专利名称：一种可常温保存和运输的核酸等温扩增反应试剂的制作方法
技术领域：
本发明属于生化试剂技术领域，具体涉及ー种核酸等温扩增反应试剂，即ー种可以在常温保存和运输的核酸等温扩增反应试剂。
背景技术：
核酸等温扩增(isothermalnucleic acid amplification)是核酸扩增技术的一类，它们能在某一特定的温度下，扩大特定DNA或RNA片段的拷贝数。最近几年，产生了一系列新型的核酸等温扩增技术，这些技术或基于DNA/RNA生物合成机制研究的新发现，或者利用具有特殊功能的聚合酶来实现恒温条件下对目标核酸的扩增；无论在实际操作还是在仪器要求方面，这些等温扩增技术都比PCR技术更简单和廉价，从而更容易被开发和利用。尤其是在核酸检测及诊断领域，等温扩增技术正逐渐成为PCR技术的替代方法而被广泛应用。利用等温扩增技术开发的各类检测及诊断产品在特异性、易用性、成本和方便性等方面具有PCR技术产品无可比拟的优势，市场前景极为广阔。 虽然等温扩增技木本身优势明显，但基于等温扩增技术的试剂在大規模应用过程中却面临ー些问题的困扰，其中最为突出的是试剂需要低温冷冻保存和运输。作为核酸扩增技术的ー种，等温扩增也需要由具有生物活性的酶的參与，而酶生物活性的长期保持需要低温冷冻条件，同时等温扩增反应所需的寡聚核苷酸引物、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)和反应缓冲液等均需在冷冻条件下贮存，并且反复冻融会使这些成份失效。所以基于等温扩增技术的产品也是要求在低温冷冻条件进行运输和保存。这ー方面増加了运输成本，另ー方面也限制了这些试剂盒在不具备低温保存条件的环境或地区的应用。对于大規模生产、商品化的基于等温扩增技术的试剂盒，为了保证产品的一致性、稳定性和可靠性，也要求尽可能把各种反应试剂一次性添加和分装，并使产品在贮存和运输过程中具备尽可能长的保质期限。因此，发明一种能够方便有效保存等温扩增反应试剂混合物的方法具有重要的价值。发明专利“环介导等温扩增反应试剂混合物的保存方法(200810159414. 3)”公开了ー种在环介导等温扩增反应试剂混合物中添加干燥保护剂然后进行真空干燥或快速风干实现环介导等温扩增反应试剂混合物常温长期保存的方法。但这种方法需要专门的真空冷冻干燥仪或快速风干机等复杂的设备，还需要消耗大量的能源，并不是ー种十分经济的方法。
发明内容
本发明的目的是提供ー种核酸等温扩增反应试剂，即ー种可以在常温保存和运输的核酸等温扩增反应试剂，从而弥补现有技术的不足。本发明的核酸等温扩增反应试剂，是将ー种或几种核酸等温扩增反应液的组分包埋在凝胶内制备的。上述的凝胶，其熔点低于核酸等温扩增聚合酶的灭活温度。上述的凝胶，还可以包括有熔点高于核酸等温扩增聚合酶的灭活温度的凝胶，这种高熔点的凝胶必须与熔点低于核酸等温扩增聚合酶的灭活温度的凝胶同时添加，添加比例不高于熔点低于核酸等温扩增聚合酶的灭活温度的凝胶质量的10%。上述的核酸等温扩增反应液的组分为核酸等温扩增的聚合酶。上述的核酸等温扩增反应液的组分为引物、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)和/或三磷酸核苷酸(NTP)、核酸等温扩增的聚合酶、核酸等温扩增的聚合酶的反应缓冲液。上述核酸等温扩增的聚合酶为DNA聚合酶和/或RNA逆转录酶。上述核酸等温扩增的聚合酶为DNA聚合酶和/或RNA聚合酶。核酸等温扩增的聚合酶的反应缓冲液为核酸序列依赖性扩增的反应缓冲液、链替代扩增反应缓冲液或环介导等温扩增反应缓冲液。上述的可常温保存的核酸等温扩增反应试剂，其一种制备方法如下首先将可形成凝胶的物质添加到核酸等温扩增反应液的组分中，然后在低于核酸等温扩增的聚合酶的灭活温度下将凝胶熔解，最后冷却凝固凝胶制成的。另ー种制备方法如下首先将可形成凝胶的物质与水混合加热使之溶解配成浓缩的母液，然后将浓缩的母液加入到核酸等温扩增反应液的组分中，最后让温度下降使混合物由液态凝固为固态或半固态的凝胶完成制备。上述的可形成凝胶的物质在核酸等温扩增反应液的组分中的添加浓度质量体积百分比g/ml为O. 01% 30%。上述的可以形成凝胶的物质为能形成凝胶的多糖类物质和/或明胶类物质。上述的可以形成凝胶的物质为能形成凝胶的人工聚合物。上述的能形成凝胶的多糖类物质和/或明胶类物质为淀粉、糊精、凝结多糖(又称凝结胶、凝胶多糖、热凝胶、可得然胶、卡德兰)、结冷胶、黄原胶、槐豆胶、亚麻籽胶、魔芋胶、壳聚糖、琼脂、琼脂糖、低熔点琼脂糖、超低熔点琼脂糖、红藻胶、海藻酸(又称藻酸、褐藻酸、海藻素)、海藻酸盐(如海藻酸钠，又被称为海藻胶、褐藻胶或藻胶)、卡拉胶、果胶、低甲氧基果胶、明胶和阿拉伯胶中的任ー种或几种。上述的能形成凝胶的人工聚合物为甲基纤维素、羧甲基纤维素、丙烯酰胺、聚丙烯酰胺中的任ー种或几种。上述的凝结多糖在核酸等温扩增反应液的组分中的添加浓度质量体积百分比g/ml为O. 2% 3%，优选为O. 5% 2%。上述的超低熔点琼脂糖在核酸等温扩增反应液的组分中的添加浓度质量体积百分比g/ml为O. 3% 3. 5%，优选为O. 5% 3%。本发明还提供ー种等温扩增试剂盒，包括有上述的可在常温状态长期保存的核酸等温扩增反应试剂。本发明提供的核酸等温扩增反应试剂以及等温扩增试剂盒，可常温贮存和运输，使用时无需特殊处理即可直接使用。由于处理后的等温扩增反应试剂混合物呈固态状，可以很方便的进行航空运输，克服了此前反应试剂混合物呈液态较难利用航空方式进行长距离运输的难题。同时本发明的方法和试剂盒具有エ艺简单、成本低廉的特点，在大大降低等温扩增反应试剂的贮运成本的同时，还为等温扩增反应的实际操作带来极大的便利。本发 明必将有力促进等温扩增技术的在科研、医疗、检验和检疫等领域的运用和基于等温扩增技术的诊断或检测试剂产品的大規模推广应用。
具体实施例方式在目前使用的核酸等温扩增反应试剂及试剂盒中，若是直接将核酸等温扩增反应试剂(即核酸等温扩增反应液的组分)如寡聚核苷酸引物、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)或三磷酸核苷酸(NTP)、聚合酶(DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆转录酶等)、聚合酶的反应缓冲液(不同类型的等温扩增反应需要不同的聚合酶和反应试剂)等的混合物保存在常温或者室温条件下，通常情况下广2天后这些反应试剂混合物就失去了对目的核酸的扩增能力。研究发现，在常温或室温的条件下，等温扩增反应液(即等温扩增反应试剂混合物)中最容易失去反应活性的是聚合酶，而这些聚合酶丧失活性的主要原因是由于长时间保存、温度过高或温度变化导致酶活性中心維持高级结构的氢键、离子键、ニ硫键等分子作用カ受到破坏所致。而且，在常温或室温条件下，等温扩增反应液(即等温扩增反应试剂混合物)中的寡聚核苷酸引物、dNTP也会很快降解，无法參与基因扩增。申请人在长期的研究中发现，在等温扩增反应试剂混合物中添加O. 01%^30% (W/V，即重量体积比g/ml)可以形成凝胶的物质，加热至合适的温度使凝胶分子熔解(或溶解)，然后使反应试剂混合物温度下降，混合物可 由液态变为固态(或半固态)的凝胶，聚合酶分子就会被凝胶分子形成的三维网状结构所固定，酶分子的空间结构(三维结构或高级结构)得以长期維持，聚合酶的活性即可长期保持；同时，凝胶也会将等温扩增反应试剂混合物中的引物、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)或三磷酸核苷酸(NTP)及聚合酶反应缓冲液中的各种成分固定，使其包埋在凝胶分子形成的微孔内，彼此间形成物理性的隔断，并且也隔绝了空气，从而使等温扩增反应试剂混合物的各种成分在常温下得以长期稳定保存。当需要使用添加了凝胶的等温扩增反应试剂或其混合物时，只需在其中加入等温扩增反应所需的其他试剂成分和核酸模板，加热到一定温度进行保温，在这ー温度下凝胶完全熔化成液态，等温扩增反应即可顺利进行。上述添加凝胶后的等温扩增反应试剂混合物进行等温扩增反应所得的结果与用新鮮配制的反应混合物所得到的结果完全相同。因不同类型的等温扩增所需的最适反应温度不同，所以不同类型的等温扩增反应试剂混合物需要添加不同种类、不同熔点的凝胶或其不同比例的混合物来实现基于凝胶固定的常温长期保存。实际使用中，可根据等温扩增所需要的最适温度选择在该温度下能够完全或部分熔解的凝胶以取得较佳保护及扩增效果。通常情况下，所选用的凝胶的熔点应低于用于核酸等温扩增的聚合酶的灭活温度，有时为了提高凝胶的强度，可以添加部分熔点高于用于核酸等温扩增的聚合酶的灭活温度的凝胶，但这种高熔点的凝胶必须与熔点低于用于核酸等温扩增的聚合酶的灭活温度的凝胶同时添加，且添加比例不高于熔点低于用于核酸等温扩增的聚合酶的灭活温度的凝胶的10%。如可利用“ 10%明胶+0. 1%结冷胶”的方式提高明胶的强度，或可利用“2. 0%琼脂糖+0. 2%聚丙烯酰胺”的方式提高琼脂糖凝胶的強度(上述百分比表示凝胶在核酸等温扩增反应液的组分中的添加浓度，为质量体积百分比 g/ml)。上述凝胶是指溶液中的胶体粒子或高分子在一定条件下互相连接或自身分子吸水膨胀，形成空间网状结构，结构空隙中充满了作为分散介质的液体的ー种特殊的分散体系O以下通过实施例对本发明作进ー步说明。
实施例I 基于环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)的试剂盒中反应试剂混合物添加凝胶后的保存效果分析I.组装下列各组分到试剂盒的包装盒中(I)扩增检测管，内装LAMP反应试剂混合物和核酸染料；(2)阴性对照管，内装无白斑综合征病毒核酸(White spot syndrome virus,WSSV)的FTA膜片；(3)阳性对照管，内装吸附了 WSSV核酸的FTA膜片；上述FTA膜片为英国Whatman的FTA卡上样品区裁剪下来，大小3平方毫米的纸片。2. LAMP反应试剂混合物添加不同浓度和不同种类凝胶进行保存将除被测样品核酸以外的各种LAMP反应试剂的混合物6048 μ L (包括LAMP弓丨物FIP 和 BIP 各 I. 6 μ M，引物 F3 和 Β3 各 0. 2 μ M，dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP 各 I. 4mM,MgCl26mM,甜菜碱 1M，Tris-HCl 20mM,KCl 10mM，MgS042mM，(NH4)2SO4IOmM, Triton X-1000· l%，Bst DNA聚合酶2016U)按每管432 μ L分装于14个I. 5mL的离心管中，按表I第I列(共14行)所示的浓度和种类向每个I. 5mL的离心管中加入可形成凝胶的物质并混匀，然后将I. 5mL的离心管置于金属浴上，按照不同凝胶的溶解温度于5(T65°C保温5分钟(应低于BstDNA聚合酶的灭活温度80°C)，使凝胶充分溶解，再将每个I. 5mL离心管中的混合物按24 μ L的量分装于18个0. 2mL的离心管中，然后将每组18个装有混合物的0. 2mL的离心管分装入试、剂盒，将试剂盒分别置于4°C、20°C (常温)、37°C条件下保存(每个温度条件下保存6个试剂盒，分3个保存时间抽检，每次抽检2个试剂盒作为重复)。3. LAMP反应试剂混合物添加两种及两种以上凝胶进行保存将除被测样品核酸以外的各种LAMP反应试剂的混合物6048 μ L (包括LAMP弓丨物FIP 和 BIP 各 I. 6 μ M，引物 F3 和 B3 各 0. 2 μ M，dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP 各 I. 4mM，甜菜碱1M, Tris-HCl 20mM, KCl IOmM, MgS048mM, (NH4)2SO4IOmM, Triton X-1000· 1%，BstDNA 聚合酶2016U)按每管432 μ L分装于14个I. 5mL的离心管中，按表2第I列(共14行)所示的浓度和种类向每个I. 5mL的离心管中加入凝胶并混匀，然后将I. 5mL的离心管置于金属浴上，按照不同凝胶的溶解温度于5(T65°C保温5分钟，使凝胶充分溶解，再将每个I. 5mL离心管中的混合物按24 μ L的量分装于18个0. 2mL的离心管中，然后将每组18个装有混合物的
0.2mL的的离心管分装入试剂盒，将试剂盒分别置于4°C、20°C、37°C条件下保存(每个温度条件下保存6个试剂盒，分3个保存时间抽检，毎次抽检2个试剂盒作为重复)。4.试剂盒内LAMP反应试剂混合物的保存和有效性检验保存于4°C的试剂盒分别在贮存期满2个月、4个月和6个月时进行抽样检验，保存于20°C的试剂盒分别在贮存期满I个月、2个月和3个月时进行抽样检验，保存于37°C的试剂盒分别在贮存期满10天、20天和30天时进行抽样检验。检验方法如下I)依据上述9个贮存时间段，共需进行9批次、每批次56个的试剂盒的有效性检测，每次检测的时候需将变性后的对虾WSSV的核酸(30ng/ μ L) 56 μ L等量分装于56个试剂盒的装有混合有凝胶的LAMP反应试剂混合物的0. 2mL的离心管中。同吋，按照本实施例步骤2中的试剂比例配制新鲜的LAMP反应液24μ L，添加变性后的WSSV核酸(30ng/l·! L)
Iμ L，作为阳性对照。
2)将上述离心管于63° C保温60miη进行LAMP反应。LAMP反应终止后，在每个离心管中加入2 μ L 10倍稀释的核酸染料GeneFinder ，然后于90° C保温5min使反应产物染色并终止反应。如果离心管中反应液呈现绿色，则说明该离心管中的LAMP反应试剂的混合物具有正常的反应活性，该试剂盒正常；如果离心管中反应液呈现橙黄色，则说明该离心管中的LAMP反应试剂的混合物已失去正常的反应活性，该试剂盒已失效。检测结果显示，实验设置的阳线对照均显色绿色，表明该LAMP反应体系工作正常；实验设置的空白对照组(LAMP反应试剂的混合物中不添加任何凝胶直接在4° C、20°C和37° C条件下保存)均显色橙黄色，表明LAMP反应试剂的混合物不添加任何凝胶而直接放置在4° C、200C和37 ° C条件下， 经过上述时间的保存后，已丧失反应能力，相应的其试剂盒已无法正常使用；对上述添加不同浓度、不同种类凝胶的LAMP反应试剂混合物的试剂盒的保存效果的检测结果见表I和表2。对上述部分阳性对照、空白对照和添加凝胶的反应体系扩增后的产物进行电泳检測，结果显示扩增后染色反应液显示绿色样本的其电泳泳道均出现LAMP产物的典型LADDER带型，扩增后染色反应液显示橙黄色的样本其电泳泳道均未出现LAMP产物的典型LADDER带型。添加不同浓度、不同种类凝胶的LAMP反应试剂混合物的试剂盒的保存效果的后检测结果(见表I和2)表明保存时间为I个月、2个月时，在4°C和20°C条件下贮存的混合物绝大部分都具有正常的反应活性；保存时间为10天时，在37°C条件下贮存的混合物绝大部分都具有正常的反应活性。另外，针对阳性对照管中吸附了 WSSV核酸的FTA膜片进行检测，发现该FTA膜片吸附的病毒核酸也依然能够作为LAMP反应的模板进行正常扩增；这与Whatman公司所称的该TFA卡片能够长期室温保存核酸相符合。表I.不同浓度、不同种类凝胶对试剂盒内LAMP反应试剂混合物的保护效果
权利要求
1.ー种可常温保存和运输的核酸等温扩增反应试剂，其特征在于，所述的核酸等温扩增反应试剂是将ー种或几种核酸等温扩增反应液的组分包埋在凝胶内制备的。
2.如权利要求I所述的核酸等温扩增反应试剂，其特征在于所述的凝胶，其熔点低于用于核酸等温扩增的聚合酶的灭活温度。
3.如权利要求2所述的核酸等温扩增反应试剂，其特征在于所述的凝胶，还包括有熔点高核酸等温扩增的聚合酶的灭活温度的凝胶，且熔点高于核酸等温扩增的聚合酶的灭活温度的凝胶的添加质量比例不高于熔点低于用于核酸等温扩增的聚合酶的灭活温度的凝胶的10%。
4.如权利要求I所述的核酸等温扩增反应试剂，其特征在于所述的核酸等温扩增反应液的组分为核酸等温扩增的聚合酶。
5.如权利要求I所述的核酸等温扩增反应试剂，其特征在于所述的核酸等温扩增反应液的组分为引物、三磷酸脱氧核苷酸和/或三磷酸核苷酸、核酸等温扩增的聚合酶、核酸等温扩增的聚合酶的反应缓冲液。
6.如权利要求2-5任一项所述的核酸等温扩增反应试剂，其特征在于所述的核酸等温扩增的聚合酶为DNA聚合酶和/或RNA逆转录酶。
7.如权利要求2-5任一项所述的核酸等温扩增反应试剂，其特征在于所述的核酸等温扩增的聚合酶为DNA聚合酶和/或RNA聚合酶。
8.如权利要求5所述的反应试剂，其特征在于所述的核酸等温扩增的聚合酶的反应缓冲液为依赖核酸序列扩增的反应缓冲液、链替代扩增反应缓冲液或环介导等温扩增反应缓冲液。
9.权利要求I所述的反应试剂的制备方法如下首先将可形成凝胶的物质添加到核酸等温扩增反应液的组分中，然后在低于核酸等温扩增的聚合酶的灭活温度下将凝胶熔解，最后冷却凝固制成的。
10.如权利要求I所述的反应试剂的制备方法如下首先将可形成凝胶的物质与水混合加热使之溶解配成浓缩的母液，然后将浓缩的母液加入到核酸等温扩增反应液的组分中，最后让温度下降使混合物由液态凝固为固态或半固态完成制备。
11.如权利要求9或10所述的制备方法，其特征在于所述的可形成凝胶的物质在核酸等温扩增反应液的组分中的添加浓度质量体积百分比g/ml为O. 019Γ30%。
12.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于所述的可形成凝胶的物质为能形成凝胶的多糖类物质和/或明胶类物质。
13.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于所述的可形成凝胶的物质为能形成凝胶的人工聚合物。
14.如权利要求12所述的制备方法，其特征在于所述的多糖类物质和/或明胶类物质为淀粉、糊精、凝结多糖、结冷胶、黄原胶、槐豆胶、亚麻籽胶、魔芋胶、壳聚糖、琼脂、琼脂糖、低熔点琼脂糖、超低熔点琼脂糖、红藻胶、海藻酸、海藻酸盐、卡拉胶、果胶、低甲氧基果胶、明胶或阿拉伯胶中的任ー种或几种。
15.如权利要求13所述的制备方法，其特征在于所述的人工聚合物为甲基纤维素、羧甲基纤维素、丙烯酰胺、聚丙烯酰胺中的任ー种或几种。
16.如权利要求14所述的制备方法，其特征在于所述的凝结多糖在核酸等温扩增反应液的组分中的添加浓度质量体积百分比g/ml为O. 2°/Γ3%。
17.如权利要求14所述的制备方法，其特征在于所述的超低熔点琼脂糖在核酸等温扩增反应液的组分中的添加浓度质量体积百分比g/ml为O. 39Γ3. 5%。
18.—种等温扩增试剂盒，包括有权利要求I所述的反应试剂。
全文摘要
本发明涉及一种可常温保存和运输的核酸等温扩增反应试剂，以及包含有该核酸等温扩增反应试剂的试剂盒。所述的核酸等温扩增反应试剂是将一种或几种核酸等温扩增反应液的组分包埋在凝胶内制备的。本发明提供的核酸等温扩增反应试剂以及等温扩增试剂盒，可常温贮存和运输，使用时无需特殊处理即可直接使用。由于处理后的等温扩增反应试剂混合物呈固态状，可以很方便的进行航空运输，克服了此前反应试剂混合物呈液态较难利用航空方式进行长距离运输的难题。同时本发明的试剂盒具有工艺简单、成本低廉的特点，在大大降低等温扩增反应试剂的贮运成本的同时，还为等温扩增反应的实际操作带来极大的便利。
文档编号C12Q1/68GK102703429SQ20121017986
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月1日 优先权日2012年6月1日
发明者刘莉, 史成银, 张庆利, 梁艳, 王勤涛, 黄倢 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所