食品调味品中罂粟成分的检测方法
【专利摘要】本发明属于植物源成分的检测技术，具体地说是用实时荧光PCR技术检测食品调味品中罂粟成分的检测方法。方法包括PCR扩增反应液和上游引物CODM?F：5’-GCTAAACTCACGCTTGCAGAAA-3’；下游引物CODM?R：5’-GTTACAGACGCACCAATATTATTCAAC-3。食品调味品中罂粟成分的检测方法包括产品DNA的提取、罂粟特异性基因的实时荧光PCR扩增和使用荧光定量PCR仪随机软件分析扩增结果并进行结果判定。其优点是快速、特异性强、灵敏度高、操作简便、成本低。
【专利说明】食品调味品中罂粟成分的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物源成分的检测技术，具体地说是用实时荧光PCR技术检测食品调味品中罂粟成分的检测方法。
【背景技术】
[0002]磐粟(Papaver somniferumL)是S粟科的二年生草本植物。原产小亚细亚、印度和伊朗。我国部分地区药物种植场有少量栽培。
[0003]S粟壳含少量吗啡(Morphine)、可待因(Codeine)、蒂巴因(Thebaine)、那可汀(Narcotine)、S粟壳碱(Narcotoline)和S粟碱(Papaverine);另含多糖约 2.4水解可得乳糖10%、阿拉伯糖6%、木糖6%、鼠李糖4%、乳糖醒酸(Galacturonic acid) 60% >4-0-甲基葡萄糖醒酸(4-0-Methylglucuronic acid)4%、微量岩藻糖(Fucose)、2_0_ 甲基岩藻糖(2-0-MethyIfucose) >2-0-甲基木糖(2-0-Methylxylose)及葡萄糖醒酸(G-tucuronic acid)、景天庚糖(Sedoheptulose)、D-甘露庚酮糖(D-Mannoheptulose)、D-甘油基-D-甘露辛丽糖(D-Glycero-D-Mannooctulose)、内消旋肌醇(Mesoinositol)、赤藓醇(Erythritol)。食品中加入罂粟味道鲜美，但过量食用后易致瘾。
[0004]本发明经过对罂粟和常见食品成分进行PCR检测验证，适合检验检疫对罂粟成分鉴定，引物对罂粟具有满意的特异性和灵敏性，具操作简单，成本低的特点。
【发明内容】
[0005]本发明属于植物源`成分的检测技术，具体地说是用实时荧光PCR技术检测食品调味品中罂粟成分检测方法，为检测罂粟成分提供有效工具，从而加强对食品安全问题的监督监管，保护消费者的合法权益。
[0006]本发明的主要原理为:针对保守序列设计一组引物(上游引物:CODM F:5，-gctaaactcacgcttgcagaaa-3?和下游弓丨物:C0DM R:5，-gttacagacgcaccaatattattcaac-3’)。进行核酸检测时，模板DNA经加热至94-95°C—定时间后，DNA双链解离，即变性成单链。当温度下降到退火温度时，两条单链重新配对，即复性。PCR扩增的产物，变性状态下呈单链，荧光染料不与其结合就没有荧光信号。当温度为退火温度时，PCR产物复性成为双链DNA，荧光染料与其结合，可以检测到强的荧光信号。在双链DNA最多时，荧光信号最高，SP出现吸收峰，也就是在退火温度下出现最高的吸收峰。
[0007]本发明涉及的食品调味品中罂粟成分的检测方法，其中的试剂包括如下:
[0008](I) PCR扩增反应液A
[0009]包括IXPCR Master Mix(内含热启动的Taq DNA聚合酶、氯化镁、dNTP)，400nmol/L上下游引物，1.25 μ L SYBR Green荧光染料；
[0010]上游引物CODM F:5，-gctaaactcacgcttgcagaaa-3?;下游引物 CODM R:5，-gttacagacgcaccaatattattcaac-3，
[0011]其中上游引物、下游引物:1: I ；[0012]其中dNTP内的四种脱氧核糖核酸的混合物的质量比为dTTP: dATP: dGTP: dCTP = 1:1:1:1。
[0013](2)阳性对照DNA
[0014]上面所述PCR扩增反应液A，每管24μ L的最佳组成为:1XPCR MasterMix (内含热启动的Taq DNA聚合酶、氯化镁、dNTP)，400nmol/L上下游引物，1.25 μ L SYBR Green荧光染料。
[0015]使用上述试剂盒检测食品调味品中罂粟成分的方法，依次包括下列步骤
(1)-(3):
[0016](I)待检样品DNA的提取
[0017]DNA提取可使用CTAB法。
[0018](2)食品调味品中罂粟成分的实时荧光PCR扩增
[0019]A.在装有24 μ L PCR扩增反应液A的反应管中加入I μ L待检样品DNA，混匀。
[0020]B.将PCR反应管放入荧光PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增:
[0021]95°C 15min, I个循环预变性；
[0022]950C 15sec,60°C lmin，40 个循环。
[0023](3)应用荧光定量PC R仪随机软件，测定熔点曲线。
【具体实施方式】
[0024]下面结合实施例对本发明做进一步说明。
[0025]实施例1
[0026]按下述方法检测从中药店购得的罂粟壳，使用玉米粉作为实验的阴性对照:
[0027]包括IXPCR Master Mix(内含热启动的Taq DNA聚合酶、氯化镁、dNTP)，400nmol/L上下游引物，1.25 μ L SYBR Green荧光染料；上游引物CODM F:5，-gctaaactcacgcttgcagaaa-S，；下游引物 CODM R:5，-gttacagacgcaccaatattattcaac-3
夕
[0028]按照以下程序进行检测:
[0029](I)待测样品DNA的提取
[0030]A.称取经过预处理的待测样本1.0Og至50mL离心管中；半固体样品和液体样品称取2.00~4.00至50mL离心管中。
[0031]B.加入10mL65°C预热的CTAB提取缓冲液和RNase A酶(使其终浓度为10 μ g/mL),颠倒混匀后于65°C温育30min,期间颠倒混匀离心管2~3次；12000g离心IOmin,转移ImL上清液至2mL离心管中。
[0032]C.在离心管中加入与上清液等体积的三氯甲烷中，上下颠倒充分混匀，12000g离心IOmin,转移上清液600 μ L至2mL离心管中。
[0033]D.加入2倍体积CTAB沉淀液，颠倒混匀后，室温静置Ih ；12000g离心lOmin，弃去
上清液。
[0034]E.向沉淀中加入400 μ L氯化钠溶液，使之沉淀溶解，之后转移溶液至1.5mL离心管。
[0035]F.在溶解液中加入等体积三氯甲烷，颠倒混匀后，12000g离心lOmin，转移上层水相至1.5mL离心管中。
[0036]G.加入0.6倍体积经4°C预冷的异丙醇，颠倒混匀后，于4°C下静置30min ；12000g离心lOmin,小心弃去上清液。
[0037]H.加入500yL70%乙醇，震荡离心柱管，12000g离心lOmin，弃去上清液，重复一
次，在室温下挥干液体。
[0038]1.加入100 μ L TE溶液溶解DNA，4°C保存备用。
[0039](2)待测样品DNA的实时荧光PCR扩增
[0040]A.在PCR反应管中加入24 μ L PCR反应液A和I μ L样品DNA，混匀。
[0041 ] B.将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增:
[0042]95°C 15min, I个循环预变性；
[0043]950C 15sec,60°C lmin，40 个循环。
[0044](3)应用荧光定量PCR仪随机软件，测定熔点曲线。
[0045]实施例2
[0046]按下述方法检测从超市购得的罂粟与火锅调料的人工添加样品:
[0047]包括IXPCR Mast er Mix(内含热启动的Taq DNA聚合酶、氯化镁、dNTP)，400nmol/L上下游引物，1.25 μ L SYBR Green荧光染料；上游引物CODM F:5，-gctaaactcacgcttgcagaaa-S，；下游引物 CODM R:5，-gttacagacgcaccaatattattcaac-3
夕
[0048]按照以下程序进行检测:
[0049](I)待测样品DNA的提取
[0050]A.称取经过预处理的待测样本1.0Og至50mL离心管中；半固体样品和液体样品称取2.0O~4.0O至5OmL离心管中。
[0051]B.加入10mL65°C预热的CTAB提取缓冲液和RNase A酶(使其终浓度为10 μ g/mL),颠倒混匀后于65°C温育30min,期间颠倒混匀离心管2~3次；12000g离心IOmin,转移ImL上清液至2mL离心管中。
[0052]C.在离心管中加入与上清液等体积的三氯甲烷中，上下颠倒充分混匀，12000g离心IOmin,转移上清液600 μ L至2mL离心管中。
[0053]D.加入2倍体积CTAB沉淀液，颠倒混匀后，室温静置Ih ；12000g离心lOmin，弃去
上清液。
[0054]E.向沉淀中加入400 μ L氯化钠溶液，使之沉淀溶解，之后转移溶液至1.5mL离心管。
[0055]F.在溶解液中加入等体积三氯甲烷，颠倒混匀后，12000g离心lOmin，转移上层水相至1.5mL离心管中。
[0056]G.加入0.6倍体积经4°C预冷的异丙醇，颠倒混匀后，于4°C下静置30min ；12000g离心lOmin,小心弃去上清液。
[0057]H.加入500yL70%乙醇，震荡离心柱管，12000g离心lOmin，弃去上清液，重复一
次，在室温下挥干液体。
[0058]1.加入100 μ L TE溶液溶解DNA，4°C保存备用。
[0059](2)待测样品DNA的实时荧光PCR扩增[0060]A.在PCR反应管中加入24 μ L PCR反应液A和I μ L样品DNA，混匀。
[0061]B.将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增:
[0062]950C 15min, I个循环预变性；
[0063]950C 15sec,60°C lmin，40 个循环。
[0064](3)应用荧光定量PCR仪随机软件，测定熔点曲线。
【专利附图】
【附图说明】
[0065]图1罂粟特异性引物PCR产物的溶解曲线图谱。罂粟特异性扩增产物熔解曲线峰值在81±0.5°C，从中药店购得的罂粟壳在此处有扩增峰，阴性对照玉米粉没有扩增。
[0066]图2实际检测样品PCR产物的溶解曲线图谱。罂粟特异性扩增产物熔解曲线峰值在81±0.5°C，从中药店购得的罂粟 壳、罂粟与火锅调料的人工添加样品在此处有扩增峰。
【权利要求】
1.一种食品调味品中罂粟成分检测的方法，其特征在于罂粟特异性引物: 上游引物 CODM F:5’ -GCTAAACTCACGCTTGCAGAAA-3’ ；
下游引物 CODM R:5’ -GTTACAGACGCACCAATATTATTCAAC-3’。
2.一种使用权利要求一所述的快速检测食品调味品中罂粟成分检测的方法，其特征是依次包括下列步骤: (1)在PCR反应管中加入24μ L PCR反应液A和I μ L样品DNA，混匀。 (2)将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增: 950C 15min, I个循环预变性；
950C 15sec,60°C lmin,40 个循环。 (3)应用荧光定量PCR仪随 机软件，测定熔点曲线。
【文档编号】C12Q1/68GK103484530SQ201210202246
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2012年6月13日 优先权日:2012年6月13日
【发明者】高宏伟, 孙敏, 林超, 刘彩霞 申请人:山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心