专利名称：一种筛选拟穴青蟹免疫刺激反应灵敏基因的方法
技术领域：
本发明属于筛选免疫反应灵敏基因领域，特别涉及一种筛选拟穴青蟹免疫刺激反应灵敏基因的方法。
背景技术：
甲壳动物缺乏特异性免疫，主要依靠非特异性免疫来识别和有效清除入侵的微生物和寄生虫等异物，它们的免疫系统主要包括细胞免疫和体液免疫，它们在免疫刺激下被激活。细胞免疫主要包括吞噬、节结的形成和包裹作用等。体液免疫主要是在外来物质的刺激诱导下合成分泌一些非特异性酶或因子等来抵御外来病菌的侵入。拟穴青蟹属于节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲(Crustacea)、十足目 (Decapoda)、梭子蟹科(Portunidae),青蟹属(Scylla),是我国沿海重要的海洋经济蟹类，具有较大的营养价值和商品价值。然而，近年来频繁发生的病害问题严重阻碍了我国青蟹养殖业的健康发展，在浙江、福建、广东等沿海主要青蟹养殖地区出现了持续病害。据水生动物病害测报资料，2006年全国青蟹平均发病率约13. 77%，平均死亡率为51. 43%，经济损失达2. 29亿元，病害的爆发已经严重威胁到了青蟹养殖业的健康发展。已经报道的青蟹疾病有黄水病、褐斑病、白芒病、黄斑病、纤毛虫病、弧菌病、寄生性腰鞭毛虫血卵涡鞭虫病、嗜水气单胞菌病等(徐海圣等，2000 ;王荣智等，2008)。面对青蟹养殖过程中日益严重的病害，养殖户迫于无奈只能使用抗生素，然而抗生素的滥用已经导致细菌产生了非常严重的耐药性，而且养殖蟹类病害爆发的病因也日趋多样性，这就迫切要求从蟹类自身的免疫防御入手，提高蟹类自身抗病力。蟹类的抗病力与其自身免疫相关功能基因的调控和表达有着密切的关系。因此，筛选和鉴别免疫相关功能基因对于蟹类天然抗病力的研究极为重要。多重基因表达(GeXP)技术是一种全新的基因表达谱定量分析平台。GeXP技术能够在单一 RT-PCR反应中检测多至25个基因的转录水平，是多重PCR领域的突破性技术，它巧妙的将多重PCR技术和毛细管电泳技术结合起来，采用通用引物与特异引物相结合的方法，其起始RNA的用量可以低至10ng。GeXP技术是芯片和Q-PCR技术的换代产品，它把基因表达研究提升到一个更高的水平；这种技术可以监控的基因数目可以达到几十到几百个，可以处理的样本数可达数千个。基于RT-PCR的GeXP技术提供了一种敏感的、灵活的和可重复的基因定量表达分析技术。它不但可以处理大量的样本，而且一个反应中可以同时处理大于20个基因，而不像Q-PCR方法每次只能处理I个或几个基因。多重基因表达技术来筛选重要功能基因是个理想的技术手段。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种筛选拟穴青蟹免疫刺激反应灵敏基因的方法，该方法工艺简单，成本低，能够从众多相关基因中迅速筛选到反应最为敏感的基因，具有良好的应用前景。
本发明的一种筛选拟穴青蟹免疫刺激反应灵敏基因的方法，包括( I)将拟穴青蟹分成感染组和对照组，感染组注射100 U L副溶血弧菌，对照组注射100 u L生理盐水，同时处理24h，分别在第0h，lh, 3h，6h，24h取样；抽取拟穴青蟹血液，采用Trizal法提取血细胞总RNA，_80°C下保存；(2)以候选基因序列为靶序列，设计多重基因表达引物，以肌动蛋白作为内参基因，进行反转录反应和PCR反应，得到PCR产物；将PCR产物稀释后上样，测定候选基因的表达水平，即得到免疫刺激反应灵敏基因。所述步骤(I)中的副溶血弧菌的浓度为2 X 106CFU/mL,生理盐水的浓度为0. 9wt%。所述步骤(2)中的反转录反应的具体条件为48°C lmin,42°C 60min,95°C 5min。所述步骤(2)中的PCR反应的具体条件为95°C IOmin ；94°C 30s, 55 °C 30s, 70 °C lmin，35 个循环。多重基因表达引物序列见下表表I本发明用到的多重基因表达引物
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AGGTGACACTATAGAATA GTACGACTCACTATAGGGAai.....L 埤虫丨 1 CCGGATAAGGATGACCTCAA GGTGTCCTTC ACCGTC A ACTAGGTGACACTATAGAATA GTACGACTCACTATAGGGAI- -Mc ‘ A ACTTTGTGATA ATCGCCCG CGACCTTCCACTTGTCCTGTJ4- ,AGGTGACACTATAGAATA GTACGACTCACTATAGGGA
1 1 AAGGACAAGGTGAGCGAAGA TCCTCCAGTTCCTTCTGCTTAGGTGACACTATAGAATA GTACGACTCACTATAGGGA1 1 40 G AGG AAGGGTG ACATC ATCG TACCCACACTCCCTTTCTGG类热激饭白 AGGTGACACTATAGAATA GTACGACTCACTATAGGGA70 W f ATGCGAATGGTATCCTCCAG TCCTGGACTCTACACGCTCC,平, AGGTGACACTATAGAATA CiTACGACTCACTATAGGGA爲謙虫11 GTGGACGTGGATGAGAGTGA TGATCCTGAGGGAAACCAAG_}氧化_ 原 AGGTGACACTATAGAATA GTACGACTCACTATAGGGATATCCTCAGACCTTCGCGTC TTGTTGTCCAGGCAGATGAC'I.'. AGGl'GACAri'Al'AOAATA GTACGACTrAri'Al'AGGGA
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ft IHrJi^ri AGGTGACACTATAGAATA CTACGACIACTATACiGGA
丨丨 GOTCGTACCACCGGTATTGT ctggccatcaggaagctc J4U上述候选基因序列见序列表SEQ ID No. 19-26。有益效果本发明工艺简单，成本低，能够从众多相关基因中迅速筛选到免疫反应最为敏感的基因，为进一步研究这些基因的免疫功能建立良好的技术平台，在拟穴青蟹免疫系统和其天然抗病力的研究领域中具有良好的应用前景。
图I为病菌感染后8个免疫相关基因表达变化图；其中proP0 :酚氧化酶原；PPAF :酹氧化酶原激活因子；a 2M : a巨球蛋白；Lectin :C_型凝集素；Trx I :硫氧还蛋白；HSP70 :热激蛋白70 ；HSP40 :热激蛋白40 ；70LHSP :类热激蛋白70因子。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例II、实验蟹准备以拟穴青蟹成体(体重300克左右)为试验对象，共60只，分为2组(感染组和对照组)，感染组注射副溶血弧菌IOOuL (2X IO6 CFU/mL)，对照组注射IOOuL生理盐水(浓度0. 9%)，处理24h，分别在第0h,lh,3h,6h, 24h取样。 2、RNA提取抽取青蟹血液，采用Trizal法提取血细胞总RNA，一 80°C保存。3、引物设计酚氧化酶原、酚氧化酶原激活因子、a巨球蛋白、热激蛋白70、类热激蛋白70因子、热激蛋白40、硫氧还蛋白这8个基因片段序列，以这些基因序列为靶序列，在机器上运行eXpress Profiler软件设计多重基因引物。4、反转录反应按照GenomeLab GeXP Start Kit说明书操作；反应体系DNase/RNase Free H20 7 u L, RT Buffer (5X) 4 u L, Custom RT Rev Primer Plex 2 u L, ReverseTranscriptase I u L, KANrRNA with RI I u L, Sample RNA 5iiL。反应条件48°C lmin,42°C 60min,95°C 5min。5、PCR反应按照GenomeLab GeXP Start Kit说明书操作；反应体系PCRBuffer (5X)4. 0 u L,25mM MgC12(Thermo-Start)4. 0 u L, Custom PCR Fwd Primer Plex
2.0 u L, Thermo-Start DNA Polymerase(A25395)0.7 u L, cDNA Samples(RT reactionsfrom the RT Plate) 9. 3 u L0 反应条件95°C IOmin ；94°C 30s, 55°C 30s, 70°C lmin，35 个循环。6、GenomeLab上样取2iiL上述PCR产物加8iiL水。上样体系为稀释后PCR产物 I. OuL, DNA Size Standard-400 0. 25 u L, Sample Loading Solution 38.75iiL,矿物油I滴，把上述上样液加入样本板中。在与样本板对应的缓冲液板孔内加入3/4体积的缓冲液；进入Set Up程序,输入样品名，对每个样本指定Frag-3分离方法,指定默认的GeXP分析方法，开始运行程序。7、数据分析把获得的实验数据在excel中分析。画柱状图，如图I所示，C-型凝集素在I小时达到最高，远远大于其他基因表达水平，而其他基因在3小时或者6小时才达到高峰，说明该基因是在病菌感染后反应比较灵敏的基因。
权利要求
1.一种筛选拟穴青蟹免疫刺激反应灵敏基因的方法，包括 (1)将拟穴青蟹分成感染组和对照组，感染组注射100UL副溶血弧菌，对照组注射IOOuL生理盐水，同时处理24h，分别在第0h，lh，3h，6h，24h取样；抽取拟穴青蟹血液，采用Trizal法提取血细胞总RNA，_80°C下保存； (2)以候选基因序列为靶序列，￠-肌动蛋白作为内参基因，设计多重基因表达引物，进行反转录反应和PCR反应，得到PCR产物；将PCR产物稀释，于GeXP表达分析系统中上样，测定候选基因的表达水平，即得到免疫刺激反应灵敏基因。
2.根据权利要求I所述的一种筛选拟穴青蟹免疫刺激反应灵敏基因的方法，其特征在于所述步骤(I)中的副溶血弧菌的浓度为2X106CFU/mL，生理盐水的浓度为0. 9wt%。
3.根据权利要求I所述的一种筛选拟穴青蟹免疫刺激反应灵敏基因的方法，其特征在于所述步骤(2)中的候选基因及其多重基因表达引物分别为 a巨球蛋白，正向引物5 ’ -AGGTGACACTATAGAATACCGGATAAGGATGACCTCAA-3，，反向引物5’ -GTACGACTCACTATAGGGA GGTGTCCTTCACCGTCAACT-3’ ； C-型凝集素，正向引物5 ’ -AGGTGACACTATAGAATAAACTTTGTGATAATCGCCCG-3 ’，反向引物5’ -GTACGACTCACTATAGGGA CGACCTTCCACTTGTCCTGT-3’ ； 热激蛋白70， 正向引物5，-AGGTGACACTATAGAATAAAGGACAAGGTGAGCGAAGA-3，，反向引物5’ -GTACGACTCACTATAGGGA TGCTCCAGTTCCTTCTGCTT-3’ ； 热激蛋白40，正向引物5 ’ -AGGTGACACTATAGAATAGAGGAAGGGTGACATCATCG-3 ’，反向引物5’ -GTACGACTCACTATAGGGA TACCCACACTCCCTITCTGG-3’ ； 类热激蛋白70因子，正向引物5 ’ -AGGTGACACTATAGAATAATGCGAATGGTATCCTCCAG-3 ’，反向引物5’ -GTACGACTCACTATAGGGA TCCTGGACTCTACACGCTCC-3’ ； 硫氧还蛋白，正向引物5 ’ -AGGTGACACTATAGAATAGTGGACGTGGATGAGAGTGA-3，，反向引物5’ -GTACGACTCACTATAGGGA TGATCCTGAGGGAAACCAAG-3’ ； 酚氧化酶原激活因子，正向引物5 ’ -AGGTGACACTATAGAATATATCCTCAGACCTTCGCGTC-3 ’，反向引物5’ -GTACGACTCACTATAGGGA ITGTTGTCCAGGCAGATGAC-3’ ； 酚氧化酶原，正向引物5 ’ -AGGTGACACTATAGAATAAGGTAGCACAGCCAGATGGT-3，，反向引物5 ’ -GTACGACTCACTATAGGGA CATTGGTGAAGGTGATGGTG-3 ’。
4.根据权利要求I所述的一种筛选拟穴青蟹免疫刺激反应灵敏基因的方法，其特征在于所述步骤(2)中的P-肌动蛋白的正向引物5’ -AGGTGACACTATAGAATAGGTCGTACCACCGGTATTGT-3’ ；反向引物5 ’ -GTACGACTCACTATAGGGA CTGGCCATCAGGAAGCTC-3，。
5.根据权利要求I所述的一种筛选拟穴青蟹免疫刺激反应灵敏基因的方法，其特征在于所述步骤(2)中的反转录反应的具体条件为48°C lmin,42°C 60min,95°C 5min。
6.根据权利要求I所述的一种筛选拟穴青蟹免疫刺激反应灵敏基因的方法，其特征在于所述步骤(2)中的PCR反应的具体条件为95°C IOmin ；94°C 30s, 55°C 30s, 70°C lmin，35个循环。
7.根据权利要求I所述的一种筛选拟穴青蟹免疫刺激反应灵敏基因的方法，其特征在于所述步骤(2)中的上样运行步骤为将稀释后的PCR产物和DNA分子量Marker混合物加入样本板，在与样本板对应的缓冲液板孔内加入3/4体积的缓冲 液；进入Set Up程序，输入样品名，对每个样本指定Frag-3分离方法，指定默认的GeXP分析方法，开始运行程序。
全文摘要
本发明涉及一种筛选拟穴青蟹免疫刺激反应灵敏基因的方法，包括(1)将拟穴青蟹分成感染组和对照组，感染组注射100μL副溶血弧菌，对照组注射100μL生理盐水，同时处理24h，分别在第0h，1h，3h，6h，24h取样；抽取拟穴青蟹血液，采用Trizal法提取血细胞总RNA，-80℃下保存；(2)以候选基因序列为靶序列，以β-肌动蛋白基因作为内参基因，设计多重基因表达引物，进行反转录反应和PCR反应，得到PCR产物；将PCR产物稀释后在GeXP表达分析系统中上样，测定候选基因的表达水平，即得到免疫刺激反应灵敏基因。本发明工艺简单，成本低，能够从众多相关基因中迅速筛选到反应最为敏感的基因，具有良好的应用前景。
文档编号C12Q1/68GK102732622SQ20121019986
公开日2012年10月17日 申请日期2012年6月18日 优先权日2012年6月18日
发明者孙曼曼, 张凤英, 房娅博, 蒋科技, 马凌波 申请人:中国水产科学研究院东海水产研究所