专利名称：一种全细胞高效催化木糖转化制取木糖酸(盐)的方法
技术领域：
本发明涉及木糖酸(盐)的制备方法，特别涉及一种全细胞高效催化木糖转化制取木糖酸(盐)的方法。
背景技术：
木糖的高效转化与利用是木质纤维类原料加工与利用，尤其是其生物炼制的关键性技术瓶颈。目前，木糖生物转化的主要产 品形式有燃料こ醇、木糖醇、木糖酸(盐)、乳酸、丁ニ酸和饲料酵母等。除木糖酸(盐)以外，受市场容量、环境污染和现有生产技术水平的局限，目前其它产品的发展空间都十分有限。木糖酸(盐)与葡萄糖酸(盐)的性能相近，可用作柠檬酸和葡萄糖酸等产品的替代品，它作为一种新兴的生物基化学品近年来它的用途被不断地发掘和拓展，主要的应用市场有水泥减水剂、分散剂和缓释剂、混凝土黏接剂、增塑剂、玻璃清洗剂、冶金除锈剂、金属离子螯合剂和纺织助漂剂等，还被用于粘胶纤维混纺以生产夏季冰爽纤维面料。其中，尤其是木糖酸(盐)在水泥减水剂和混凝土黏结剂领域的应用具有巨大的市场容量和广阔的发展前景。理论上可通过化学法、酶法和微生物发酵法转化木糖生成木糖酸(盐)(盐)。化学法主要是碘或钯催化法，反应条件苛刻，环境污染大，且催化剂易失活，生产成本高。酶法主要是指葡萄糖氧化酶(EC I. I. 3. 4)和木糖脱氢酶(EC I. I. I. 175和EC I. I. I. 179)，都存在着酶的底物专ー性限制、酶用量大、反应速率低和生产成本昂贵的严重不足。当前已经报道的木糖微生物发酵产木糖酸(盐)的木糖浓度最高值不超过13% (质量浓度，g/mL)，木糖利用率和木糖酸(盐)转化率最高值分别为90%和95%。因此，现有化学合成法和酶法转化木糖产木糖酸(盐)都不具备エ业化生产的条件，而微生物发酵法仍需要进ー步提高反应体系的底物和产物浓度、原料利用率和转化率，才能保证木糖乃至木质纤维原料生物炼制的エ业化生产的整体经济效益。
发明内容
发明目的针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种全细胞高效催化木糖转化制取木糖酸(盐)的方法，以实现提高底物木糖和产物木糖酸(盐)的浓度，提高设备的生产效率和降低生产成本，提高整体经济效益。技术方案为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下
一种全细胞高效催化木糖转化制取木糖酸(盐)的方法，包括以下步骤
(1)在液体深层通风反应体系中加入初始反应基质，接入氧化葡萄糖酸杆菌iGluconabacter ァt/a/75·),搅拌通风连续发酵,保持反应体系的溶氧浓度不低于10% ;其中，在初始反应基质中含有木糖和必要的无机盐，木糖的质量浓度大于13%，不高于15% ;初始发酵体系的PH值不低于3. O;
(2)采用半连续或连续分批添料方式，向发酵体系中添加木糖或木糖溶液，控制反应体系中的木糖质量浓度不高于25%，并同步调控pH值；
(3)添加至反应体系木糖累积加入质量浓度达到30%，停止添加，继续催化反应直至木糖利用率达到98%以上，木糖酸转化率达到99%以上。所述的氧化葡萄糖酸杆菌为ATCC 621-H菌株，或以ATCC 621-H菌株为宿主菌的基因重组菌株，或以ATCC 621-H菌株为出发菌株进行驯化改良后的菌株，接入量为使发酵体系的 OD6tltlnm= 1.0。所述分批添加木糖是指固体木糖或高浓度木糖液，同步调控所使用的碱性中和剂是指含有钙、钠、钾、镁、铵等离子的碱性固体或浓溶液，尤其是以粉状固体碳酸钙和碳酸钠为最优。采用同步操作可简化工艺，降低劳动强度。该全细胞高效催化木糖转化制取木糖酸(盐)的方法，针对木糖酸(盐)微生物发酵过程中存在的底物、产物和低PH值的抑制作用，充分利用氧化葡萄糖酸杆菌类微生物细胞所具有的木糖转运、糖氧化酶及辅酶等复合酶系，以全细胞作为催化体系，在液体深层通风 反应体系中通过半连续或连续式操作方式，分批同步添加木糖和碱性中和剤，一方面消除上述的抑制作用，另ー方面利用全细胞催化体系实现定向高效催化木糖生成木糖酸(盐)，进而极显著地提高底物木糖和产物木糖酸(盐)的浓度，显著提高设备的生产效率和降低生产成本。有益效果与现有技术相比，本发明利用全细胞催化木糖转化制取木糖酸(盐)的方法，通过连续或半连续分批同步添料的操作方式实现对反应体系的控制和定向催化，极显著地提高了底物木糖和产物木糖酸(盐)的反应浓度，显著提高了设备的生产效率和大幅度降低了木糖酸(盐)的生产成本，其中，底物木糖的累积浓度最高值可达到30%，木糖的最闻利用率超过99% ;广物木糖酸(盐)的最闻浓度值可达到29. 8%,木糖酸的转化率最闻值可达到100%ο
图I是全细胞催化木糖转化制取木糖酸(盐)的反应历程图；图中，横座标为反应时间(h)，纵座标为木糖和木糖酸(盐)的质量浓度。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进ー步的说明。以下实施例所使用的氧化葡萄糖酸杆菌为ATCC621-H菌株，来源于美国标准生物品收藏中心(American type culture collection, ATCC)。其中，氧化葡萄糖酸杆菌NL71以ATCC 621-H菌株为出发菌株进行长期驯化选育的菌株；驯化方法采用真实木质纤维稀酸水解液逐级增浓、平板筛选和摇瓶振荡发酵的測定方法；所得到的氧化葡萄糖酸杆菌NL71可直接发酵含有5(Tl00g/L木糖的玉米秸杆、杨木原料的稀酸水解液。稀酸水解液的制备方法全玉米稻杆剪切至3 5cm或杨木切片至长X宽X厚为3cmXl. 5cmX0. 5cm,按固液比I 3. 8 10 (质量比)加入1.0%硫酸(w/w)，于15(Tl80°C反应O. 2 2. 0h，过滤并洗涤得稀酸水解液，再经常规减压蒸发浓缩可得浓缩液。以下实施例中，木糖和木糖酸(盐)的測定方法采用高效液相离子色谱测定法，參照中国专利申请201210012963. 4，包括在美国Dionex ICS-3000离子色谱系统上采用CarboPacTM PAlO色谱柱带保护柱进行測定。柱温30°C，自动上样，进样体积10. O μ L ;以18 mmol/L、200 mmol/L氢氧化钠和500 mmol/L醋酸钠为淋洗液进行ニ元梯度淋洗,流速为
O.3 mL/min,在O 10 min内以18 mmol/L氢氧化钠溶液进行等度洗脱；10 20 min内醋酸钠溶液淋洗的浓度梯度为50 200 mmol/L，氢氧化钠溶液淋洗的浓度梯度为65. 4 70. 8 mmol/L ;采用20 40 min内氢氧化钠溶液淋洗的浓度为200 mmol/L对交换柱进行再生；采用40 50 min内氢氧化钠溶液淋洗的浓度为18 mmol/L对交换柱进行平衡；电化学检测器检测模式为金工作电极和pH-Ag/AgCl复合型參比电扱。采用外标法以积分和脉冲安培检测法和色谱峰面积积分法測定和计算各物质的浓度含量。实施例I 在3. OL全自动机械搅拌通风式发酵罐中，加入初始木糖质量浓度为9. 5%的木糖溶液1500mL，加入0. 4 8/1硫酸镁，1.5 g/L磷酸氢ニ钾和I. O g/L硫酸铵，控制搅拌速率为300r/min，通入无菌压缩空气至溶解氧浓度为10% 50%，接入活化后的氧化葡萄糖酸杆菌NL71至细胞浓度为OD6tltol = I. 0，加入粉状碳酸钙调节反应体系pH6. 5左右，进行全细胞催化反应。实时监测反应体系的pH值和木糖浓度，每隔2(T24h分3批同步加入约IOOg粉状固体木糖和碳酸钙，控制PH值为3. (Γ6. 5和木糖质量浓度不高于18% (g/mL)。如图1，反应至192h，反应体系的木糖质量浓度低于0. 12%，木糖酸(盐)的质量浓度为28. 4%。向反应体系累计添加底物木糖的质量浓度达到28. 6%。木糖利用率达到99%，木糖酸(盐)和转化率达到100%。实施例2
在10. OL全自动机械通风搅拌式发酵罐中，加入初始木糖质量浓度为15%的木糖溶液4L，加入0. 4 g/L硫酸镁，I. 5 g/L磷酸氢ニ钾和1.0 g/L硫酸铵，控制搅拌速率为280r/min，通入无菌压缩空气至溶解氧浓度为10°/Γ50%，接入活化后的ATCC 621-Η菌株至细胞浓度为OD6tltlnm = I. I，加入粉状碳酸钙调节反应体系ρΗ6. 5左右，进行全细胞催化反应。实时监测反应体系的pH值和木糖浓度，连续加入固体木糖，并实时控制pH值为
3.(Γ6. 5和木糖质量浓度不高于25%。添加至反应体系木糖累积加入质量浓度达到30%，停止添加，反应至木糖质量浓度低于0. 2%，测定木糖酸(盐)的质量浓度为29. 7%。木糖利用率达到99%，木糖酸(盐)和转化率达到100%。实施例3
在100 L全自动机械通风搅拌式发酵罐中，加入初始木糖质量浓度为14%的木糖溶液70L，加入0. 4 g/L硫酸镁，I. 5 g/L磷酸氢ニ钾和I. O g/L硫酸铵，控制搅拌速率为220r/min，通入无菌压缩空气至溶解氧浓度为15°/Γ40%，接入活化后的ATCC 621-Η菌株至细胞浓度为OD6tltlnm = I. I，加入粉状碳酸钙调节反应体系ρΗ6. 5左右，进行全细胞催化反应。实时监测反应体系的pH值和木糖浓度，分批加入高浓度木糖溶液，并实时控制pH值为3. (Γ6. 5和木糖质量浓度不高于20%。添加至反应体系木糖累积加入质量浓度达到29. 2%,停止添加，反应至木糖质量浓度低于0. 2%，测定木糖酸的质量浓度为29. 0%。木糖利用率达到99%，木糖酸(盐)和转化率达到100%ο
权利要求
1.一种全细胞高效催化木糖转化制取木糖酸(盐)的方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)在液体深层通风反应体系中加入初始反应基质，接入氧化葡萄糖酸杆菌，搅拌通风连续发酵，保持反应体系的溶氧浓度不低于10%;其中，在初始反应基质中含有木糖和必要的无机盐，木糖的质量浓度大于13%，不高于15% ;初始反应体系的pH值不低于3. 0 ； (2)采用半连续或连续分批添料方式，向发酵体系中添加木糖或木糖溶液，控制反应体系中的木糖质量浓度不高于25%，并同步调控pH值； (3)添加至反应体系木糖累积加入质量浓度达到30%，停止添加，继续催化反应直至木糖利用率达到98%以上，木糖酸转化率达到99%以上。
2.根据权利要求I所述的全细胞高效催化木糖转化制取木糖酸(盐)的方法，其特征在于所述的氧化葡萄糖酸杆菌接入量为使反应体系的OD6tltlnm = I. (Tl. I。·
3.根据权利要求I所述的全细胞高效催化木糖转化制取木糖酸(盐)的方法，其特征在于采用含有钙、钠、钾、镁或铵离子的碱性固体或浓溶液同步调控反应体系的PH值。
4.根据权利要求I所述的全细胞高效催化木糖转化制取木糖酸(盐)的方法，其特征在于所述的氧化葡萄糖酸杆菌为ATCC 621-H菌株，或以ATCC 621-H菌株为宿主菌的基因重组菌株，或以ATCC 621-H菌株为出发菌株进行驯化改良后的菌株。
全文摘要
本发明公开了一种全细胞高效催化木糖转化制取木糖酸(盐)的方法，在液体深层通风反应体系中加入初始反应基质，接入氧化葡萄糖酸杆菌，搅拌通风连续反应，保持反应体系的溶氧浓度不低于10%；采用半连续或连续分批添料方式，向反应体系中添加木糖或木糖溶液，控制反应体系中的木糖质量浓度不高于25%，并同步调控pH值不低于2.8；添加至反应体系木糖累积加入质量浓度达到30%，停止添加，继续催化反应完全可得转化产物木糖酸(盐)产品。该方法的底物木糖的累积浓度最高值可达到30%，木糖的最高利用率超过99%；发酵产物木糖酸(盐)的最高浓度值可达到29.8%，木糖酸(盐)的转化率最高值可达到100%。
文档编号C12R1/01GK102676608SQ201210191920
公开日2012年9月19日 申请日期2012年6月12日 优先权日2012年6月12日
发明者余世袁, 勇强, 徐勇, 王荥 申请人:南京林业大学