专利名称：高产聚苹果酸的菌株及其应用和方法
技术领域：
本发明涉及发酵领域，具体涉及高产聚苹果酸的菌株，还涉及该菌株的应用及其方法。
背景技术：
聚苹果酸(Polymalic acid，PMLA)以L-苹果酸为唯一单体在体内聚合而成，是一种新型完全生物降解性高分子材料，具有高度的生物相容性、生物降解性和生物可吸收性等优点。由于PMLA在侧链上具有悬挂羧基，容易与其他官能团反应而制备PMLA衍生物，与聚乳酸等材料相比，PMLA在体内易代谢性、易修饰性等方面表现出更好的优势，在药物制齐U、食品包装、农业等方面应用前景广阔。聚苹果酸还可以水解为单体，即L-苹果酸，又名
2-羟基丁二酸，是重要的有机酸和生物炼制平台化合物。L-苹果酸具有天然果实的酸味特征，味觉自然丰厚，可作为酸味剂在食品及医药中广泛应用。L-苹果酸的酸感强度约相当于柠檬酸的I. 2倍，产热量更低，可以替代柠檬酸作为食品添加剂加以应用。目前聚苹果酸主要通过由出芽短梗霉pulIuIans')发藤 Π要以淀粉和葡萄糖为原料，其原料价格高，在一定程度上限制了工业应用。糖蜜是制糖工业的主要副产物，糖蜜中主要以蔗糖为主，能够被出芽短梗霉利用，但是利用效率低，聚苹果酸的产率低，无法在工业上大规模应用。因此，急需一种高产聚苹果酸的菌株，能够利用价格低廉的糖蜜为原料，利用效率高，聚苹果酸产量高，为聚苹果酸的生产提供一条新型经济工艺路线。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种高产聚苹果酸的菌株，具有较好的利用蔗糖能力，能够以制糖工业的主要副产物糖蜜为糖源，利用效率高，聚苹果酸产量高。为实现上述发明目的，技术方案为
高产聚苹果酸的出芽短梗霉/7 77 7<3/ 5·) FMT1801,保藏号为CCTCCNO: M 2012223。本发明的目的之二在于提供出芽短梗霉FMT1801在生产聚苹果酸中的应用，技术方案为
所述出芽短梗霉FMT1801 CCTCC NO: M 2012223在生产聚苹果酸中的应用。本发明目的之三在于提供利用出芽短梗霉FMT1801生产聚苹果酸的方法，工艺简单，原料价格低，聚苹果酸产量高。技术方案为
为了实现上述为目的，本发明的技术方案为
利用所述出芽短梗霉FMT1801在生产聚苹果酸的方法，具体步骤为
a.种子活化
将出芽短梗霉FMT1801 CCTCC NO: M 2012223接种于种子培养基，在温度为23_30°C震荡培养，得活化种子液；所述种子培养基为葡萄糖40-100g/L、NH4N03l-5 g/L、KH2PO4O. 005-0. 3g/L、ZnSO4 0. 005-0. 3g/L、MgSO4 0. 005-0. 3g/L、玉米浆 0. 05-3 g/L 和 CaCO310-50 g/L ；
b.发酵
将步骤a所得活化种子液接种于发酵培养基，在温度为23-30°C震荡培养96小时以上，离心收集液体，得发酵液；所述发酵培养基为糖蜜50-200g/L、氮源l_5g/L、KH2PO4O. 005-0. 3g/L、ZnSO4 O. 005-0. 3g/L、MgSO4 O. 005-0. 3g/L、玉米浆 0. 05_3g/L 和 CaCO310-50 g/L ；
c.聚苹果酸提取
将步骤b所得发酵液中加入体积分数为95%的乙醇溶液，4°C冷冻，离心收集沉淀，得到
聚苹果酸。 优选的，所述步骤a中，所述出芽短梗霉FMT1801按出芽短梗霉FMT1801种子液与种子培养基的体积比为1:100-1000接种，在转速为180-300 rpm培养36-96小时。更优选的，所述种子培养基为葡萄糖60-80g/L、NH4NO3 2_4g/L、KH2PO4O. 05-0. 2g/L、ZnSO4 O. 05-0. 2g/L、MgSO4 0. 05-0. 2g/L、玉米浆 l_2g/L 和 CaCO3 20-40 g/L0优选的，所述活化种子液按活化种子液与发酵培养基的体积比为1:10-20接种，在转速为180-1000 rpm条件下培养96-200小时。更优选的，所述发酵培养基为糖蜜100-150g/L、氮源2_4g/L、KH2PO4 O. 05-0. 2g/L、ZnSO4 O. 05-0. 2g/L、MgSO4 0. 05-0. 2g/L、玉米浆 0. 5_2g/L 和 CaCO3 20-40 g/L。优选的，所述步骤c是加入相当于发酵液体积1-5倍的体积分数为95%的乙醇溶液，4°C冷冻12-36小时，在转速不低于3000rpm的条件下离心不少于5分钟。更优选的，所述步骤c是加入相当于发酵液体积2倍的质量分数95%的乙醇溶液，4°C冷冻24小时；在转速为3500rpm的条件下离心45分钟。最优选的，所述氮源为硫酸铵、氯化铵、硝酸钾或硝酸钠。
本发明使用的发酵菌株为出芽短梗霉(Aureobasidiuni pullulans )FMT1801,将出芽短梗霉FMT1801制备成0D_= O. 4左右的菌液，即出芽短梗霉FMT1801种子液，备用。本发明有益效果在于本发明公开了高产聚苹果酸的菌株为出芽短梗霉(Aureobasidium /wJJWafldFMTlSOl 为发酵菌株，保藏号为 CCTCC NO: M 2012223，该菌株具有较好的利用蔗糖的能力，还能以工业副产物糖蜜为糖源，通过发酵产生浓度高的聚苹果酸，原料成本低，聚苹果酸产量高，具有较好的经济效益。本发明中糖蜜为制糖工业的主要副产物因此原料来源广泛，价格低廉，同时由于出芽短梗霉FMT1801发酵的终产物为聚苹果酸，解决了传统路线发酵终产物为苹果酸，抑制菌种活性，降低产量的问题，因而能够获得高浓度的聚苹果酸发酵液，发酵液中聚苹果酸最高达29g/L。本发明使用的出芽短梗霉FMT1801菌株生产的聚苹果酸能直接分泌到胞外，用体积分数为95%的乙醇溶液即可沉淀，容易提取，工艺步骤简单，适合大规模工业生产。菌种保藏
本发明中出芽短梗霉FMT1801 (Aureobasidium pullulans FMT1801)是从出芽短梗抱NRRL Y2311经过自然分离获得能高效利用蔗糖为碳源产生聚苹果酸的菌株，送中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO: M 2012223，地址位于中国武汉武汉大学，保藏日期为2012年6月12日，分类命名为出芽短梗霉(AureobasidiumFMT1801。
具体实施例方式以下将结合实施例对本发明进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。实施例I
生产聚苹果酸的方法，具体步骤为 a.种子活化
将出芽短梗霉FMT1801 CCTCC NO: M 2012223接种于种子培养基中，接种量按照出芽短梗霉FMT1801种子液与种子培养基的体积比为1:100，种子培养基配方为葡萄糖60g/L、硝酸铵 2 g/L、KH2PO4 O. 05g/L、ZnSO4 O. 05g/L, MgSO4 O. 05g/L、玉米浆 0. 05g/L 和 CaCO3 20 g/L在温度为25°C、转速为250 rpm条件下震荡培养48小时，得活化种子液。b.发酵
将步骤a所得活化种子液接种于含50mL发酵培养基的摇瓶中，接种量按照活化种子液与发酵培养基的体积比为1:10，发酵培养基配方为糖蜜100 g/L、硝酸钾2 g/L、KH2PO4O. 05g/L,ZnSO4 O. 05g/L,MgSO4 O. 05g/L、玉米浆 O. 5g/L 和 CaC0320 g/L，在温度为 25°C、转速为220 rpm条件下震荡培养144小时，培养液用板框过滤机过滤，收集滤液,得发酵液。c.聚苹果酸提取
将步骤b所得发酵液中加入相当于发酵液体积2倍的体积分数为95%的乙醇溶液，40C冷冻24小时，转速为4000rpm离心30分钟，收集沉淀，得到聚苹果酸。本实施例中，聚苹果酸产量为29 g/L，制得的聚苹果酸用体积分数为95%的乙醇洗涤3次后，将沉淀溶解在浓度为2 M硫酸中，在80°C条件下水解12小时，得到苹果酸，苹果酸产量为32. 9 g/L。实施例2
生产聚苹果酸的方法，具体步骤为 a.种子活化
将出芽短梗霉FMT1801 CCTCC NO: M 2012223接种于种子培养基中，接种量按照出芽短梗霉FMT1801种子液与种子培养基的体积比为1:100，种子培养基配方为葡萄糖80g/L、硝酸铵 4 g/L、KH2PO4 O. 2g/L, ZnSO4 O. 2g/L, MgSO4 O. 2g/L、玉米浆 2g/L 和 CaCO3 40 g/L在温度为25°C、转速为180rpm条件下震荡培养96小时，得活化种子液。b.发酵
将步骤a所得活化种子液接种于含50mL发酵培养基的摇瓶中，接种量按照活化种子液与发酵培养基的体积比为1:10，发酵培养基配方为糖蜜150g/L、硝酸钠4 g/L、KH2PO4O. 2g/L、ZnSO4 O. 2g/L、MgS04 O. 2g/L、玉米浆 2g/L 和 CaCO3 40 g/L，在温度为 23°C、转速为180 rpm条件下震荡培养96小时，培养液用板框过滤机过滤，收集滤液,得发酵液。c.聚苹果酸提取
将步骤b所得发酵液中加入相当于发酵液体积3倍的体积分数为95%的乙醇溶液，40C冷冻12小时，转速为3500rpm离心45分钟，收集沉淀，得到聚苹果酸。
本实施例中，聚苹果酸产量为27.9 g/L，所得聚苹果酸，用体积分数为95%的乙醇洗涤2次后，将沉淀溶解在浓度为2 M硫酸中，在85°C条件下水解10小时，得到苹果酸，苹果酸产量为31. 7 g/L。实施例3
生产聚苹果酸的方法，具体步骤为 a.种子活化
将出芽短梗霉FMT1801 CCTCC NO: M 2012223接种于种子培养基中，接种量按照出芽短梗霉FMT1801种子液与种子培养基的体积比为1:100，种子培养基配方为葡萄糖100 g/L、硝酸铵 5 g/L,KH2PO4 O. 3g/L,ZnSO4 O. 3g/L, MgSO4 O. 3g/L、玉米浆 3 g/L 和 CaCO3 50g/L在温度为28°C、转速为300 rpm条件下震荡培养36小时，得活化种子液。b.发酵
将步骤a所得活化种子液接种于含50mL发酵培养基的摇瓶中，接种量按照活化种子液与发酵培养基的体积比为1:10，发酵培养基配方为糖蜜200 g/L、硝酸铵5 g/L、KH2PO4O. 3g/L、ZnSO4 O. 3g/L、MgS04 O. 3g/L、玉米浆 3g/L 和 CaCO3 50 g/L，在温度为 30°C、转速为300rpm条件下震荡培养150小时，培养液用板框过滤机过滤，收集滤液，得发酵液。c.聚苹果酸提取
将步骤b所得发酵液中加入相当于发酵液体积4倍的体积分数为95%的乙醇溶液，40C冷冻36小时，转速为5000rpm离心5分钟，收集沉淀，得到聚苹果酸。本实施例中，聚苹果酸产量为26g/L，所得聚苹果酸，用体积分数为95%的乙醇洗涤I次后，将沉淀溶解在浓度为2 M硫酸中，在90°C条件下水解9小时，得到苹果酸，苹果酸产量为29. 5g/L。实施例4
生产聚苹果酸的方法，具体步骤为 a.种子活化
将出芽短梗霉FMT1801 CCTCC NO: M 2012223接种于种子培养基中，接种量按照出芽短梗霉FMT1801种子液与种子培养基的体积比为1:100，种子培养基配方为葡萄糖40 g/L、硝酸铵 O. 005 g/L、KH2PO4 O. 005g/L、ZnSO4 O. 005g/L、MgSO4 O. 005g/L、玉米浆 0. 5g/L和CaCO3 10g/L，在温度为23°C、转速为250 rpm条件下震荡培养72小时，得活化种子液。b.发酵
将步骤a所得活化种子液接种于含3L发酵培养基的5L发酵罐中，接种量按照活化种子液与发酵培养基的体积比为1:15，发酵培养基配方为糖蜜50 g/L、氯化铵I g/L、KH2PO4O. 005g/L、ZnSO4 O. 005g/L、MgSO4 O. 005g/L、玉米浆 0. 005g/L 和 CaCO3 10 g/L，在温度为28°C、转速为500 rpm，通气量为1:0. 8条件下培养200小时，培养液用板框过滤机过滤，收集滤液，得发酵液。c.聚苹果酸提取
将步骤b所得发酵液中加入相当于发酵液体积5倍的体积分数为95%的乙醇溶液，40C冷冻24小时，转速为4500rpm离心20分钟，收集沉淀，得到聚苹果酸。本实施例中，聚苹果酸产量为21. 2g/L，所得聚苹果酸，用体积分数为95%的乙醇洗涤3次后，将沉淀溶解在浓度为2 M硫酸中，在70°C条件下水解15小时，得到苹果酸，苹果酸产量为24. lg/L。实施例5
生产聚苹果酸的方法，具体步骤为 a.种子活化
将出芽短梗霉FMT1801 CCTCC NO: M 2012223接种于种子培养基中，接种量按照出芽短梗霉FMT1801种子液与种子培养基的体积比为1:100，种子培养基配方为葡萄糖70 g/L、硝酸铵 3 g/L、KH2PO4 O. lg/L、ZnSO4 O. 15g/L，MgSO4 O. lg/L、玉米浆 lg/L 和 CaCO3 30g/L在温度为25°C、转速为220 rpm条件下震荡培养48小时，得活化种子液。b.发酵
将步骤a所得活化种子液接种于含5L发酵培养基的IOL发酵罐中，接种量按照活化种子液与发酵培养基的体积比为1:10，发酵培养基配方为糖蜜120 g/L、硝酸钾3 g/L、KH2P04 O. lg/L、ZnSO4 O. 15g/L、MgSO4 O. lg/L、玉米浆 lg/L 和 CaCO3 30 g/L，在温度为 25°C、转速为1000 rpm,通气量为1:1.6条件下培养96小时，培养液用板框过滤机过滤，收集滤液,得发酵液。c.聚苹果酸提取
将步骤b所得发酵液中加入相当于发酵液体积2倍的体积分数为95%的乙醇溶液，40C冷冻24小时，在3000rpm条件下离心20分钟，收集沉淀，得到聚苹果酸。本实施例中，聚苹果酸产量为34. 4g/L，所得聚苹果酸，用体积分数为95%的乙醇洗涤I次后，将沉淀溶解在浓度为2 M硫酸中，在85°C条件下水解10小时，得到苹果酸，苹果酸产量为39g/L。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
权利要求
1.高产聚苹果酸的出芽短梗霉/w/Bw/afl^OFMTlSOl,保藏号为CCTCCNO: M 2012223。
2.权利要求I所述出芽短梗霉FMT1801在生产聚苹果酸中的应用。
3.利用权利要求I所述出芽短梗霉FMT1801在生产聚苹果酸的方法，其特征在干，具体步骤为 a.种子活化 将出芽短梗霉FMT18 OI接种于种子培养基，在温度为2 3 -3 (TC震荡培养，得活化种子液；所述种子培养基为葡萄糖 40-100g/L、NH4NO31-5 g/L、KH2PO4 O. 005-0. 3g/L、ZnSO4O.005-0. 3g/L、MgSO4 0. 005-0. 3g/L、玉米浆 0. 05-3 g/L 和 CaCO3 10-50 g/L ； b.发酵 将步骤a所得活化种子液接种于发酵培养基，在温度为23-30°C震荡培养96小时以上，离心收集液体，得发酵液；所述发酵培养基为糖蜜50-200g/L、氮源l_5g/L、KH2PO4O.005-0. 3g/L、ZnSO4 O. 005-0. 3g/L、MgSO4 O. 005-0. 3g/L、玉米浆 0. 05_3g/L 和 CaCO310-50 g/L ； c.聚苹果酸提取 将步骤b所得发酵液中加入体积分数为95%的こ醇溶液，4°C冷冻，离心收集沉淀，得到聚苹果酸。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤a中，所述出芽短梗霉FMT1801按出芽短梗霉FMT1801种子液与种子培养基的体积比为1:100-1000接种，在转速为180-300 rpm 培养 36-96 小时。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述种子培养基为葡萄糖60-80g/L、NH4NO3 2-4g/L、KH2PO4 O. 05-0. 2g/L、ZnSO4 O. 05-0. 2g/L、MgSO4 0. 05-0. 2g/L、玉米浆1-2g/L和CaCO3 20-40 g/L。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤b中，所述活化种子液按活化种子液与发酵培养基的体积比为1:10-20接种，在转速为180-1000 rpm条件下培养96-200小吋。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述发酵培养基为糖蜜100-150g/L、氮源2-4g/L、KH2PO4O. 05-0. 2g/L、ZnSO4 O. 05-0. 2g/L、MgSO4 O. 05-0. 2g/L、玉米浆 0. 5_2g/L和 CaCO3 20-40 g/L。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤c是加入相当于发酵液体积1-5倍的体积分数为95%的こ醇溶液，4°C冷冻12-36小时，在转速不低于3000rpm的条件下离心不少于5分钟。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述步骤c是加入相当于发酵液体积2倍的质量分数95%的こ醇溶液，4°C冷冻24小时；在转速为3500rpm的条件下离心45分钟。
10.根据权利要求3-9任一项所述的方法，其特征在于所述氮源为硫酸铵、氯化铵、硝酸钾或硝酸钠。
全文摘要
本发明公开了高产聚苹果酸的菌株，具体为出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)FMT1801，保藏号为CCTCC NO:M2012223；能够利用工业副产物糖蜜为原料，原料成本低，并且聚苹果酸产率高；还公开了该菌株的在生产聚苹果酸中的应用和生产聚苹果方法，具有工艺简单，成产成本低的优点，具有广泛的应用前景。
文档编号C12P7/62GK102827778SQ201210200500
公开日2012年12月19日 申请日期2012年6月18日 优先权日2012年6月18日
发明者邹祥, 戢运超 申请人:西南大学