胰岛素-Fc融合蛋白的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物【技术领域】，更具体地，本发明公开了一种胰岛素-Fc融合蛋白、其制备方法和用途。本发明公开的胰岛素-Fc融合蛋白具有半衰期长，可减少胰岛素使用的间隔时间，减少病人的用药痛苦等优点。
【专利说明】胰岛素-Fe融合蛋白
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，更具体地，本发明公开了一种融合蛋白、其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002]糖尿病是一种日渐普遍的流行病，据估计，到2025年，糖尿病将影响3亿以上的人口，因此急需一种有效的药物治疗方法。2型糖尿病占所有病例的90-95 %。因血糖水平持续升高引起的并发症包括心血管疾病、肾病、神经病和视网膜病。此外，在2型糖尿病晚期时，胰腺的β细胞死亡，从而停止分泌胰岛素。目前对糖尿病的治疗会产生多种有害的副作用，其中包括低血糖和体重增加。此外，目前对2型糖尿病的治疗并不能治愈这种疾病，而只是延缓时间，直至患者需要接受胰岛素治疗。
[0003]胰岛素这样的天然或者重组蛋白在水溶液状态下半保存期通常比较短，由于这些分子制剂的不稳定性使之必须冻干保存，给运输和保存带来不便。[0004]胰岛素类的重组治疗蛋白的体内半衰期也很短，为了使用药间隔延长，必须生产体内半衰期长的药物。
【发明内容】
[0005]本发明公开了一种胰岛素-Fe融合蛋白，其通式为
[0006]B-C-A-Fc，其中A为胰岛素A链，B为胰岛素的B链，C为4-50个氨基酸的C肽连接序列，优选为6-30个氨基酸，Fe为免疫球蛋白Fe段或其突变体。
[0007]优选地，C为 GGGPGKR、GGGPQT, GGGPGAG, AAGGGPSVR 之一 ；C 可以是天然或者人工序列，序列长度在4-50之间，主要为6-30个氨基酸。天然序列可以通过替代，增减修饰形成人工序列。为了减少免疫反应，C优选包含人血液中的天然人蛋白序列，例如天然胰岛素C 肽序列(RREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKR)、IGF-1 C 肽连接(GYGSSRRAPQT)，抗体重链铰链区序列(EPKS⑶KTHTCPPCPAP)等。在有些结构中连接序列也可以只包含部分的上述序列，或者替代、增减修饰上述序列中一个或者几个氨基酸。连接序列可以被增减某个特定氨基酸。但是在一些结构中，连接序列不能包含两个连续的碱性氨基酸，例如KK，RR,RK。选择没有赖氨酸或者精氨酸的序列，或者选择没有酪氨酸的序列作为连接序列。
[0008]融合蛋白序列还包含一个N端的引导序列或者信号肽。例如抗体的信号肽，胰岛素的引导序列，酵母a因子信号序列，白蛋白信号肽序列，胰岛素样生长因子结合蛋白4信号肽序列，酸性磷酸酶信号肽序列等等。
[0009]在本发明中，该构造的抗体Fe部分保留了结合蛋白质A的能力并且可以利用蛋白质A亲和色谱法进行纯化。通过重组方法合成，并且可以代表任何人类或动物抗体的任一亚型。公众可从某些出版物(例如Kabat, et al.Sequences of Proteins ofImmunological Interest, U.S.Dept.Health (1983) (Kabat 等人,免疫学相关蛋白质序列，美国卫生部，1983年))或在线获得人和动物免疫球蛋白的序列。抗体的Fe区域通过对其Fe受体结合区域(H235-H236)进行突变例如从亮氨酸突变为丙氨酸，可降低补体结合、抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)以及通过将该二聚体结构的亚区与免疫细胞表面受体(Fcy受体)结合来介导的其他功能。
[0010]融合蛋白的基因可以连入真核表达载体pcdna3.1, pngfpN, PEE144等真核载体，转染CHO，NSO，SP2/0等细胞进行表达，或者连入pet22，pet32，Pgex等质粒转染BL21 (DE3)，ROSETTA, AD494等菌株进行表达，或者连入pPICZ等载体转染毕赤酵母进行酵母表达。
[0011]融合蛋白可以通过proteinA亲和层析柱，proteinG亲和层析柱以及其它层析柱纯化获得高纯度的蛋白分子。
[0012]本发明所述的胰岛素-Fe融合蛋白具有胰岛素活性，能够结合胰岛素受体，刺激表达胰岛素受体的细胞摄取葡萄糖。胰岛素-Fe融合蛋白包含通过连接序列连接的A链和B链,例如胰岛素-Fe融合蛋白包括抗体的Fe段或其突变体通过N端或者C端与胰岛素类似物连接，其胰岛素类似物公式为-B-C-A-，其中C为C肽连接序列。在一些实例中，连接序列为6-30个氨基酸，一般情况下，连接序列可以使A链和B链形成具有胰岛素活性的分子。
[0013]本发明公开的胰岛素-Fe融合蛋白为治疗性蛋白，可为具有胰岛素-Fe融合蛋白活性的胰岛素、胰岛素类似物以及胰岛素片段和突变体与免疫球蛋白及其片段连接形成的融合蛋白，通过与Fe蛋白连接形成的融合蛋白，可以极大的改善胰岛素的药代动力学表现，提高胰岛素的体内半衰期，减少胰岛素使用的间隔时间，减少病人的用药痛苦。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1 pDRl表达载体结构示意图，hCMV表示人巨细胞病毒Major Immediate早期启动子；BGH pA表不Bovine growth hormone多腺苷化信号；SV40 ori表不SV40病毒早期复制起点；DHFR表示二氢叶酸还原酶基因；pUC origin为质粒复制起点；AMP为氨苄青霉素抗性基因。
[0015]图2.胰岛素-Fe融合蛋白基因结构示意图；信号肽是指胰岛素的信号肽或其他蛋白的信号肽基因，A链B链分别是指胰岛素的A链基因和B链基因，Fe是指突变后抗体的Fe段基因，C连接序列是指专利中提到的各种连接序列基因。
[0016]图3.胰岛素-Fe融合蛋白结构示意图，A链B链分别是指胰岛素的A和B链，Fe是指突变后抗体的Fe段。
【权利要求】
1.一种膜岛素-Fe融合蛋白，其通式为B-C-A-Fc,其中A为膜岛素A链,B为膜岛素的B链，C为4-50个氨基酸的C肽连接序列，Fe为免疫球蛋白Fe段或其突变体。
2.权利要求1所述的胰岛素-Fe融合蛋白，其中C为6-30个氨基酸的C肽连接序列。
3.权利要求2所述的胰岛素-Fe融合蛋白，其中C为GGGPGKR、GGGPQT,GGGPGAG、AAGGGPSVR 之一。
4.权利要求1所述的胰岛素-Fe融合蛋白，其中Fe为免疫球蛋白Fe段H235、H236位从亮氨酸突变为丙氨酸。
5.权利要求1-4任一所述的胰岛素-Fe融合蛋白，其氨基酸序列为SEQIDNO:2、SEQID NO:4, SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO:10 之一。
6.一种核酸分子，编码权利要求1-4任一所述的胰岛素-Fe融合蛋白。
7.权利要求6所述的核酸分子，其核苷酸序列为SEQID NO:U SEQ ID NO:3、SEQ IDN0:5、SEQ ID N0:7、SEQ ID NO:9 之一。
【文档编号】C12N15/62GK103509118SQ201210198941
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2012年6月15日 优先权日:2012年6月15日
【发明者】顾娜娜, 郭怀祖 申请人:郭怀祖