专利名称：一种检测污泥中四环素类抗性基因tetG的引物序列及方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种检测污泥中四环素类抗性基因tetG的引物序列及方法。
背景技术：
抗生素是20世纪最重要的医学发现之一，长期以来，抗生素在医疗领域的广泛应用，对控制人类感染性疾病发挥了巨大的作用。同时，由于兽药抗生素能够预防动物疾病和一定程度上促进生长的双重功效，因此，常以亚治疗剂量长期添加于动物饲料中，出现在养殖业和畜牧业中。由于抗生素在畜牧业和养殖业中的长期滥用，在养殖动物肠道内诱导出抗性菌株，这些编码抗生素抗性基因的菌株是环境中抗生素抗性基因最重要的来源，携带抗性基因的抗性细菌如果在全球传播，可能导致大范围的对环境生物、人类健康和社会经济的潜在不利影响。环境中的抗生素抗性基因的污染越来越被人们视为一种生态性问题。相关研究表明，污水处理厂因为进水中包含重金属、抗生素、洗涤剂、季铵盐等物质，这些物质也可以协同或交叉引起微生物抗药性，且污水处理厂微生物分布密集，极易诱导微生物产生抗性基因；而污水处理厂出水被认为是受纳水体中抗生素抗性基因的主要来源。并且也有相关研究指出，污水处理厂污泥中可以检出多种四环素类抗性基因，抗性基因不仅种类丰富，相对含量也较高。近些年来，我国污水处理工作也在高速发展中，污水处理厂在解决我国水污染问题方面起到了巨大的作用，然而，污水处理厂的高速发展，产生的污泥问题也日益突出，因此对于污泥中抗性基因进行精确定量意义重大。近年来有许多关于微生物对四环素和其他类抗生素表型抗性的研究，然而目前研究所采用的方法只能研究可培养微生物的抗性，而对不可培养微生物的抗性及微生物体内导致这些抗性的特定基因无法检测。因此近年来越来越多的研究采用实时荧光定量PCR(Real-time quantitive PCR)技术作为研究手段，从数量上更为直观地探讨环境中抗性基因的变化，而且由于这种方法不依赖于微生物培养，因此也能检测不可培养微生物所携带的抗性基因，使最终得到的量化结果更为全面和可信。目前国外对环境中四环素抗性基因的定量研究主要集中于水环境，国内关于环境中抗生素抗性基因的研究才刚刚起步，而污水处理厂经常被认为是抗性基因的重要储存库，因此对于污泥中四环素类抗药基因为精确定量是十分必要的。
发明内容
本发明提供了一种检测污泥中四环素类抗性基因tetG的引物序列及方法，能对城市污水处理厂污泥中四环素类抗药基因tetG进行快速精确定量。一种检测污泥中四环素类抗性基因tetG的引物序列，包括正向引物和反向引物，其碱基序列为
正向引物TTATCGCCGCCGCCCTTCT；反向引物TCATCCAGCCGTAACAGAAC。本发明还提供了一种利用所述的引物序列检测污泥中四环素类抗性基因tetG的方法，包括(I)提取待测污泥样品中的DNA，以提取的DNA为模板，用所述的正向引物和反向引物进行定量PCR扩增并记录达到荧光阈值时的循环数；(2)将步骤(I)中得到的循环数参照定量PCR测定目的基因tetG质粒标准品的标
准曲线，得到待测污泥样品中四环素类抗性基因tetG的含量。所述定量PCR的反应体系为2ul DNA溶液，7.5ul SYBR Premix ExTaq溶液，0. 3ulROX Reference溶液，0. 3ul浓度为IOmM的正向引物，0. 3ul浓度为IOmM的反向引物，4. 6ulddH20。步骤(2)中所述标准曲线的标准品的制备方法为利用所述的正向引物和反向引物做普通PCR扩增；扩增序列用商业化凝胶回收试剂盒纯化；纯化后测量DNA含量、纯度并调节至合适浓度；接入载体并转化入感受态细胞；将感受态细胞涂于含有氨苄青霉素、X-gal和IPTG的LB固体培养基上培养12_16h，通过蓝白斑筛选挑取白色重组菌斑，挑选白色阳性克隆子用LB培养液扩大培养；待菌液混浊后，取Iml菌液送公司测序插入的基因片断，其余3-4ml菌液用来提取质粒；使用微量核酸蛋白质分析仪检测提取质粒的含量及纯度，确保质粒DNA的A260/A280比值在I. 8左右，符合要求的质粒作为标准品绘制标准曲线。所述DNA的提取方法为用FastDNA Spin Kit for soil试剂盒提取。采用该方法提取DNA具有以下优点(I)节约时间，只需要2个小时即可提取到样品的DNA，与传统的有机溶剂抽提法相比可以减少预处理的时间；(2)DNA提取效率稳定，且不易发生DNA降解，提取结果具有很好的重复性；(3)避免使用三氯甲烷等有机溶剂，保障实验操作人员的工作环境。本发明的有益效果(I)本发明的方法不依赖于微生物培养,与传统微生物培养法相比,也能检测不可培养微生物所携带的抗性基因，使最终得到的量化结果更为全面和可信，并且用FastDNASpin Kit for Soil试剂盒提取的DNA样品可以保存半年甚至多年，有利于将不同季节、不同地区污泥样品进行对比分析；(2)通过普通PCR反应，可以确定污泥中四环素类抗性基因tetG的存在与否；通过实时荧光定量PCR反应，可以确定污泥中四环素类抗性基因tetG含量，为污泥处置提供技术指导；(3)优化了定量PCR实验的反应液体系，对于反应孔壁上残留液，通过多次混匀离心以及添加ROX校准染料克服移液误差，将反应体系减少为15ul，而一般实验需要20ul甚至更多的反应液才能得出准确的数据，大大节约了检测成本，使得高通量检测成为可能。
图I是本发明引物序列对四环素类抗药基因tetG的PCR扩增结果图。其中M为maker ; C为阴性对照；I、2、3为3个污泥样品。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请权利要求书所限定的范围。FastDNA Spin Kit for Soil 试剂盒提取 DNA 的步骤如下I)将0. Ig冻干污泥样品放入Lysing Matrix E管中，加入978ul SodiumPhosphate缓冲液和122ul MT缓冲液，震荡混匀；2)将Lysing Matrix E管于14000g的离心力下离心IOmin,然后把上清液转移到
2.Oml的离心管中，加入250ul PPS ;并上下颠倒10次；3)将2ml离心管于14000g的离心力下离心5min，将上清液转移至IOml的离心管 中，并且重新悬浮Binding Matrix沉淀物,并取Iml加入到IOml离心管中。4)静置3min后，去除500ul上清液，并重新悬浮沉淀物，然后转移600ul悬浊物到SPIN Fliter中，于14000g的离心力下离心lmin，然后将上层离心管置于新的2ml离心管中，继续加入悬浊液，重复离心操作。5)SPIN Fliter置于新的2ml离心管中，加入500ul SEWS-M，用枪头重新悬浊SPIN Fliter内颗粒，然后于14000g的离心力下离心Imin ；6)再次将SPIN Fliter置于新的2ml离心管中，不加入任何溶液，然后于14000g的离心力下离心2min，离心后将SPIN Fliter置于室温下5min ；7)将SPIN Fliter置于新的I. 5ml离心管中，加入IOOul的DES溶液，静置I分钟，然后于14000g的离心力下离心I分钟，收集下层离心管中的溶液即为提取并纯化完成的 DNA。实施例I引物的设计(I)从 http: //www. ncbi. nlm. nih. rov/ 网点的 genbank 中下载四环素类抗性基因 tetG 基因序列(accession no. FJ411061. I、FJ411063. I、FJ411065. I、FJ411068. 1FJ411072. UFJ411074. UFJ411076. UFJ416863. U FJ950705. UGQ229171. I、GQ229173. UGQ229175. UGQ229177. UGQ229179. UGQ229181. UGQ229183. I、⑶324768. I、HQ399656. UHQ333262. I)；(2)将⑴得到的引物序列导入MEGA5. 0，使用alignment进行序列比对，去除差异性较高的片段，找到不同Accession No.的四环素类抗性基因tetG保守区；(3)将(2)得到的保守区序列输入到Primer Premier 5. 0，设计出满足定量PCR要求的引物，由于定量PCR要求扩增产物片段长度为75-200bp，经过筛选，确定一对扩增产物片段长度为 133bp 的引物，即正向引物 tetGF :5' -TTATCGCCGCCGCCCTTCT-3' (SEQ IDNO 1);反向引物 tetGR :5' -TCATCCAGCCGTAACAGAAC-5' (SEQ ID NO :2)。(4)引物特异性的验证软件验证采用NCBI的引物设计和特异性检验工具Primer-BLAST验证引物的特异性，显示引物特异性很好；实验验证验证结果见实施例2和实施例4。实施例2定性检测
(I)用FastDNA Spin Kit forsoil试剂盒提取污泥中的DNA,使用实施例I中的引物序列进行普通PCR扩增，PCR产物与1/6体积6X loadingbuffer dye混勻，使用经EB染色的I. 5%的琼脂糖凝胶，IOObp marker，在100-1IOV电压下电泳35分钟，检测PCR产物，结果如图I所示，结果显示有PCR产物存在。 (2) PCR扩增得到的序列以BioSpin胶回收试剂盒纯化后，测量DNA含量、纯度并调节至合适浓度(即vector DNA和insert DNA摩尔比为I : 2 10)后，接入pMD19_T载体并转化入大肠杆菌DH5a感受态细胞中。(3)将感受态细胞涂于含有氨苄青霉素、X-gal和IPTG的LB固体培养基上培养12-16h，通过蓝白斑筛选挑取白色重组菌斑，挑选阳性克隆子用LB培养液扩大培养，待菌液混浊后，取ImL菌液送上海基康生物技术有限公司测序插入的基因片断，剩余的2-4ml用于提取质粒制备标准品。
测序得到4个DNA序列，序列片段大小均为133bp，其碱基序列分别如SEQ ID NO
3、SEQ ID NO 4, SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :6 所示。(4)测序结果通过 NCBI 网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)的 BLAST进行序列同源性检索比对。测序序列对核酸库的比对，直接比较核酸序列的同源性，同源性良好，证明本发明设计的引物特异性高。实施例3标准品的准备(I)实施例2中LB培养液扩大培养后的混浊菌液，Iml送去测序，其余的2_4ml菌液使用QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN)提取质粒,使用微量核酸蛋白质分析仪检测提取质粒的含量及纯度，确保质粒DNA的A260/A280比值在I. 8左右，作为标准品。(2)计算出质粒拷贝数，质粒拷贝数的计算公式为拷贝数=(质量+分子量)X6. 02X IO230(3)计算得到四环素类抗性基因tetG的拷贝数，按10倍为稀释梯度稀释为标准曲线，并且使质粒拷贝数保持在IO8-IO3之间。(4)标准曲线的反应体系为2ul DNA溶液(标准品)，7.5ul SYBRPremix ExTaq 溶液，0.3ul ROX Reference 溶液,0. 3ul IOmM 正向引物,0. 3ul IOmM 反向引物,4. 6ulddH20。每一次定量PCR反应都需要加入标准品进行实验，标准曲线中横坐标为四环素类抗性基因tetG质粒拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。实施例4定量检测用实施例I中设计的引物序列进行实时荧光定量PCR检测待测污泥中四环素类抗药基因tetG含量(I)采集城市生活污水处理厂剩余污泥，使用冷冻干燥机冻干后作为待测样品；(2)取待测样品0. lg，用FastDNA Spin Kit for Soil按照标准步骤提取DNA，调节浓度至10ng/ul并保存待测；(3)配制定量PCR反应的反应液体系7. 5ul SYBR Premix Ex Taq溶液，0. 3ul ROXReference溶液,0. 3ul的IOmM浓度的正反引物对,4. 6uIddH2O0每个样品做三次重复，使用10ul、50ul量程的排枪操作，降低移液枪枪头残留溶液的影响；(4)将反应液体系转移至96孔反应板的反应孔中，将步骤⑴中提取的DNA取2ul,及2ul实施例2中的标准品加入对应的反应孔中通过StepOne Software v2. 0点击开始实验。反应条件为95°C下热变性5分钟，然后进入40个循环的扩增阶段，95°C变性3秒,55°C扩增30秒,72°C延伸30秒,延伸的同时扫描突光信号,根据每一轮扩增扫描到的信号强弱对比标准品的信号强弱得出样品中四环素类抗药基因tetG的浓度。 实验结束后系统即自动生成标准曲线和待测样品的浓度，三个重复实验结果拷贝数分别为 9. 17X106copies/ul、9. 83X 106copies/ul 1、9. 38X 106copies/ul，说明待测污泥样品中含有四环素类抗药基因tetG，证明利用实施例I中设计的引物序列进行定量PCR能有效检测待测污泥样品中的四环素类抗药基因tetG的含量。
权利要求
1.ー种检测污泥中四环素类抗性基因tetG的引物序列，其特征在于，包括正向引物和反向引物，其碱基序列为 正向引物TTATCGCCGCCGCCCTTCT ； 反向引物TCATCCAGCCGTAACAGAAC。
2.ー种利用权利要求I所述的引物序列检测污泥中四环素类抗性基因tetG的方法，其特征在于，包括 (1)提取待测污泥样品中的DNA，以提取的DNA为模板，用权利要求I所述的正向引物和反向引物进行定量PCR扩增并记录达到荧光阈值时的循环数； (2)将步骤⑴中得到的循环数參照定量PCR測定目的基因tetG质粒标准品的标准曲线，得到待测污泥样品中四环素类抗性基因tetG的含量。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述定量PCR的反应体系为2ulDNA溶液，7.5ul SYBR Premix Ex Taq 溶液，0.3ul ROXReference 溶液，O. 3ul 浓度为 IOmM 的正向引物，O. 3ul浓度为IOmM的反向引物，4. 6ul ddH20。
全文摘要
本发明公开了一种检测污泥中四环素类抗性基因tetG的引物序列及方法，引物序列包括正向引物和反向引物，其碱基序列为正向引物TTATCGCCGCCGCCCTTCT；反向引物TCATCCAGCCGTAACAGAAC。检测污泥中四环素类抗性基因tetG的方法包括(1)提取待测污泥样品中的DNA，以提取的DNA为模板，用所述的正向引物和反向引物进行定量PCR扩增并记录达到荧光阈值时的循环数；(2)将步骤(1)中得到的循环数参照定量PCR测定目的基因tetG质粒标准品的标准曲线，得到待测污泥样品中四环素类抗性基因tetG的含量。本发明的引物序列和方法实现了污泥样品中四环素类抗性基因tetG的快速精确定量检测。
文档编号C12Q1/68GK102732627SQ20121021098
公开日2012年10月17日 申请日期2012年6月20日 优先权日2012年6月20日
发明者张明美, 陈红 申请人:浙江大学