Itga6基因突变检测特异性引物和液相芯片的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种ITGA6基因突变检测液相芯片和特异性引物，该液相芯片主要包括有：每种由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成的ASPE引物，所述特异性引物序列为：所述特异性引物序列为：针对A24240G位点的SEQ?ID?NO.11及SEQ?ID?NO.12，针对G1138A位点的SEQ?ID?NO.13及SEQ?ID?NO.14，针对A2082G位点的SEQ?ID?NO.15及SEQ?ID?NO.16，针对C251T位点的SEQ?ID?NO.17及SEQ?ID?NO.18，和/或针对T13360C位点的SEQ?ID?NO.19及SEQ?ID?NO.20；有anti-tag序列包被的微球；扩增引物。本发明所提供的检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100％，实现多个突变位点的野生型和突变型并行检测。
【专利说明】ITGA6基因突变检测特异性引物和液相芯片
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种ITGA6基因突变检测特异性引物和液相芯片。
【背景技术】
[0002]ITGA6称为整联蛋白a6,英文名称为integrin alpha 6(Itga6),位于2号染色体2q31上。ITGA6基因属于Integrins基因家族，该家族的基因是一些与细胞粘附相关的表面受体蛋白。ITGA6 基因通过形成 alpha6beta l-1ntegrin 或者是 alpha6beta4_integrin,在细胞上表皮上的粘附、固着、迁移过程中起作用。ITGA6基因极有可能在动脉内膜脂质沉积、局限性斑块的形成方面、对动脉粥样硬化起着重要作用，目前研究表明，ITGA6的基因组序列与动脉粥样硬化和/或冠心病、前列腺癌、多发性骨髓瘤、缺血性中风、甲状腺乳头状癌、浆液性肿瘤等密切相关。
[0003]目前，ITGA6基因突变检测方法主要有:荧光定量PCR技术，直接测序法，以PCR为基础的检测技术直接测序法和荧光定量PCR技术，存在灵敏度低，样品易污染、假阳性率高的缺点，并且存在着检测通量的局限性，每次只能检测一种突变类型，不能满足实际应用的需要。
【发明内容】
[0004]本发明的目的之一是提供ITGA6基因突变检测液相芯片，该液相芯片可用于单独或并行检测ITGA6基因五种常见基因型A24240G、G1138A、A2082G、C251T和T13360C的野生型和突变型。
[0005]实现上述目的的技术方案如下:
[0006]一种ITGA6基因突变检测液相芯片，包括有:
[0007](A).针对ITGA6基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对:每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为:针对A24240G位点的SEQ ID N0.11及SEQ ID N0.12，针对G1138A位点的SEQ ID N0.13及SEQ ID N0.14，针对A2082G位点的SEQ ID N0.15及SEQ ID N0.16，针对C251T位点的SEQ ID N0.17及SEQ ID N0.18，和/或针对T13360C位点的SEQ IDN0.19 及 SEQ ID N0.20 ;所述 tag 序列选自 SEQ ID N0.1 -SEQ ID N0.10 ；
[0008](B).有ant1-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述ant1-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述ant1-tag序列选自SEQ ID N0.21-SEQ ID N0.30，且所述ant1-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；
[0009]( C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。
[0010]在其中一个实施例中，所述扩增引物为:针对A24240G位点的SEQ ID N0.31及SEQID N0.32，针对 Gl 138A 位点的 SEQ ID N0.33 及 SEQ ID N0.34，针对 A2082G 位点的 SEQ IDN0.35 及 SEQ ID N0.36，针对 C251T 位点的 SEQ ID N0.37 及 SEQ ID N0.38，和 / 或针对T13360C 位点的 SEQ ID N0.39 及 SEQ ID N0.40。
[0011]在其中一个实施例中，所述ASPE弓丨物为:针对A24240G位点的由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.11组成的序列及由SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.12组成的序列，针对G1138A位点的由SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.13组成的序列及由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.14组成的序列，针对A2082G位点的由SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.15组成的序列及由SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.16组成的序列，针对C251T位点的由SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.17组成的序列及由SEQ ID N0.8和SEQ ID N0.18组成的序列，和/或针对T13360C位点的由SEQ IDN0.9和SEQ ID N0.19组成的序列及由SEQ ID N0.10和SEQ ID N0.20组成的序列。
[0012]本发明的另一目的是提供用于ITGA6基因突变检测的特异性引物。
[0013]具体技术方案如下:
[0014]用于ITGA6基因突变检测的特异性引物，所述特异性引物序列为:针对A24240G位点的 SEQ ID N0.11 及 SEQ ID N0.12，针对 G1138A 位点的 SEQ ID N0.13 及 SEQ ID N0.14，针对 A2082G 位点的 SEQ ID N0.15 及 SEQ ID N0.16，针对 C251T 位点的 SEQ ID N0.17 及SEQ ID N0.18，和 / 或针对 T13360C 位点的 SEQ ID N0.19 及 SEQ ID N0.20。
[0015]本发明的主要优点在于:
[0016]1.本发明所提供的检测方法与测序法的吻合率高达100%。且检测所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合实际应用需要。所制备的ITGA6基因突变检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及ant1-tag序列之间基本上不存在交叉反应，tag标签序列、ant1-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体ASPE引物的结合，能够避免交叉反应，实现多个突变位点的并行检测。
[0017]2.本发明通过发明人长期积累的设计经验和大量的实验操作，从众多的特异性引物中选取了最优的组合。本发明设计的ASPE引物特异性引物能够灵敏特异地识别目标检测的突变位点，准确区分各种型别的基因型；在同一个反应体系中，不同的特异性引物之间、特异性引物与非目标检测的PCR扩增产物之间基本上不存在交叉反应，检测特异性好，交叉反应率低于3% ;除了能够检测单个位点突变情况，也能够同时并行检测多个突变位点的突变情况，检测效果一致。
[0018]3.本发明的检测方法步骤简单，5种突变位点检测可通过一步PCR即可完成5条含有突变位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。
[0019]4.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。
【具体实施方式】
[0020]实施例1ITGA6基因突变检测液相芯片，主要包括有:
[0021]一、ASPE 引物
[0022]针对ITGA6 基因五种常见基因型 A24240G、G1138A、A2082G、C251T 和 T13360C 的野生型和突变型，分别设计特异性引物序列。ASPE引物由“tag序列+特异性引物序列”组
【权利要求】
1.一种ITGA6基因突变检测液相芯片，其特征在于，包括有: (A).针对ITGA6基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对:每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为:针对A24240G位点的SEQ ID N0.11及SEQ ID N0.12，针对G1138A位点的 SEQ ID N0.13 及 SEQ ID N0.14，针对 A2082G 位点的 SEQ ID N0.15 及 SEQ ID N0.16，针对C251T 位点的 SEQ ID N0.17 及 SEQ ID N0.18，和 / 或针对 T13360C位点的 SEQ ID N0.19及 SEQ ID N0.20 ;所述 tag 序列选自 SEQ ID N0.1 -SEQ ID N0.10 ； (B).有ant1-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述ant1-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述ant1-tag序列选自SEQ ID N0.21-SEQ ID N0.30，且所述ant1-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对； (C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。
2.根据权利要求1所述的ITGA6基因突变检测液相芯片，其特征在于，所述扩增引物为:针对A24240G位点的 SEQ ID N0.31 及 SEQ ID N0.32，针对G1138A位点的 SEQ ID N0.33及SEQ ID N0.34，针对A2082G位点的SEQ ID N0.35及SEQ ID N0.36，针对C251T位点的SEQID N0.37 及 SEQ ID N0.38，和 / 或针对 T13360C 位点的 SEQ ID N0.39 及 SEQ ID N0.40。
3.根据权利要 求1或2所述的ITGA6基因突变检测液相芯片，其特征在于，所述ASPE引物为:针对A24240G位点的由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.11组成的序列及由SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.12组成的序列，针对Gl 138A位点的由SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.13组成的序列及由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.14组成的序列，针对A2082G位点的由SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.15组成的序列及由SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.16组成的序列，针对C251T位点的由SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.17组成的序列及由SEQ ID N0.8和SEQ ID N0.18组成的序列，和/或针对T13360C位点的由SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.19组成的序列及由SEQID N0.10和SEQ ID N0.20组成的序列。
4.根据权利要求1所述的ITGA6基因突变检测液相芯片，其特征在于，所述间隔臂为5— 10 个 T。
5.用于ITGA6基因突变检测的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物序列为:针对A24240G 位点的 SEQ ID N0.11 及 SEQ ID N0.12，针对 G1138A 位点的 SEQ ID N0.13 及 SEQID N0.14，针对 A2082G 位点的 SEQ ID N0.15 及 SEQ ID N0.16，针对 C251T 位点的 SEQ IDN0.17 及 SEQ ID N0.18，和 / 或针对 T13360C 位点的 SEQ ID N0.19 及 SEQ ID N0.20。
【文档编号】C12N15/11GK103451270SQ201210179333
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2012年5月31日 优先权日:2012年5月31日
【发明者】许嘉森, 何嘉英 申请人:益善生物技术股份有限公司