专利名称：菊糖芽孢乳杆菌的d-乳酸脱氢酶及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种来源于菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)的
D-乳酸脱氢酶及其编码基因与应用。
背景技术：
3-苯基乳酸，即2-羟基-3-苯基丙酸，是一种重要的化学合成前体，并广泛应用于医药、化工和生物合成等领域。近几年来，它作为一种新型的抑菌剂又受到食品行业的广泛关注。3-苯基乳酸的第二个碳原子是手性碳，有两种构型，即D-苯基乳酸和L-苯基乳 酸，这两种构型化合物对生物体的作用及其在医药、化工方面的应用不同。D-苯基乳酸，又名D-3-苯基乳酸、D-2-羟基-3-苯丙酸或(R) -2-羟基-3-苯基丙酸(CAS号7326_19_4)。D-苯基乳酸可用于合成降血糖药、驱肠虫药，并对人体内类固醇的水平有一定的调节作用。D-苯基乳酸是用于制备4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸的手性砌块，也是制备降血糖助剂英格列酮以及15N-标记苯基丙氨酸的起始物。3-苯基乳酸的制备主要为化学合成法。3-苯基乳酸的化学合成主要有以下几种方法(I)吖内酯锌汞齐还原法；(2)由β -苯基丙烯酸锌汞齐还原法；(3)用苯甲醛经缩合、开环、水解、还原等几步反应制得。这些方法都在不同程度上存在技术复杂、污染环境、产品不纯、光学纯度低而不能得到单一构型化合物等缺点，因而近几年来转向了生物合成法的开发与研究。1996年，日本学者Hashimoto等从土壤中筛选到了一株假单胞菌(Pseudomonas sp.),能够转化苯乙醒_氰醇为D-苯基乳酸,生成的D-苯基乳酸光学纯度仅为75%。2002年，Katrin等从青忙草中也分离到了一株植质乳杆菌(Lactobacillusplantarum),它产生的D-苯基乳酸光学纯度仅为90%。美国Diversa公司开发了利用腈酶(EC 3. 5. 5. I)制备光学纯度大于99%的D-苯基乳酸。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有D-乳酸脱氢酶活性的蛋白，该蛋白来源于菊糖芽 包乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)。本发明所提供的具有D-乳酸脱氢酶活性的蛋白，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有D-乳酸脱氢酶活性的由序列I衍生的蛋白质。上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。序列表中序列I由335个氨基酸残基组成。为了便于所述蛋白的纯化，可在由序列表中序列I的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。
表标签的序列
权利要求
1.蛋白质，是如下(a)或(b) Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有D-乳酸脱氢酶活性的由序列I衍生的蛋白质。
2.编码权利要求I所述蛋白质的核酸分子。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于所述核酸分子是编码权利要求I所述蛋白质的基因；所述基因是如下I)至4)中任一所述的DNA分子 1)编码序列为序列表中序列2的DNA分子； 2)序列表中序列2所示的DNA分子； 3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA分子杂交且编码权利要求I所述蛋白质的DNA分子; 4)与I)或2)或3)限定的DNA分子具有80%以上同源性且编码权利要求I所述蛋白质的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；所述重组载体为重组克隆载体或重组表达载体。
5.权利要求I所述的蛋白在作为D-乳酸脱氢酶中的应用。
6.权利要求I所述的蛋白、或权利要求2或3所述的基因在如下(a)或(b)中的应用 (a)催化丙酮酸生成D-乳酸； (b)催化苯基丙酮酸生成D-苯基乳酸。
7.一种制备D-乳酸脱氢酶的方法，包括如下步骤将权利要求4所述的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到权利要求I所述的蛋白质，即为D-乳酸脱氢酶。
8.利用权利要求I所述蛋白质生产D-苯基乳酸的方法，包括如下步骤将权利要求I所述蛋白质、苯基丙酮酸、和NADH或NADPH，在27-35°C，pH5. 0-6.0的条件下反应，得到D-苯基乳酸。
9.利用权利要求I所述蛋白质生产D-乳酸的方法，包括如下步骤将权利要求I所述蛋白质、丙酮酸、和NADH或NADPH，在27-35°C，pH5. 0-6. 0的条件下反应，得到D-乳酸。
全文摘要
本发明公开了一种来源于菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)的D-乳酸脱氢酶及其编码基因与应用。本发明所提供的D-乳酸脱氢酶是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有D-乳酸脱氢酶活性的由序列1衍生的蛋白质。本发明所提供的D-乳酸脱氢酶能够以NADH为辅酶，也可以NADPH为辅酶，催化丙酮酸生成D-乳酸，也能以NADH为辅酶催化苯基丙酮酸生成D-苯基乳酸，且生成产物光学纯度可达100%(无L型产物生成)，具有广阔的工业应用前景。
文档编号C12N15/53GK102766608SQ20121021073
公开日2012年11月7日 申请日期2012年6月20日 优先权日2012年6月20日
发明者于波, 朱凌峰, 王丽敏, 马延和 申请人:中国科学院微生物研究所