专利名称：正辛醇在延缓哺乳动物卵子体外老化中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及哺乳动物胚胎工程领域，具体地，涉及正辛醇在延缓哺乳动物卵子体外老化中的应用。
背景技术：
根据哺乳动物的卵母细胞是否分别在卵泡或输卵管中停留相对较长的时间而将其分成排卵前老化或排卵后老化，排卵后老化又可以根据卵母细胞所处的环境分为体内老 化和体外老化。卵子体外老化是指哺乳动物卵子在体外培养一段时间后发生的一系列生化和表观遗传学变化。这些变化导致卵子受精率下降、受精胚胎发育和受胎率低、胎儿畸形率和出生后死亡率高等。它是制约哺乳动物胚胎工程效率的关键因素之一，目前国内外还没有延缓哺乳动物卵子体外老化的实质性技术。而研究报道，如Kikuchi等首先发现卵子老化的可逆性，他们发现Caffeine与Vanadate通过控制MPF (成熟促进因子)的活性调控卵子老化，钥;酸盐能加速卵子老化而咖啡因能延迟卵子老化。Goud等发现NO (—氧化氮)能够延迟卵子老化。DTT (二硫苏糖醇)能够提高受精率与胚胎细胞数、抑制碎裂、促进囊胚的发育，同时降低内细胞团细胞的碎裂。除此之外，TSA (曲古菌素A)能降低猪卵母细胞的碎裂与提高其发育能力，但是对于小鼠来说，TSA能够加速小鼠卵子的老化。在老化过程中卵子内发生大量的分子事件，例如，Ca2+尚子稳态发生变化,活性氧(ROS)升闻，能量和抗氧化物浓度降低，MPF和MAPK (促分裂素原活化蛋白激酶)活性降低。大量研究表明，Ca2+的异常变化可能是这些事件的核心因素。老化卵子Ca2+的异常主要表现为胞内游离Ca2+浓度增力口，受精时Ca2+振荡幅度下降、持续时间缩短，这能直接引发卵子凋亡的发生和基因表观遗传的改化。近来研究证明细胞老化影响T型钙离子通道，例如，与年轻的神经元相比，老年大鼠神经元的T型Ca2+通道密度会明显增加。因此，若能开发出通过抑制T型Ca2+通道，阻止卵胞质内游离Ca2+浓度升高而延缓卵子老化进程的技术，势必会对哺乳动物胚胎工程领域有很大的推动作用。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的是提供正辛醇在延缓哺乳动物卵子体外老化中的应用。其中，所述正辛醇的浓度为0.广4禮。进一步地，所述正辛醇的浓度为0. 5 2mM。更进一步地，所述正辛醇的浓度为lmM。其中，所述正辛醇在哺乳动物卵母细胞体外成熟培养后，开始出现老化，继续进行体外培养的阶段中加入。进一步地，所述哺乳动物卵母细胞体外成熟培养24h后，开始出现老化。其中，所述哺乳动物为牛，羊，猪，鼠等。其中，当所述哺乳动物为牛时，继续进行体外培养的阶段，所述正辛醇(1-octanol)添加在含有胎牛血清的培养液中。其中，所述胎牛血清的浓度为5% 20%。进一步地，所述胎牛血清的浓度为10%。本发明所述的正辛醇在延缓哺乳动物卵子体外老化中的应用，包括将牛卵巢经体外成熟培养后，放入含上述浓度的正辛醇的胎牛血清培养液中进行老化培养，然后分别进行孤雌激活和体外受精，进行体外培养，统计囊胚率。哺乳动物卵母细胞在体外成熟培养一段时间后开始老化，再转移到所述培养液中继续进行体外培养(上述老化培养)，此时为了延缓哺乳动物卵子体外老化，加入所述正辛醇。一般情况下，哺乳动物卵母细胞在体外成熟培养24h后开始老化。本发明提出通过抑制T型Ca2+通道，阻止卵胞质内游离Ca2+浓度升高而延缓卵子老化进程。本发明的发明人通过大量的实验研究，发现正辛醇与没有添加正辛醇的对照组 相比，可以显著提高体外老化一段时间后哺乳动物卵子体外受精后的囊胚率。因此，本发明有益的技术效果如下(I)应用方法简单、实用，只需在卵子体外培养液中添加一定浓度的抑制剂即可。(2)应用范围广，可以用于小型实验动物、家畜、灵长类的体外受精、细胞核移植、单精子注射等胚胎体外生产技术，也可以用于人的辅助生殖技术。(3)本发明的应用方法对卵子不产生化学毒害。总之，本发明显著延缓了哺乳动物卵子体外老化的速度，同时保证了卵子的体外发育能力，从而为延缓或逆转卵子老化提供新的途径，为改进辅助生殖技术提供了参考。本发明的技术在国内外为未见公开报道，具有很高的创新性，对哺乳动物胚胎工程领域有很大的推动作用。
图1-1至图1-3为正辛醇对体外老化牛卵子胞内游离Ca2+水平的影响(对比例I);其中图1-1为体外老化12h对照组(TCM199+10%FBS+0mM正辛醇)牛卵子胞质内游离Ca2+水平(对应图1-3中的柱A)，图1-2为体外老化12h正辛醇组(TCM199+10%FBS+lmM正辛醇)牛卵子胞质内游离Ca2+水平(对应图1-3中的柱B)，图1-3为体外老化12h对照组(柱A)与正辛醇组(柱B)牛卵子胞内游离Ca2+水平的比较，纵坐标表示荧光强度数值；图1-3中的字母a，b表示具有一个相同字母的标注表示差异不显著(P>0. 05)，但若双字母不同即表示差异显著(P〈0. 05)，Bar=IOO u m。图2-1至图2-3为PMA对体外老化牛卵子胞内游离Ca2+水平的影响(对比例2)；其中图2-1为体外老化12h对照组(TCM199+10%FBS，对应图2_3中的柱A)牛卵子胞质内游离Ca2+水平，图2-2为体外老化12h PMA组(TCM199+10%FBS+100nM PMA，对应图2_3中的柱B)牛卵子胞质内游离Ca2+水平，图2-3为体外老化12h对照组(柱A)与PMA组(柱B)牛卵子胞质内游离Ca2+水平的比较；图2-3中的字母a，b表示具有一个相同字母的标注表示差异不显著(P>0. 05)，但若双字母不同即表示差异显著(P〈0. 05)，Bar=IOO u m。图3-1至图3-3为BAPTA对体外老化牛卵子胞内游离Ca2+水平的影响(对比例3);其中图3-1为体外老化12h对照组(TCM199+10%FBS，对应图3_3中的柱A)牛卵子胞质内游离 Ca2+ 水平，图 3-2 为体外老化 12h BAPTA 组(TCM199+10%FBS+5 u M BAPTA，对应图 3-3 中的柱B)牛卵子胞质内游离Ca2+水平，图3-3为体外老化12h对照组(柱A)与BAPTA组(柱B)牛卵子胞质内游离Ca2+水平的比较；图3-3中的字母a，b表示具有一个相同字母的标注表示差异不显著(P>0. 05)，但若双字母不同即表示差异显著(P〈0. 05)，Bar=IOO u m。图4-1至图4-4为培养液中Ca2+对体外老化牛卵子胞内游离Ca2+水平的影响(对比例4);其中图4-1为体外老化12h有Ca2+组[CRlaa (5mM Ca2+)+10%FBS+0mM正辛醇]牛卵子胞质内游离Ca2+水平(对应图4-4中的柱A)，图4-2为体外老化12h无Ca2+组[CRlaa(OmM Ca2+)+10%FBS+0mM正辛醇]牛卵子胞质内游离Ca2+水平(对应图4-4中的柱B)，图4-3为体外老化12h无Ca2+但含正辛醇组[CRlaa (OmMCa2+)+10%FBS+lmM正辛醇]牛卵子胞质内游离Ca2+水平(对应图4-4中的柱C)，图4-4为体外老化12h有Ca2+组(柱A)、无Ca2+组(柱B)及无Ca2+但含正辛醇组(柱C)牛卵子胞质内游离Ca2+水平的比较，纵坐标表示荧光强度数值；图4-4中的字母a，b表示具有一个相同字母的标注表示差异不显著(P>0. 05)， 但若双字母不同即表示差异显著(P〈0. 05)，Bar=IOO u m。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。本发明中出现的百分号“％”均指体积百分比。本发明实施例中所使用的试剂成分如下Ml"和 TCM1"为直接从 M&C 基因科技公司(M&C Gene Technology (Beijing)Ltd)公司购买,商品化物料。非必需氨基酸商品名MEMNON-ESSENTIAL AMINO ACID SOLUTION (100X)，货号M7145 ;公司SIGMAo必需氨基酸商品名BMEAMINO ACID SOLUTION (50X)，货号B6766 ;公司SIGMA。H199 液的成分为9. 9g M199 粉末，5mmol/LNaHC03,1. Ommol/LPyruvate Sodium(丙酮酸钠)，10mmol/L HEPES(4_羟乙基哌嗪乙磺酸)，lOmmol/L HEPES Sodium(4_羟乙基哌嗪乙横酸钠)，lOmg/LHeparin (肝素)，75mg/L Penicillin (青霉素)，50mg/L Streptomycin(链霉素)。洗卵液9.9g M199 粉末,5mmol/L NaHCO3,1. OmmoI/L Pyruvate Sodium (丙酮酸钠)，10mmol/L HEPES (4-羟乙基哌嗪乙磺酸)，10mmol/L HEPES Sodium (4-羟乙基哌嗪乙磺酸钠)，10mg/L Heparin (肝素)，2%FBS (胎牛血清)，75mg/L Penicillin (青霉素)，50mg/LStreptomycin (链霉素)。成熟液TCM199+10%FBS(胎牛血清)+0. lmg/mL 半光氨酸 +10ng/mL EGF (表皮生长因子)+10ug/mL FSH (促卵泡素)+10ug/mL LH (促黄体生成素)+0. 065mg/mL青霉素+0. 05mg/mL 链霉素。CRlaa 培养液
权利要求
1.正辛醇在延缓哺乳动物卵子体外老化中的应用。
2.根据权利要求I所述的应用，其特征在于，所述正辛醇的浓度为0.f4mM。
3.根据权利要求I所述的应用，其特征在于，所述正辛醇的浓度为0.5 2mM。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述正辛醇的浓度为lmM。
5.根据权利要求r4任意一项所述的应用，其特征在于，所述正辛醇在哺乳动物卵母细胞体外成熟培养后，开始出现老化，继续进行体外培养的阶段中加入。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述哺乳动物卵母细胞体外成熟培养24h后，开始出现老化。
7.根据权利要求r5任意一项所述的应用，其特征在于，所述哺乳动物为牛，羊，猪或鼠。
8.根据权利要求5 7任意一项所述的应用，其特征在于，继续进行体外培养的阶段，所述正辛醇添加在含有胎牛血清的培养液中。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述胎牛血清的浓度为59T20%。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述胎牛血清的浓度为10%。
全文摘要
本发明涉及正辛醇在延缓哺乳动物卵子体外老化中的应用。其将正辛醇添加在含有胎牛血清的培养液中，正辛醇的浓度为0.1～4mM。本发明显著延缓了哺乳动物卵母细胞体外老化的速度，同时保证了卵母细胞的体外发育能力，从而为延缓或逆转卵子老化提供新的途径，为改进辅助生殖技术提供了参考。本发明的技术在国内外为未见公开报道，具有很高的创新性，对哺乳动物胚胎工程领域有很大的推动作用。
文档编号C12N5/075GK102703383SQ201210199708
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月14日 优先权日2012年6月14日
发明者仵毅, 曾申明, 赵栓, 鲍忠剑 申请人:中国农业大学