专利名称：T-ggps基因在提高植物番茄红素含量中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地，涉及一种基因T-GGPS的应用，尤其涉及T-GGPS基因在提高植物番茄红素含量中的应用，同时还涉及T-GGPS基因在培育富含番茄红素植株方面的应用。
背景技术：
番茄红素(Lycopene)是人体血浆中最重要的类胡萝卜素之一，是一种有效的抗氧化剂(Paolo Di Mascio et al, 1989),其与人类健康密切相关,但人体自身不能合成番爺红素，只能通过膳食补充，而水果、蔬菜是重要的来源。因此提高番茄红素含量也是番茄品质育种的重要目标。
目前植物体内类胡萝卜素代谢途径已经基本清楚，牦牛儿基焦磷酸合成酶(GGPSgeranylgeranyl diphosphate synthase)是3_憐酸甘油醒/丙酮酸途径与类胡萝卜素合成途径分支点上的一个非常重要的酶。GGPS酶的催化产物GGPP是主要的类异戊二烯化合物，是植物中生长发育必须的化合物如类胡萝卜素、赤霉素、叶绿素及苯醌等的前体物质，它的供给对于类胡萝卜素的合成相当重要(Kai Ament等,2006)。Yong-sheng Liu等(2003)最早将GGPS基因初步定位于潘那利番茄(Solanum pennelliiLA716)的第4染色体末端。Kai Ament等(2006)从番茄Moneymaker中克隆了 GGPS基因(DQ267903)，并进行了原核表颜色互补功能验证。国艳梅等(2006)对源于多毛番茄的控制果实颜色等性状进行了 QTL定位，将多毛番茄GGPS基因与控制番茄红素含量QTL位点(qlyc)定位在同一区间。钟秋月等(2009)分别从多毛番茄和普通番茄中克隆了 GGPS，此基因不存在内含子而且基因编码区长度一致。所推导氨基酸序列存在13个差异位点，结构分析显示氨基酸变异导致了两个基因的二级结构与磷酸化位点的不同，这些差异素可能导致酶活性的差异， 进而导致下游产物番茄红素的积累量的差异。类胡萝卜代谢途径中许多基因已得到了克隆，在大肠杆菌中构建番茄红素代谢途径进行原核表达可以对这些基因进行功能验证(Misawa et al. , 1995)。RoseM等(1988)最早建立携带欧文氏菌控制番茄红素合成基因的质粒pACCRT-EIB，将其转入大肠杆菌后生产出番茄红素。zhu等(1997)从拟南芥中克隆了基因GGPS5，通过在大肠杆菌中进行功能实验验证了其功能。Kai Ament等(2006)从番茄中克隆了 GGPS基因，并进行了原核表达颜色互补功能验证。但不同来源的GGPS基因所转录的酶活性具有明显的差异，因此获得一种有助于提高番茄红素的基因将为进一步开发利用番茄野生资源、品种改良提供新的思路，开拓新的研究领域。
发明内容
本发明的目的在于提供一种T-GGPS基因在提高植物番茄红素含量中的应用。本发明的目的还在于提供一种制备富含番茄红素转基因番茄的方法。所述的基因为T-GGPS，其核苷酸序列如SEQ ID No. 9所示，来自多毛番茄的近等基因系(编号TA517)，该近等基因系番茄红素含量为93. 3mg kg'本发明提供了 T-GGPS基因在提高植物番茄红素含量中的应用。所述植物为番茄、西瓜、南瓜、桃、木瓜、柑橘。本发明提供了一种培育富含番茄红素的转基因植株的方法，是将T-GGPS基因插入表达载体，得到重组表达载体，将该重组表达载体转化到目的植物的细胞中，在抗生素的选择压力下筛选阳性植株，进行培养。优选地，所述抗生素为卡那霉素。上述培育方法还包括对筛选得到的阳性菌株进行PCR检测，所用引物为 ⑶S-FATGTTACGTCCTGTAGAAACCCCAACCCGT ；⑶S-RTCATTGTTTGCCTCCCTGCTGCGGTTTTTC。上述培育方法还包括对阳性植株进行转录水平的RT-PCR检测，所用引物为⑶SRT-FCAACCCGTGAAATCAAAAAACTCG ；⑶SRT-RCAGGTGTTCGGCGTGGTGTAG。所述的重组表达载体为PBE121-T-GGPS。所述的转化方法为农杆菌介导法。所述目的植物为番茄。其培养条件为光照强度40 ii mol .IrT2-S4,温度(25± I) °C,光周期为16h光照，8h黑暗。本发明提供了上述方法在制备富含番茄红素植物中的应用。本发明过表达T-GGPS基因，农杆菌介导转化番茄叶盘，发现转基因番茄中番茄红素明显增加，因此能够作为外源基因参与培育具有富含番茄红素的转基因植物，具有潜在的应用价值，适于推广应用。本发明为通过基因工程手段增强植物的番茄红素含量提供了新的思路。
图I为PCR扩增获得GGPS基因，其中T TA517的扩增结果，即T-GGPS基因；E E6203 的扩增结果，即 E-GGPS 基因，M DNA marker DL IOObp;图2为PBI121-GGPS载体构建示意图；图3为转基因植株的再生及开花结果图，其中A:抗性苗；B:阳性植株生根；C :炼苗；图4为TO代转基因植株的PCR检测，其中M:DNA marker DLlOOObp; CK :野生植株；1-9:转基因植株；图5为Tl代转基因植株的PCR检测，其中M:DNA marker DL2000bp; CK-:野生植株；CK+:质粒 PBI121-CaMV35S ;1_11:转基因植株；图6为TO代转基因植株southern检测，其中CK+ :质粒PBI121_CaMV35S; 1-8:转
基因植株；图I为转基因植株RT-PCR检测，其中M:DNA marker DL 400bp ;其中ck为野生植株；1-11:转基因植株；图8为GGPS基因在转基因番茄和野生番茄的不同部位、不同时期的表达量分析，其中图8上图L :叶片；F :开放的花；EF :膨大期；MG :绿熟期；TF :转色器；RF :完熟期；图8下图1,3, 5，7,9, 11:转基因植株；2，4，6，8，10，12:未转化植株。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。若未特别指明，实施例中所用的化学试剂、原料、器材为可以通过购买获得的市售产品，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例II、实验材料
实施例中用于转基因受体材料的番爺(Solanaceae lycopersicum)Moneymaker来自中国农业科学院蔬菜花丼研究所；普通番爺(S. esculentum)(编号E6203)和源于多毛番茄(S.hirsutum)的近等基因系(编号TA517)用来分离GGPS基因，将2份基因分别命名为E-GGPS和T-GGPS。两个番茄品种番茄红素含量差异显著，分别在56. 5和93. 3mg kg—1左右，以合作研究的方式从美国康奈尔大学获得。农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株 EHA105,表达载体 PBI121_CaMV35S,来自中国农业科学院蔬菜花卉所生物技术室。2、方法2. IGGPS基因的分离、表达载体的构建果实总RNA的提取采用Invitrogen公司的TRIzol试剂盒完成；cDNA第一链的合成米用 Superscript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR 试剂盒完成。据NCBI公布的GGPS基因cDNA (DQ267903)序列设计特异引物，引入XbaI、SmaI两个酶切位点(引物横线部分)并在两端分别加上3个保护性碱基，克隆其cDNA序列。设计特异引物:GGPS-L和GGPS-R (见表I)。反应采用25 u L扩增体系:IOOng模板DNA, 0. 5uM引物，2.5 ii L 2 XBuffer, 2. 5mM MgCl2, 0. 25mM dNTPs, I. OU Taq 聚合酶。PCR 扩增条件:94°C 预变性 3min，94°C lmin,62°C lmin,72°C I. 5min，35 个循环；72 °C IOmin0 0. 8%(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测，Omega胶回收试剂盒纯化回收目的基因片段，测序，来自多毛番茄模板的T-GGPS基因，其核苷酸序列如SEQ ID No. 9所示；来自普通番茄模板的E-GGPS基因，其核苷酸序列如SEQ ID No. 10所示。将GGPS基因与pMD18-T载体的连接，转化大肠杆菌T0P10感受态细胞，PCR筛选阳性克隆，酶切验证并测序验证。根据引物上的两个酶切位点，分别双酶切GGPS基因与PBI121_CaMV35S质粒DNA，T4DNA ligase 16°C连接16 18h，之后采用热激法转化到大肠杆菌T0P10感受态细胞中。经PCR、酶切和测序验证，选择正确的克隆，并用电击法转化到农杆菌EHA105感受态细胞中。两个载体分别命名为PBI121-T-GGPS和PBI121-E-GGPS。2. 2农杆菌对番茄叶盘的遗传转化与培养条件番爺的遗传转化采用叶盘法。将在播种培养基(MS 2. 2g P+sucrose (鹿糖)25g r1+Agar(琼脂)6. 5g L^1pH 5. 8)培养8 IOd的无菌苗子叶切成均匀的两段，叶背朝下在预培养基上(MS4. 4g L_1+Sucrose (鹿糖)30g L4+Agar (琼脂)6. 5g L_1+Trans-zeatin(反式玉米素)Img L_1pH 5. 8),黑暗条件下进行预培养2 3d。从预先培养好的农杆菌平板上挑取单菌落，接种到含Kan(50mg -L^1)和Rif(50mg -L^1)的LB液体培养基中，在28 °C摇至OD6tltl=O. 6 0. 8 ;离心收集菌体，等体积液体MS培养基悬浮培养。将外植体浸泡在农杆菌悬浮液中IOmin后，用无菌滤纸吸干外植体上多余的农杆菌菌液，28 °C共培养基(MS 4. 4g L^+Sucrose (蔗糖)30g L^+Agar (琼脂)6. 5g L—i+Trans-zeatin (反式玉米素)Img L_1pH 5. 8)上黑暗条件下培养2 3d，以共培养后无明显的农杆菌为佳，操作过程中避免器械对外植体的伤害。共培养之后将外植体放到含有卡那霉素和特美汀的筛选培养基(MS 4. 4g !^+Sucrose (蔗糖)25g L klnositol(肌醇)IOOmg L ^Folic acid(叶酸)0. 5mg L :+Agar(琼月旨)6. 5g L—i+Trans-zeatin (反式玉米素)2mg .L-1+IAA (口引哚-3-乙酸)0. 2mg *L_1+Vc (维生素 c) 50mg *L i+Kan (卡那霉素)50mg *L 1+Timentin (特美汀)200mg *L :pH 5. 6)上进行再生培养。始终保持50mg -r1的卡那霉素筛选外植体。长出愈伤组织后7 IOd换一次培养基，挑出不长愈伤并白化的叶盘；3 4周长出有明显茎 的芽，及时切下再生芽转到生根培养基上(MS 4. 4g *L ^Sucrose 25g *L ^Inositol IOOmg *L ^Folic acid 0. 5mg *L :+Agar6. 5g L i+6-BA 0. 2mg L ^Kan 25mg L ^Timentin IOOmg L :pH 5. 8)进行生根培养。7 IOd会看到有根长出，3 4周长成为转基因植株。培养条件光照强度40 ii mol .nT2 温度(25± I) °C,光周期为16h光照，8h黑暗。2. 3转基因植株的分子鉴定(I) PCR筛选阳性植株番茄叶片基因组DNA的分离采用微量CTAB法(Williamson等，1994)。根据报告基因GUS设计引物，筛选阳性植株。设计引物=GUS-F和GUS-R(见表I)。对经卡那霉素(Kan)初步筛选得到的阳性植株进行PCR检测，预计PCR产物核苷酸序列大小为1800bp。反应采用 25 ii L 扩增体系100ng 模板 DNA，0. 5iiM 引物，2. L10XBuffer，2. 5mM MgCl2,0. 25mM dNTPs, I. OU Taq 聚合酶。PCR 扩增条件95°C预变性 3min ;94°C lmin，62°C lmin，72°C I. 5min，35个循环；72V IOmin0 TBE电泳液中，I. 5%(w/v)琼脂糖凝胶检测PCR产物。(2) Southern 印迹杂交选取经PCR鉴定呈阳性的植株大量提取基因组DNA，检测插入到植物基因组中T-DNA的拷贝数。建立Hind III酶切反应体系，20 y g左右的DNA被50U HindIII完全酶切后，0. 5XTBE电泳液中，0.8%(w/v)琼脂糖凝胶分离酶切产物。0. 4M NaOH将凝胶中的酶切产物变性后，在20XSSC中将酶切产物转移到带正电荷的尼龙膜(Amershan)上。琼脂糖凝胶电泳回收GUS基因，用DIG标记后作为探针；PCR扩增GUS基因引物GUSRT_F和⑶SRT-R (见表I)，片段核苷酸序列长度为526bp。按照罗氏杂交试剂盒(DIG High PrimeDNA Labeling and Detection Starter Kit I)完成 Southern 印迹杂交试验。(3) RT-PCR分析转基因植株总RNA的提取和cDNA第一链的合成方法同I. 2。以报告基因GUS作为检测的目的片段，对经PCR鉴定得到的阳性植株进行转录水平的检测；设计引物为=GUSRT-F和GUSRT-R,预计PCR产物核苷酸序列大小为526bp。以P-actin基因为内标基因，分析转T-GGPS基因植株和未转化植株的叶片、花以及四个不同时期(膨大期、绿熟期、转色期和完熟期)果实的GGPS基因的cDNA在不同器官中的表达差异；设计引物为EF-l_a-L和EF-I-a-R(见表I)。表I扩增所用引物
引物 Primer序列 Primer sequence (5，—3，)
GGPS-LGCTTCTAGAGGAAAAGAAAATGAGATC
GGPS-RGAGCCCXiGGCGATTC A A A ATTG ACTTT
GUS-FATGTTACGTCCTGTAGAAACCCCAACCCGTGlJS-RTCATTGTTTGCCTCCXTGCTGCGGTTT
权利要求
1.基因T-GGPS在提高植物番茄红素含量中的应用。
2.如权利要求I所述的应用，其特征在于，所述植物为番茄、西瓜、南瓜、桃、木瓜、柑橘。
3.一种培育富含番茄红素的转基因植株的方法，其特征在于，将T-GGPS基因插入表达载体，得到重组表达载体，将该重组表达载体转化到目的植物的细胞中，在抗生素的选择压力下筛选阳性植株，进行培养。
4.如权利要求3所述的方法，还包括对筛选得到的阳性菌株进行PCR检测，所用引物为 ⑶S-F ATGTTACGTCCTGTAGAAACCCCAACCCGT ； ⑶S-R TCATTGTTTGCCTCCCTGCTGCGGTTTTTC。
5.如权利要求4所述的方法，还包括对阳性植株进行转录水平的RT-PCR检测，所用引物为 ⑶SRT-F CAACCCGTGAAATCAAAAAACTCG ； ⑶SRT-R CAGGTGTTCGGCGTGGTGTAG。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的重组表达载体为PBE121-T-GGPS。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的转化方法为农杆菌介导法。
8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述目的植物为番茄。
9.如权利要求3所述的方法，其培养条件为光照强度40ymol ^nT2M-1，温度24-26°C，光周期为16h光照，8h黑暗。
10.权利要求3-9所述的方法在制备富含番茄红素植物中的应用。
全文摘要
本发明提供了T-GGPS基因在提高植物番茄红素含量中的应用，是通过基因工程的方法在植物中过表达基因T-GGPS实现番茄红素含量的增加。本发明通过构建重组表达载体PBE121-T-GGPS，根瘤农杆菌介导转化番茄Moneymaker，在卡那霉素的选择压力下筛选阳性植株；PCR、Southern杂交和RT-PCR检测证明T-GGPS基因已经插入到番茄基因组中并且能够转录及表达，制得的转基因番茄的番茄红素含量明显增加，说明T-GGPS基因对番茄中番茄红素积累起着显著的促进作用。
文档编号C12Q1/68GK102703478SQ201210162930
公开日2012年10月3日 申请日期2012年5月23日 优先权日2011年12月8日
发明者国艳梅, 杜永臣, 王孝宣, 高建昌 申请人:中国农业科学院蔬菜花卉研究所