专利名称：基于多孔材料的多聚酶链反应试剂保存方法及反应试剂的制作方法
技术领域：
本发明属于生化试剂组合物的保存方法技术领域，具体涉及一种基于多孔材料的多聚酶链反应试剂保存方法及反应试剂，确切地说是分子生物学中多聚酶链反应试剂和试剂混合物的常温保存方法，以及采用该方法制作的可以常温保存和运输的反应试剂。
背景技术：
在过去的20年里，以多聚酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)为代表的核酸扩增技术得到了迅猛的发展和应用。由于PCR技术方便快捷、可在短时间内大量扩增目标核酸片段，所以该技术在基因克隆与重组表达、生物物种鉴别与分类、物种起源与进化、流行病病原检测和法医鉴定等领域得到了广泛的应用。PCR技术本身优势明显，但基于该技术的产品在大规模应用过程中却面临一些问题的困扰，其中最为突出的是产品需要低 温冷冻保存和运输。作为核酸扩增技术的一种，PCR扩增需要由具有生物活性的酶的参与，而酶生物活性的长期保持需要低温冷冻条件，同时PCR反应所需的寡聚核苷酸引物、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)和反应缓冲液等均需在冷冻条件下贮存，并且反复冻融会使这些成份失效，所以基于PCR扩增技术的产品要求在低温冷冻条件进行运输和保存，这一方面增加了运输成本，另一方面也限制了这些产品在不具备低温保存条件的环境或地区的应用。对于大规模生产、商品化的基于PCR扩增技术的产品，为了保证产品的一致性、稳定性和可靠性，也要求尽可能把各种反应试剂一次性添加和分装，并使产品在贮存和运输过程中具备尽可能长的保质期限。因此，发明一种能够方便有效保存PCR反应试剂混合物的方法具有重要的价值。发明专利“聚合酶链式反应混合物的保存方法(ZL 0011250. 4)”公开了一种利用核酸真空浓缩仪在低温条件下干燥PCR反应试剂混合物来实现PCR反应试剂混合物长期保存的方法，但这种方法需要专门的核酸真空浓缩仪或真空冷冻干燥仪等复杂的设备，还需要消耗大量的能源，并不是一种十分经济的方法。发明专利“含高浓度甘油的PCR和RT-PCR全预混试剂(ZL 03117011. O)”公开了一种利用添加30-65% (v/v)甘油实现PCR试剂低温长期保存的方法，但该方法无法用于PCR试剂的常温长期保存。因此，有必要提供一种简便、快捷的方法实现PCR试剂在常温条件下长期保存。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于多孔材料的多聚酶链反应试剂保存方法及反应试齐U，以弥补现有技术的不足。本发明的一个方面是提供一种在多聚酶链反应试剂中添加多孔材料而使多聚酶链反应试剂或其混合物能于常温或室温长期保存的方法。本发明的另一个方面是提供一种采用上述方法制作的多聚酶链反应试剂，以及包含有该反应试剂的试剂盒。本发明的基于多孔材料的多聚酶链反应试剂保存方法，其特征是在一种或几种多聚酶链反应液的组分中添加多孔材料进行保存。
上述的多聚酶链反应液的组分为多聚酶链反应DNA聚合酶。上述的多聚酶链反应液的组分还包括有寡聚核苷酸引物、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)和多聚酶链反应DNA聚合酶的反应缓冲液中的任一种或几种。上述的多聚酶链反应DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶。本发明的保存方法操作步骤如下首先将多孔材料添加到多聚酶链反应液的组分中，然后在低于多聚酶链反应DNA聚合酶灭活温度下使多聚酶链反应液的组分与多孔材料混匀进行保存。上述的多孔材料为孔径不小于I纳米的多孔材料。上述的多孔材料为有序多孔材料和/或无序多孔材料。
上述的有序多孔材料为微孔材料、介孔材料、大孔材料中的任一种或几种。上述的有序多孔材料为硅藻土、活性炭、氧化铝多孔陶瓷、氧化硅多孔陶瓷、介孔二氧化硅、SBA-15中的一种或几种。上述的无序多孔材料为多孔磷酸盐微晶玻璃、氧化硅凝胶、有机硅聚苯乙烯多孔材料中的一种或几种。上述的多孔材料在多聚酶链反应液的组分中的添加质量体积百分比g/ml为O. 005% 60%。上述的多孔磷酸盐微晶玻璃在多聚酶链反应液的组分中的添加质量体积百分比g/ml为1% 60%，优选为5% 50%。上述的硅藻土在多聚酶链反应液的组分中的添加质量体积百分比g/ml为O. 01% 10%，优选为 O. 02% 5%。上述的活性炭在多聚酶链反应液的组分中的添加质量体积百分比g/ml为O. 01% 35%，优选为 O. 02% 35%。上述的介孔二氧化硅在多聚酶链反应液的组分中的添加质量体积百分比g/ml为O. 01% 20%，优选为 O. 02% 20%。本发明还涉及一种可在常温下长期保存的多聚酶链反应试剂，该反应试剂是在一种或几种多聚酶链反应液的组分中添加多孔材料制备的。本发明还包括一种可以在常温保存和运输的多聚酶链反应试剂盒，该试剂盒包括有上述可在常温下长期保存的多聚酶链反应试剂，以及其它分子实验需要的组分。采用本发明方法处理后的多聚酶链反应试剂，可常温贮存和运输，使用时无需特殊处理，直接使用即可。同时本发明的方法和试剂盒具有工艺简单、成本低廉的特点，采用本发明方法处理后的多聚酶链反应试剂混合物及试剂盒在便利的贮存条件下(常温或室温等温度条件)具有活性稳定持久的优点，这在大大降低多聚酶链反应试剂的贮运成本的同时，还为多聚酶链反应的实际操作带来极大的便利。该发明必将有力促进多聚酶链反应技术的在科研、医疗、检验和检疫等领域的运用和基于多聚酶链反应技术的诊断或检测试剂产品的大规模推广应用。
具体实施例方式在目前的分子实验、检测操作中，若是直接将多聚酶链反应试剂(即多聚酶链反应液的组分)如引物、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)、DNA聚合酶、DNA聚合酶的反应缓冲液(不同类型的多聚酶链反应需要不同的反应试剂)等的混合物保存在常温或者室温条件下，通常情况下广2天后这些反应试剂混合物就失去了对目的核酸的扩增能力。申请人在研究中发现，在常温或室温的条件下，多聚酶链反应试剂混合物中最容易失去反应活性的是DNA聚合酶，而这些聚合酶丧失活性的主要原因是由于长时间保存或温度过高或温度变化导致聚合酶活性中心维持高级结构的氢键、离子键、二硫键等分子作用力受到破坏所致；此外，PCR反应试剂混合物中寡聚核苷酸引物、dNTP在常温或室温的条件下也会很快降解或失效。多聚酶链反应试剂中体积较大的有机活性成分如DNA聚合酶、模板核酸、引物和dNTP等分子质量在一至几十千道尔顿(kDa)之间，直径大约介于一至几十纳米(nm)。将多孔材料添加到多聚酶链反应液的组分中，聚合酶、核酸模板、引物和dNTP等分子会组装或固定在多孔材料的孔道中或多孔材料颗粒的间隙里，一方面聚合酶分子就会被多孔材料的孔道或间隙所固定，酶分子的空间结构(三维结构或高级结构)得以长期维持，聚合酶的活性即可长期保持；另一方面核酸模板、引物和dNTP等分子也会组装或固定在酶分子附近，能使酶更易与底物接触反应，从而即使在长期保存后仍能表现出较高的反应效率。在较便利的贮存条件下(如常温或室温)和一定的贮存期内，上述添加多孔材料后的多聚酶链反应液(即多聚酶链反应试剂混合物)进行扩增反应所得的结果与用新鲜配制的反应混合物所 得到的结果完全相同。因不同类型的PCR反应所需的聚合酶不同，所以不同类型的PCR反应试剂混合物需要添加不同种类、不同孔径的多孔材料实现常温长期保存。实际使用中，可以选用的多孔材料可以是孔道排布规则有序、孔径均一的孔径小于2nm的微孔材料、孔径在2 50nm介孔材料、孔径大于50nm的大孔材料(也称为宏孔材料)，也可以是孔径不规则的无序多孔材料如无定型的微晶玻璃、氧化硅多孔材料和氧化铝多孔材料等。将多聚酶链反应试剂混合物保存于常温或者室温，Γ2天后这些反应试剂混合物对目的核酸的扩增能力就基本完全丧失了。实验结果表明，采用本发明的方法处理后的多聚酶链反应试剂的混合物可以在常温或室温条件下存放3个月或以上而不会失去正常反应活性，在较高的温度条件下(如37°C)存放30天仍具有正常的反应活性。以下通过实施例对本发明作进一步说明。实施例I :PCR试剂混合物添加多孔材料后的保存效果分析I. PCR反应试剂混合物添加不同浓度和不同种类多孔材料进行保存将除核酸模板以外的各种PCR反应试剂的混合物22. 896mL (包括PCR引物F和引物 R 各 O. 4 μ M，dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP 各 I. 4mM, KC150mM, Tris/HCl (pH 9. 0) IOmM,MgCl2L 5mM, l%Triton X_100，Taq DNA 聚合酶 1147. 5U)按每管 432 μ L 分装于 53 个 I. 5mL的离心管中，按表I第I、2和3列(共53行，含不添加多孔材料的空白对照)所示的浓度和种类向每个I. 5mL的离心管中加入多孔材料并混匀(对于添加量较低的多孔材料，可预先配制成200倍最终添加量的高浓度预混液，然后摇匀悬浮后用移液枪吸取)，再将每个I. 5mL离心管中的混合物按24 μ L的量分装于18个O. 2mL的离心管中，然后将每组18个装有混合物的O. 2mL的离心管分别置于20°C (常温)与37°C条件下保存(每个温度条件下保存9个装有混合物的O. 2mL的离心管并分为3个时间组，每个时间组设置3个重复)。2. PCR反应试剂混合物添加两种及两种以上多孔材料进行保存将除核酸模板以外的各种PCR反应试剂的混合物4752 μ L (包括PCR引物F和引物 R 各 0.4 μ M，dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP 各 I. 4mM，KC150mM, Tris/HCl (pH 9. 0) IOmM,MgCl2L 5mM, l%Triton X-100，Taq DNA 聚合酶 247. 5U)按每管 432 μ L 分装于 11 个 I. 5mL 的离心管中，按表2第1、2和3列(共11行，含不添加多孔材料的空白对照)所示的浓度和种类向每个I. 5mL的离心管中加入多孔材料并混匀，(对于添加量较低的多孔材料，可预先配制成200倍最终添加量的高浓度预混液，然后摇匀悬浮后用移液枪吸取)，再将每个I. 5mL离心管中的混合物按24 μ L的量分装于18个O. 2mL的离心管中，然后将每组18个装有混合物的O. 2mL的离心管分别置于20°C (常温)与37°C条件下保存(每个温度条件下保存9个装有混合物的O. 2mL的离心管并分为3组，每组设置3个重复)。3. PCR反应试剂混合物的保存和有效性检验保存于20°C的装有反应试剂混合物的O. 2mL的离心管分别在贮存期满I个月、2个月和3个月时进行抽样检验，保存于37°C的装有反应试剂混合物的O. 2mL的离心管分别、在贮存期满10天、20天和30天时进行抽样检验。检验方法如下I)依据上述6个贮存时间段，共需进行6批次、每批次186个的PCR反应试剂混合物的有效性检测，每次检测的时候需将变性后的对虾白班综合征病毒(White spotsyndrome virus, WSSV)的核酸(30ng/ μ L) 186 μ L等量分装于186个装有混合有多孔材料的PCR反应试剂混合物的O. 2mL的离心管中。同时，按照本实施例步骤I中的试剂比例配制新鲜的PCR反应液24μ L，添加变性后的WSSV核酸(30ng/l·! L) I μ L，作为阳性对照。2)将上述离心管于放入PCR仪中进行PCR反应95°C保温5min，I个循环；95°C保温30sec，63°C保温30sec，72°C保温lmin，共35个循环；72°C保温5min，I个循环(为保证多孔材料吸附的TaqDNA聚合酶、引物和dNTP能充分的参与反应，需在PCR扩增过程中混匀O. 2mL离心管里的反应体系2 3次)。PCR反应终止后，将上述部分阳性对照、对照和添加多孔材料的反应体系扩增后的产物进行电泳检测，结果显示阳性对照有目的条带出现，实验设置的对照组(PCR反应试剂的混合物中不添加任何多孔材料直接在20°C和37° C条件下保存)均无扩增产物，添加不同浓度、不同种类多孔材料的PCR反应试剂混合物的保存效果的检测结果见表I和表2。添加不同浓度、不同种类多孔材料的PCR反应试剂混合物保存后的检测结果(见表I和2)表明保存时间为I个月、2个月时，在20°C条件下贮存的混合物绝大部分都具有正常的反应活性；保存时间为10天和20天时，在37°C条件下贮存的混合物绝大部分都具有正常的反应活性。表I.不同浓度、不同种类多孔材料对PCR反应试剂混合物的保护效果
权利要求
1.一种多聚酶链反应试剂的保存方法，其特征在于，是在一种或几种多聚酶链反应液的组分中添加多孔材料进行保存。
2.如权利要求I所述的保存方法，其特征在于所述的多聚酶链反应液的组分为多聚酶链反应聚合酶。
3.如权利要求I和2所述的保存方法，其特征在于所述的多聚酶链反应液的组分还包括有引物、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)、多聚酶链反应聚合酶的反应缓冲液的任一种或几种。
4.如权利要求2或3所述的保存方法，其特征在于所述的多聚酶链反应聚合酶为DNA聚合酶。
5.如权利要求4所述的保存方法，其特征在于所述的DNA聚合酶为TaqDNA聚合酶。
6.如权利要求I所述的保存方法，其特征在于所述的多孔材料在多聚酶链反应液的组分中的添加质量体积百分比g/ml为0. 005%飞0%。
7.如权利要求I或6所述的保存方法，其特征在于所述的多孔材料为孔径不小于I纳米的多孔材料。
8.如权利要求7所述的保存方法，其特征在于所述的多孔材料为有序多孔材料和/或无序多孔材料。
9.如权利要求8所述的保存方法，其特征在于所述的有序多孔材料为微孔材料、介孔材料、大孔材料中的任一种或几种。
10.如权利要求8或9所述的保存方法，其特征在于所述的有序多孔材料为硅藻土、活性炭、氧化铝多孔陶瓷、氧化硅多孔陶瓷、介孔二氧化硅、SBA-15中的一种或几种。
11.如权利要求8所述的保存方法，其特征在于所述的无序多孔材料为多孔磷酸盐微晶玻璃、氧化硅凝胶、有机硅聚苯乙烯多孔材料中的一种或几种。
12.如权利要求10所述的保存方法，其特征在于所述的硅藻土在多聚酶链反应液的组分中的添加质量体积百分比g/ml为0. 019^10%。
13.如权利要求10所述的保存方法，其特征在于所述的介孔二氧化硅在多聚酶链反应液的组分中的添加质量体积百分比g/ml为0. 01% 20%。
14.如权利要求11所述的保存方法，其特征在于所述的多孔磷酸盐微晶玻璃在多聚酶链反应液的组分中的添加质量体积百分比g/ml为1%飞0%。
15.一种可在常温下长期保存的多聚酶链反应试剂，其特征在于，所述的反应试剂是采用权利要求I所述的方法制备的。
16.一种多聚酶链反应反应试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包含有权利要求15所述的多聚酶链反应试剂。
全文摘要
本发明涉及一种基于多孔材料的多聚酶链反应试剂的保存方法及试剂，所述的保存方法是在一种或几种多聚酶链反应反应液的组分中添加多孔材料进行保存。本发明方法处理后的多聚酶链反应液的组分可常温贮存和运输，使用时无需特殊处理，直接使用即可。本发明的方法具有工艺简单、成本低廉的特点，采用本发明方法处理后的多聚酶酶链反应试剂混合物在便利的贮存条件下具有活性稳定持久的优点，这在大大降低多聚酶链反应试剂的贮运成本的同时，还为多聚酶链反应的实际操作带来极大的便利。该发明必将有力促进多聚酶链反应技术在科研、医疗、检验和检疫等领域的运用和基于该技术的诊断或检测试剂产品的大规模推广应用。
文档编号C12N15/10GK102703434SQ20121019284
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月12日 优先权日2012年6月12日
发明者张庆利, 李美霞, 杨冰, 王崇明, 许华, 黄倢 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所