专利名称：特异抑制肝细胞CYP2E1基因表达的shRNA慢病毒表达载体及其构建方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及特异抑制肝细胞CYP2E1基因表达的shRNA慢病毒表达载体及其构建方法与应用。
背景技术：
CYP2E1是细胞色素氧化酶(cytochrome，CYP)超家族重要成员之一，占CYP总量7%。CYP2E1的代谢底物很广泛，现已知代谢底物有70余种，主要包括三氯乙烯、四氯乙烯、乙醇、苯胺、亚硝酸类化合物等环境污染物，这些环境污染物大部分是前致癌物，经过CYP2E1催化代谢转化为最终致癌活性物质。许多研究表明，CYP2E1介导了多种化合物致肝损伤，如三氯乙烯、乙醇、氯仿等。CYP2E1介导化合物代谢产生细胞损伤的方式有两 种①CYP2E1代谢分解底物产生的中间代谢物与核酸和蛋白质等大分子物质结合，引起细胞损伤对还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)具有较高的氧化活性，不依赖配体产生自由基，导致DNA损伤、基因突变。RNA干扰(RNAi)是大部分生物体存在的一种普遍现象，在转录水平调控基因表达，广泛应用于特异抑制基因的表达及其功能研究。现有技术中，徐芸等将siRNA连接到载体pmU6上，形成重组载体，转染E47细胞，构建了抑制CYP2E1基因转录位点的siRNA表达载体，虽然该siRNA表达载体可以在短时间内沉默CYP2E1基因的表达，但其存在干扰效果不够明显，转染效率低，细胞毒性大，且无法实现长效稳定干扰的缺点。RNA干扰基因表达功能的实现依赖于siRNA序列的选择与高效表达载体的构建，但现有技术中尚无转染效率高且可长效稳定表达、特异抑制CYP2E1基因表达的shRNA表达载体。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，发明人在干扰序列的选择以及载体的选择、重组构建方法等方面进行了大量的探索研究，预料不到地发现，将包含Age I酶切位点和EcoR I酶切位点的shRNA寡核苷酸序列插入PLKO. 1-puro表达载体的多克隆位点中可成功构建靶向CYP2E1基因的shRNA慢病毒表达载体，从而完成本发明。本发明提供一种特异抑制肝细胞CYP2E1基因表达的shRNA慢病毒表达载体，包括PLKO. 1-puro表达载体的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列和靶向CYP2E1基因的shRNA寡核苷酸序列；所述多克隆位点包括Age I酶切位点和EcoR I酶切位点，所述shRNA寡核苷酸序列由Age I酶切位点+靶核苷酸序列+茎环结构序列+靶核苷酸序列互补序列+终止位点序列+EcoR I酶切位点组成，所述shRNA寡核苷酸序列正向插入所述多克隆位点中。采用上述技术方案,本发明提供的shRNA寡核苷酸序列插入PLKO. 1-puro表达载体构建得到的shRNA慢病毒表达载体具有转染效率高，用量少，可持续、高效、稳定、特异地抑制肝细胞CYP2E1基因表达的优点，抑制效果好，可作为有力工具应用于制备治疗CYP2E1基因表达异常相关疾病的药物。作为本发明的进一步改进，所述靶核苷酸序列为5 ’ -GCTCCAGCTTTACAATAAT-3 ’(SEQ ID NO :1)，所述shRNA寡核苷酸序列包括正义链序列和反义链序列，所述正义链序列为5’ -CCGGTGCTCCAGCTTTACAATAATTTCAAGAGAATTATTGTAAAGCTGGA
GCmTTTG-3’ (SEQ ID NO :2)，所述反义链序列为5’ -AATTCAAAAAAGCTCCAGCTTTACAATAATTCTCTTGAAATTATTGTAAAGCTGGAGCA-3’ (SEQ ID NO :3)。采用上述序列，shRNA寡核苷酸可成功插入至PLKO. 1-puro表达载体中，对CYP2E1基因表达的抑制效果显著、持续且稳定。作为本发明的进一步改进，所述靶核苷酸序列为5 ’ -GACCTCAGCCCTATACATA-3 ’(SEQ ID NO :4)，所述shRNA寡核苷酸序列包括正义链序列和反义链序列，所述正义链序列为5’ -CCGGTGACCTCAGCCCTATACATATTCAAGAGATATGTATAGGGCTGAGGTCmTTTG-3’ (SEQ ID NO :5)，所述反义链序列为5’ -AATTCAAAAAAGACCTCAGCCCTATACATATCTCTTGAATATGTATAGGGCTGAGGTCA-3，(SEQ ID NO :6)。采用上述序列，shRNA寡核苷酸可成功插入至PLKO. 1-puro表达载体中，对CYP2E1基因表达的抑制效果显著、持续且稳定。作为本发明的进一步改进，所述靶核苷酸序列为5 ’ -GCCAGAACACTTCCTGAAT-3 ’(SEQ ID NO :7)，所述shRNA寡核苷酸序列包括正义链序列和反义链序列，所述正义链序列为5’ -CCGGTGCCAGAACACTTCCTGAATTTCAAGAGAATTCAGGAAGTGTTC
GTGCmTTTG-3’ (SEQ ID NO :8)，所述反义链序列为5’-AAITCAAAAAAGCCAGAACACTTCCTGAATTCTCTTGAA ATTCAGGAAGTGTTCGTGCA-3’(SEQ ID NO :9)。采用上述序列，shRNA寡核苷酸可成功插入至PLKO. 1-puro表达载体中，对CYP2E1基因表达的抑制效果显著、持续且稳定。相应的，本发明还提供特异抑制肝细胞CYP2E1基因表达的shRNA慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于包括如下步骤
A)shRNA寡核苷酸序列的设计根据CYP2E1的mRNA全序列，经BLAST同源性比对证实特异性后应用RNA structure 4. 4软件对祀mRNA序列的二级结构进行评估得到祀核苷酸序列，设计并合成靶向CYP2E1基因的shRNA寡核苷酸序列；
B)shRNA慢病毒表达载体的构建和鉴定将合成的shRNA寡核苷酸单链等量混合，退火形成双链的shRNA，提取质粒PLKO. 1-puro，用限制性内切酶Age I ,EcoR I双酶切，电泳、切胶回收载体，再用T4 DNA Iigase分别将双链shRNA连接到PLKO. 1-puro表达载体中，得到连接产物；将连接产物转化到感受态大肠杆菌JM107中，均匀涂布到含氨苄青霉素LB培养基平板上，挑取阳性单克隆菌落培养保存并进行PCR鉴定，将初步鉴定结果说明shRNA寡核苷酸序列插入成功的菌液进行测序鉴定；
C)shRNA慢病毒表达载体的抽提将测序结果证实shRNA寡核苷酸序列插入成功的菌液扩增培养，进行大量抽提重组质粒，得到特异抑制肝细胞CYP2E1基因表达的shRNA慢病毒表达载体。本发明利用RNA干扰技术构建靶向肝细胞CYP2E1基因表达的shRNA慢病毒表达载体，经鉴定构建成功后，包装成病毒转导入L-02肝细胞，嘌呤霉素筛选细胞后，使用实时荧光定量PCR和Western Blot技术分别从mRNA和蛋白水平验证CYP2E1基因表达的抑制效果，实验结果证明本发明提供的shRNA寡核苷酸可成功插入至PLKO. 1-puro表达载体中，且对CYP2E1基因表达的抑制效果显著、持续且稳定。酶切和传统菌落PCR是重组载体是否构建成功的初步鉴定方法，然后将鉴定结果为阳性的菌液测序就可以证实重组载体的构建成功。本发明所采用的起始载体全长为7032bp，而插入的双链shRNA只有59bp ;传统菌落PCR鉴定重组载体是在插入片段上设计引物，而本发明中插入的双链shRNA形成发卡结构，因此，酶切和传统菌落PCR都不适合用来鉴定RNAi载体是否构建成功。长期以来，只能依靠测序的鉴定RNAi载体是否构建成功，而在载体构建过程中存在的假阳性菌落会增加实验的费用，延长实验的时间。本发明在PLKO. 1-puro载体双链shRNA插入位点两端设计引物，通过重组质粒PCR产物和原质粒PCR产物大小的比较鉴定重组载体是否构建成功，具有灵敏度高、准确性好、快捷且成本低等优点，可广泛应用于RNAi载体构建的鉴定。本发明还提供特异抑制肝细胞CYP2E1基因表达的shRNA慢病毒表达载体在制备治疗CYP2E1基因表达异常相关疾病的药物中的用途。 另一方面，本发明还提供一种特异抑制肝细胞CYP2E1基因表达的沉默细胞的构建方法，包括如下步骤
A)培养293FT细胞并接种到六孔板中，每孔IO6个细胞，使用如权利要求I至4中任一项所述的shRNA慢病毒表达载体，与pCMV-VSV-G、pCMV_dR8. 91共转染293FT细胞；
B)48h、72h分别收集含病毒的上清培养基，过滤病毒液，检测病毒的滴度；
C)培养L-02肝细胞并接种到六孔板中，每孔IO6个细胞，加入用RPMI-1640完全培养基以I :10稀释的病毒液，再加入聚凝胺至终浓度为5 ii g/mL ；
D)培养24h后，弃去含病毒的RPMI-1640完全培养基，加入新鲜的RPMI-1640完全培养基，培养24h后用嘌呤霉素筛选细胞，得到特异抑制肝细胞CYP2E1基因表达的沉默细胞。与现有技术相比，本发明的有益效果如下本发明提供的shRNA慢病毒表达载体具有转染效率高，用量少，可持续、高效、稳定、特异地抑制肝细胞CYP2E1基因表达的优点，可作为有力工具应用于制备治疗CYP2E1基因表达异常相关疾病的药物；本发明提供的shRNA慢病毒表达载体以及沉默细胞的构建方法，操作效果好，可排除假阳性菌落的干扰，避免了不必要的测序花费，可高效、特异抑制肝细胞CYP2E1基因表达。
图I为PLKO. 1-puro表达载体的质粒图谱。图2为PLKO. 1-puro重组质粒单克隆菌落示意图；其中，A为pLK0_2EIshRNAc组，B 为 pLK0-2ElshRNAl 组，C 为 pLK0_2ElshRNA2 组，D 为 pLK0_2ElshRNA3 组。图3 为菌落 PCR 鉴定结果示意图；其中，M:DNA marker,0T03 pLK0-2EIshRNAc ；11 13 pLK0-2ElshRNAl ；+ 质粒 PLKO. 1-puro ;21 23 :pLK0_2ElshRNA2 ;31 33 pLK0-2ElshRNA3。图4为重组载体测序结果示意图；其中，a pLK0-2EIshRNAc, b :pLK0_2ElshRNAl，c pLK0-2ElshRNA2, d :pLK0_2ElshRNA3。图5为嘌呤霉素筛选细胞后荧光定量PCR检测结果示意图。图6为嘌呤霉素筛选细胞后Western blot检测结果示意图。
图7为嘌呤霉素筛选细胞连续培养20代后Western blot检测结果示意图。
具体实施例方式下面结合附图与具体实施例对本发明做进一步的说明。L-02肝细胞购自上海生命科学院细胞资源中心，293FT细胞、Lipofectamine 2000均购自Invitrogen公司，慢病毒表达载体PLKO. 1-puro、包膜蛋白质粒pCMV-VSV-G和包装辅助质粒pCMV_dR8. 91均购自Biovector公司,RNeasy Mini Kit购自Qiagen公司，Lenti-X GoStix试剂盒购自TAKARA生物技术公司。实施例一靶向肝细胞CYP2E1基因的shRNA寡核苷酸序列的设计。在GenBank查找到CYP2E1的mRNA全序列(NM_000773. 3)，经BLAST同源性比对证实特异性后应用RNA structure 4. 4软件对靶mRNA序列的二级结构进行评估，最后筛选出3条19nt靶核苷酸序列，具体序列见表I。 表I CYP2EI基因的3条特异性siRNA靶核苷酸序列
权利要求
1.一种特异抑制肝细胞CYP2E1基因表达的ShRNA慢病毒表达载体，其特征在于包括PLKO. Ι-puro表达载体的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列和靶向CYP2E1基因的shRNA寡核苷酸序列；所述多克隆位点包括Age I酶切位点和EcoR I酶切位点，所述shRNA寡核苷酸序列由Age I酶切位点+靶核苷酸序列+茎环结构序列+靶核苷酸序列互补序列+終止位点序列+EcoR I酶切位点组成，所述shRNA寡核苷酸序列正向插入所述多克隆位点中。
2.根据权利要求I所述的特异抑制肝细胞CYP2E1基因表达的shRNA慢病毒表达载体，其特征在于所述靶核苷酸序列为5’ -GCTCCAGCTTTACAATAAT-3’ (SEQ ID NO :1)，所述shRNA寡核苷酸序列包括正义链序列和反义链序列，所述正义链序列为5’ -CCGGTGCTCCAGCTTTACAATMTTTCMGAGMTTATTGTAAAGCTGGAGCTTTTTTG-3’(SEQ ID NO 2),所述反义链序列为5’ -AATTCAAAAAAGCTCCAGCTTTACAATAATTCTCTTGAAATTATTGTAAAGCTGGAGCA-3’ (SEQ ID NO :3)。
3.根据权利要求I所述的特异抑制肝细胞CYP2E1基因表达的shRNA慢病毒表达载体，其特征在于所述靶核苷酸序列为5’ -GACCTCAGCCCTATACATA-3’ (SEQ ID NO :4)，所述shRNA寡核苷酸序列包括正义链序列和反义链序列，所述正义链序列为5’ -CCGGTGACCTCAGCCCTATACATATTCAAGAGATATGTATAGGGCTGAGGTCTTTTTTG-3J(SEQ ID NO :5)，所述反义链序列为5’ -AATTCAAAAAAGACCTCAGCCCTATATCTCTTGAATATGTATAGGGCTGAGGTCA-3’ (SEQ ID NO :6)。
4.根据权利要求I所述的特异抑制肝细胞CYP2E1基因表达的shRNA慢病毒表达载体，其特征在于所述靶核苷酸序列为5’ -GCCAGAACACTTCCTGAAT-3’ (SEQ ID NO :7)，所述shRNA寡核苷酸序列包括正义链序列和反义链序列，所述正义链序列为5’ -CCGGTGCCAGAACACTTCCTGAATTTCAAGAGAATTCAGGAAGTGTTCGTGCTTTTT TG-3’ (SEQ ID NO :8)，所述反义链序列为5’-AATTCAAAAAAGCCAGAACACTTCCTGAATTCTCTTGAA ATTCAGGAAGTGTTCGTGCA-3’ (SEQ ID NO :9)。
5.根据权利要求I至4中任ー项中所述的特异抑制肝细胞CYP2E1基因表达的shRNA慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于包括如下步骤 A)shRNA寡核苷酸序列的设计根据CYP2E1的mRNA全序列，经BLAST同源性比对证实特异性后应用RNA structure 4. 4软件对祀mRNA序列的ニ级结构进行评估得到祀核苷酸序列，设计并合成靶向CYP2E1基因的shRNA寡核苷酸序列； B)shRNA慢病毒表达载体的构建和鉴定将合成的shRNA寡核苷酸单链等量混合，退火形成双链的shRNA，提取质粒PLK0. Ι-puro，用限制性内切酶Age I、EcoR I双酶切，电泳、切胶回收载体，再用T4 DNA Iigase分别将双链shRNA连接到PLKO. I-pur ο表达载体中，得到连接产物；将连接产物转化到感受态大肠杆菌JM107中，均匀涂布到含氨苄青霉素LB培养基平板上，挑取阳性单克隆菌落培养保存菌液并进行PCR初歩鉴定，将初步鉴定结果说明shRNA寡核苷酸序列插入成功的菌液进行测序鉴定； C)shRNA慢病毒表达载体的抽提将测序结果证实shRNA寡核苷酸序列插入成功的菌液扩增培养，进行大量抽提重组质粒，得到靶向CYP2E1基因的shRNA慢病毒表达载体。
6.根据权利要求I至4中任ー项中所述的特异抑制肝细胞CYP2E1基因表达的shRNA慢病毒表达载体在制备治疗CYP2E1基因表达异常相关疾病的药物中的用途。
7.一种特异抑制肝细胞CYP2E1基因表达的沉默细胞的构建方法，其特征在于包括如下步骤 A)培养293FT细胞并接种到六孔板中，每孔IO6个细胞，使用如权利要求I至4中任一项所述的shRNA慢病毒表达载体，与pCMV-VSV-G、pCMV_dR8. 91共转染293FT细胞； B)48h、72h分别收集含病毒的上清培养基，过滤病毒液，检测病毒的滴度； C)培养L-02肝细胞并接种到六孔板中，每孔IO6个细胞，加入用RPMI-1640完全培养基以I :10稀释的病毒液，再加入聚凝胺至终浓度为5 μ g/mL ； D)培养24h后，弃去含病毒的RPMI-1640完全培养基，加入新鲜的RPMI-1640完全培养基，培养24h后用嘌呤霉素筛选细胞，得到特异抑制肝细胞CYP2E1基因表达的沉默细胞。
全文摘要
本发明提供一种特异抑制肝细胞CYP2E1基因表达的shRNA慢病毒表达载体，包括PLKO.1-puro表达载体的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列和靶向CYP2E1基因的shRNA寡核苷酸序列，所述shRNA寡核苷酸序列正向插入所述多克隆位点中。本发明提供的shRNA慢病毒表达载体具有转染效率高，用量少，可持续、高效、稳定、特异地抑制肝细胞CYP2E1基因表达的优点，可作为有力工具应用于制备治疗CYP2E1基因表达异常相关疾病的药物。
文档编号C12N15/66GK102703507SQ20121015550
公开日2012年10月3日 申请日期2012年5月18日 优先权日2012年5月18日
发明者彭朝琼, 徐新云, 毛吉炎, 程锦泉 申请人:深圳市疾病预防控制中心