。以后每隔天加补充无血清培养基(KBM551，Takara公司产品)，培养到12-14天时，收集细胞，进行质量检测。3.健康人CIK的质量检测
①细胞总数常规计数池法计算，每袋细胞总数应大于30 X IO80②细胞活度台盼兰排斥染色法，细胞活度应在95%以上。③细胞表型流式细胞仪测定，⑶3⑶56双阳性细胞应大于25%。④杀伤活性用培养的CIK为效应细胞，K562为靶细胞，使效靶比为20 :1，即CIK浓度2X IO5 / ml, K562为IXlO4 / ml。各取IOOW加入96孔培养板，分3组。实验组加效靶细胞液各IOOW，效应组加效应细胞液IOOW，靶细胞组加靶细胞液IOOW。每组样品设3个复孔。置37°C，5%C02培养箱培养20h，每孔加入MTT (5mg/ml) 20耵，继续培养4h，而后离心，弃上清，每孔加入100W 0. 04N的HCL酸化异丙醇，用滴头轻轻吹打细胞，再置于振荡器上振荡lmin，使黑兰色结晶完全溶解，570nm波长测OD值。取3个平行孔平均OD值计算结果。杀伤活性(％)=[1_ (实验孔OD值-效应孔OD值)/靶细胞孔OD值]X 100%。大于80%为合格。原理活细胞线粒体脱氢酶能将染料MTT 二甲基噻唑二苯基四唑溴盐)转变为不溶性的紫色甲臢(formagan)颗粒，后者被酸性异丙醇溶解后所呈现的色度(用OD值表示)反映出活细胞代谢水平，死细胞无此酶活性)。⑤常规方法检测细菌和热源。合格者可使用。4、间充质干细胞(MSC)的制备和鉴定
取部分上述分离的PBMC加入I XPBS的离心管中洗涤一次，1500rpm离心5分钟。离心好后尽量去除上清。加入间质干细胞完全培养基。按照IXlO6 / cm2的密度接种于75cm2培养瓶中进行原代培养。培养瓶中加入20ml培养液，原代三天之后换液，吸去旧的间质干细胞的完全培养液，加入足量的新鲜的预热至37°C的间质干细胞完全培养液，此后每三天如上换液，至12-14天收集MSC细胞。经流式细胞仪检测其细胞表面抗原表型为⑶73，⑶90或⑶105阳性，而且⑶34、⑶45、HLA-Dr为阴性者为合格。5.临床应用原则
①因本CIK细胞是广谱抗瘤细胞，所以可适应于所有种类的肿瘤病人。(肝、肾、心脏功能衰竭者和病危患者除外)
②取30-50X IO8个CIK细胞加入150ml左右的含1%的人血白蛋白生理盐水中，用输血器静脉滴注，每分钟60滴为宜。取30-50 X IO6个MSC细胞加入IOOml左右的含1%人血白蛋白的生理盐水中，用输血器静脉滴注，速度同CIK细胞悬液。一般情况下，先输CIK后接着输注MSC，二者之间可不用盐水冲输液管道。一般情况下，每天一次，6-8次一疗程，一年可作2-4疗程。可反复用多年。③输注过程注意事项和不良反应处理
a.所有的细胞输注程序按输血程序进行。b.输注前混勻,用输血器静脉滴注。程序和输血一样。速度60滴/分。(亦可视情而定)。

c.输注前三天最好服用①雷尼替丁 0. 15g bid,②苯海拉明I片qd,③消炎痛I片qd晚上服。服用7-10天，亦可视情况而定，或输注前肌注非那根25mg/支。d.常见的不良反应是寒战和发热。发生率10%左右。一般在输注结束前5-10分钟或结束后1-3小时内开始，个体差异，反应情况不一。第一种情况比较轻微，只有寒战，自觉有发冷感5-10分钟即自行消退，无不适。第二种情况是中等反应，先寒战，后发热，发热一般在38_39°C之间，可持续3_5小时，不用处理自行缓解。亦有在39-40°C，若持续不退，影响入眠，可用常规退烧针降温。第三种情况又叫异体细胞反应，主要表现在治疗后I周皮肤包括面部皮肤骚痒、发红，有百针同刺的刺痛感，有牛皮癣样或硬皮样改变。三天后有皮肤“干裂”现象，一周后脱皮，脱皮后，皮肤变白，变细，无后遗症，有美容之效。此种现象发生极少，我们仅见一例。有关专家认为这种反应重，说明异体细胞对肿瘤攻击效果更佳。第四种情况可能会出现移植物抗宿主(GVHD)反应如咳嗽、呕吐、甚至肝、肾功能损害等。由于我们采用了特有的措施(具体方法如MSC等)，保证在安全第一的前提下最大限度提高疗效。为了安全起见,健康人免疫细胞治疗的患者必需住院治疗。实施例一、采用实施例一中制得的效应细胞组合的临床疗效。病例I、乳腺癌的治疗
患者病理诊断左乳低分化腺癌，部分为透明细胞癌，部分为髓样癌，浸润脉管。免疫组化染色结果=ER ( + )，PR (±)，CERBB-2 (+++)，CA 15-3 (++)，伴有双肺，纵膈，左锁骨上淋巴结转移和胸腔积液。由于病情已到晚期，且化疗无效。有关专家建议试用生物治疗。常规生物治疗(脐血CIK) 一个疗程后，患者自觉症状如胸痛，胸闷有所好转，锁骨肿块亦有明显缩小。可半月后锁骨上淋巴结又有增大。再用生物治疗效果不明显，患者病情明显恶化，胸水明显增多。胸痛明显，睡觉不能平卧，需2— 3天抽胸水一次。肺部转移灶增多，侵犯支气管，咳嗽严重，昼夜不停，通宵不能入眠。饮食差，精神萎靡不振，连起床的力气都不足。后经放疗效、化疗均无效果，且癌细胞已发生全身转移，PET检查结果为1.左侧乳腺癌改良根治术，化疗后复发转移，行粒子植入后，左侧胸壁广泛复发。2.双肺弥漫性转移，双侧胸腺转移并中等量积液。3.双侧锁骨上，左侧腋下，双侧肺门及纵隔多发淋巴结转移。
4.全身多发骨转移。经效应细胞组合的临床治疗后复查表现为1、原左侧胸壁肿瘤大部分消失，代谢较前明显减低，提示疗效显著。2.原双肺弥漫转移灶基本消失；原双侧胸腔积液现已完全吸收。3.原双侧锁骨上、左侧腋下、双肺门及纵膈多发淋巴结转移灶，大部分已消失。另外，针对类似的多个乳腺癌病例，发明人也采用了类似的疗法，均表现出类似病例I的良好疗效。病例2、治疗宫颈癌术后多发性肺转移和骨转移
患者在北京协和肿瘤医院行早期宫颈癌切除手术，术后常规放疗和化疗。后发现肿瘤复发伴肺部和髂骨转移.河南X肿瘤医院再次化疗加中药治疗，累计放疗24次，化疗17个周期(常规是4-6个)。化疗停止I月左右，肿瘤既又复发，不但肿瘤继续增大，而且副作用明显。后经效应细胞组合的临床治疗后复查表现为
(1).精神好转，体质增强，容光焕发
(2).症状减轻，咳嗽停止，胸痛消失.
(3.)肺部6个转移灶，一个月后3个消失，3个缩小50%，10个月后全部消失。(4.)髂骨转移灶，基本消失.
二年后复查所有的肺部和髂骨转移灶全部消失，已经开始了正常工作。三年后，PET/CT全身扫描结果未见异常。另外，针对发明人接触的15个宫颈癌病例，发明人也采用了类似的疗法，均表现出类似病例2的良好疗效。病例3、生物治疗复发性脑瘤
患者在新加坡尹丽沙白医院行脑内成神经管细胞瘤切除术，十年后复发，化疗6个周期，脑内肿瘤不但没有缩小，还略有增大，后经效应细胞组合的临床治疗后复查表现为一个疗程后，脑内肿瘤完全消失。二年后MRI复查结果
(I)没有发现脑瘤复发和转移。(2)右侧上颌窦影像比原来明显好转。(3)各脑室正常,室中隔结构无偏移。三年后，2010年4月，MR复查
(I)没有发现脑瘤复发和转移。(2)各脑室正常,室中隔结构无偏移。(3)眼眶和乳突无异常。 (4)和治疗两年后的MRI比较，没有明显变化。另外，针对发明人接触的3个脑瘤病例，发明人也采用了类似的疗法，均表现出类似病例3的良好疗效。病例4治疗晚期肝癌一例
患者肝癌已晚期，病灶波及全肝，多发门脉癌栓，腹水明显，失去了多种治疗方法，肝移植也困难。经效应细胞组合的临床治疗后表现为一个疗程后，肿瘤明显缩小，肝腹水消失，体质明显恢复。病例5治疗肝癌术后复发
患者二年前发现肝癌，由于年高(86)体弱，术后出现了败血症，霉菌血症，肝功损伤，心力衰竭等，经8个多月的多方全力救治，病情才少稳定。术后9个月CT复查，发现肝癌复发。由于年高病重，精神欠佳，体质虚弱，上厕所都有困难。先有自体CIK治疗三次，无明显变化。后采用本发明的经效应细胞组合的临床治疗后，结果病情明显好转，精神好转，体质增强，全身不适消失，治疗前不能下床，治疗后可自己上下楼。第二年6月，由于心衰过世。延长寿命I年余，如无心衰，将有更好的疗效。另外，针对发明人接触的5个脑瘤病例，发明人也采用了类似的疗法，由于患者体质较好，均表现出优于病例5的良好疗效。
病例6治疗肝胆管癌术后复发一例
患者中山肿瘤医院行肝癌切除术，术后3个月肝癌复发，CT和B超示
肝内二个肝癌复发灶(2. lcmX2. 4cm)
双肺8个小型转移灶，最大的I. 1X1. 2cm,
血清 AFP 高达 45389. 40 ug/L
被告知，目前无有特效疗法。后经效应细胞组合的临床治疗，一个疗程后复查
肝内二个复发灶全部消失。双肺8个转移灶减少4个，最大的缩小50% (I. 2X1. 2cm 0. 8X0. 8cm)
血清AFP由4. 5万降至IJ I. 2万ug/L.。20天后降到644. 54ug/L。病例7治疗晚期肾癌
患者左肾巨大肾癌(IOXlOcm以上)，右肾较小肾癌。上海复旦大学中山医院靶向药物多吉美治疗3个月，效果较好，肿块缩至9. 5cm以下。继续多吉美治疗的情况下，2009年6月病情恶化，检查为巨大肿块9. 5X8. 4cm,伴锁骨上，肝内，腹膜后，胸腰椎多发转移和少量胸腔积液。后经效应细胞组合的临床治疗后，复查结果
(1)锁骨上肿块(3X4cm)，基本消失(0.3X0. 4cm).
(2)肝转移灶数目明显减少，体积明显缩小。(3)腹膜后转移灶肿块明显缩小。(4)左肾巨大肿块(95X85)缩小至86 X 75cm.，体积缩小约30%。(5)患者痛疼消失，可自由活动。另外，针对发明人接触的3个肾癌病例，发明人也采用了类似的疗法，均表现出类似病例7的良好疗效。还需要说明的是，由于本发明的实施例中充质干细胞(MSC)和CIK细胞一并输注，既避免了 GVHD的副作用，又不会降低CIK的杀伤能力，上述病例和相类似的病例在治疗过程中，未表现出GVHD的副作用，非常安全。以上所述是本发明的优选实施方式而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和变动，这些改进和变动也视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种预防和治疗肿瘤的效应细胞组合，其特征在于，所述效应细胞组合包括依次以细胞悬液形式注射入肿瘤患者体内的CIK细胞和MSC细胞，所述CIK细胞和MSC是从非肿瘤患者的外源健康人的外周血中提取制备而来。
2.如权利要求I所述的效应细胞组合，其特征在于，所述CIK细胞是通过以下方法获取的 (1)血液单核细胞采集通过血细胞分离机采集健康供者外周血单个核细胞，用淋巴细胞分离液分离出PBMC，收集血浆56°C水浴灭活，离心后备用； (2)CIK细胞培养用无血清培养基调细胞浓度为4-6XIO6 / ml，加入RetroNectin和 ⑶3抗体事先包被的T75培养瓶；置于37°C、5% C02培养箱培养；4天后细胞转移至细胞培养袋，同时加入IFN-y 1000U/ml, IL-2 500_1000U/ml，自体血浆3%，继续培养，至12-14天收集CIK细胞； 其中，CIK细胞培养到12-13天时，检测细胞数量，流式细胞仪细胞表型；CD3和CD56双阳性细胞达25%以上，台盼蓝染色细胞活度90%以上，红白血病癌细胞K562为靶细胞，杀伤能力达80%以上，细菌和热源检测合格后方可使用。
3.如权利要求I所述的效应细胞组合，其特征在于，所述MSC细胞是通过以下方法获取的 (1)血液单核细胞采集通过血细胞分离机采集健康供者外周血单个核细胞，用淋巴细胞分离液(Ficoll)分离出PBMC，收集血浆56°C水浴灭活，离心后备用； (2)MSC培养取部分上述分离的PBMC加入IXPBS的离心管中洗涤一次，1500rpm离心5分钟；离心好后尽量去除上清，加入间质干细胞完全培养基，按照I XlO6 / cm2的密度接种于75cm 2培养瓶中进行原代培养，培养瓶中加入20ml培养液，原代三天之后换液，吸去旧的间质干细胞的完全培养液，加入足量的新鲜的预热至37°C的间质干细胞完全培养液，此后每三天如上换液，至12-14天收集MSC细胞。
4.如权利要求I所述的效应细胞组合，其特征在于，临床使用时，单次注射所述效应细胞组合的方法为取30-50X IO8个CIK细胞加入100-150ml左右的含1%的人血白蛋白生理盐水中，用输血器静脉滴注，每分钟60滴为宜；取30-50 X IO6个MSC细胞加入100_150ml左右的含1%人血白蛋白的生理盐水中，用输血器静脉滴注，速度同CIK细胞悬液，先输CIK后接着输注MSC，二者之间可不用盐水冲输液管道。
5.一种预防和治疗肿瘤的效应细胞组合的制备方法，其特征在于，包括如下步骤 (1)血液单核细胞采集通过血细胞分离机采集健康供者外周血单个核细胞，用淋巴细胞分离液分离出PBMC，收集血浆56°C水浴灭活，离心后备用； (2)CIK细胞培养用无血清培养基调细胞浓度为4-6XIO6 / ml，加入RetroNectin和⑶3抗体事先包被的T75培养瓶；置于37°C、5% C02培养箱培养；4天后细胞转移至细胞培养袋，同时加入IFNi 1000U/ml，IL-2 500-1000U/ml,自体血浆3%，继续培养，至12-14天收集CIK细胞； 其中，CIK细胞培养到12-13天时，检测细胞数量，流式细胞仪细胞表型；CD3和CD56双阳性细胞达25%以上，台盼蓝染色细胞活度90%以上，红白血病癌细胞K562为靶细胞，杀伤能力达80%以上，细菌和热源检测合格后方可使用； (3)MSC培养取部分上述分离的PBMC加入IXPBS的离心管中洗涤一次，1500rpm离心5分钟；离心好后尽量去除上清，加入间质干细胞完全培养基，按照I XlO6 / cm 2的密度接种于75cm 2培养瓶中进行原代培 养，培养瓶中加入20ml培养液，原代三天之后换液，吸去旧的间质干细胞的完全培养液，加入足量的新鲜的预热至37°C的间质干细胞完全培养液，此后每三天如上换液，至12-14天收集MSC细胞。
全文摘要
本发明涉及一种预防和治疗肿瘤的效应细胞组合，包括依次以细胞悬液形式注射入肿瘤患者体内的CIK细胞和MSC细胞，所述CIK细胞和MSC是从非肿瘤患者的外源健康人的外周血中提取制备而来。本发明还公开了一种该效应细胞组合的制备方法，包括血液单核细胞采集、CIK细胞培养和MSC培养。本发明的方案采用非肿瘤患者的外源健康人的外周血中提取制备而来的CIK细胞和MSC细胞，打破了自体CIK细胞的治疗常规，提高肿瘤生物治疗，特别是CIK细胞治疗的临床疗效，同时解决了移植物抗宿主反应(GVHD)的难题。
文档编号C12N5/0775GK102641298SQ20121014981
公开日2012年8月22日 申请日期2012年5月15日 优先权日2012年5月15日
发明者祁岩超 申请人:祁岩超