专利名称：陆地棉GhLFY蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及ー种陆地棉GhLFY蛋白及其编码基因与应用。
背景技术：
棉花是我国最重要的经济作物之一，在国民生产中占有重要 地位，但由于粮棉争地，在一定程度限制了棉花的发展。短季棉品种的选育和推广，可以缓解粮棉争地的矛盾，是实现粮棉双丰收的有效途径。但目前短季棉存在早熟性不够的问题。早熟性作为棉花的重要性状之一，成为陆地棉重要的育种目标。研究表明，开花早晚与棉花的早熟性密切相关。因此克隆开花相关基因，对其进行表达分析和转基因功能验证，为短季棉育种提供优质的基因资源。
发明内容
本发明的ー个目的是提供ー种陆地棉GhLFY蛋白及其编码基因。本发明提供了蛋白，是如下(a)或(b):(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过ー个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物开花相关的由序列2衍生的蛋白质。上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。编码上述蛋白的基因也是本发明保护的范围。上述基因为如下I) -5)中任一一种的DNA分子I)序列表中序列I所示的DNA分子；2)序列表中序列I自5’末端第11-1231位核苷酸所示的DNA分子；3)序列表中序列I自5’末端第3-1300位核苷酸所示的DNA分子；4)在严格条件下与I)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码与植物开花相关蛋白的DNA分子；5)与I)或2)或3)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码与植物开花相关蛋白的DNA分子。上述严格条件为也可为在6父55(，0.5%505的溶液中，在65° C下杂交，然后用2 X SSC, O. 1%SDS 和 I X SSC, O. 1%SDS 各洗膜一次。含有上述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范上述重组载体具体为将上述基因插入表达载体中，得到表达上述蛋白的重组载体。上述重组载体具体为pRIlOl-GhLFY，为将序列表中的序列I插入pRIlOl的NdeI和EcoRI之间得到的载体。扩增上述基因全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围。上述引物对中的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列3，所述引物对中的另一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列4。上述蛋白、上述基因或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在如下I) -4)至少ー种中的应用也是本发明保护的范围I)调节植物抽薹；2)调节植物开花；3)调节植物莲座叶数量；4)调节植物茎生叶数量。上述应用中，所述调节植物抽薹为促进植物抽薹；所述调节植物开花为促进植物开花；所述调节植物莲座叶数量为减少植物莲座叶数量；所述调节植物茎生叶数量为增加植物茎生叶数量；所述植物具体为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物进ー步具体为拟南芥。本发明的另ー个目的是提供ー种培育转基因植物的方法。本发明提供的方法，为将上述蛋白的编码基因导入目的植物中，得到转基因植物，所述转基因植物具有如下I) -4)中至少ー种表型I)所述转基因植物的抽薹时间早于所述目的植物；2)所述转基因植物的开花时间早于所述目的植物；3)所述转基因植物的莲座叶数量少于所述目的植物；4)所述转基因植物的茎生叶数量多于所述目的植物。上述方法中，将上述蛋白的编码基因通过上述的重组载体导入目的植物；上述目的植物具体为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物进ー步具体为拟南芥。本发明的实验证明，本发明发现了ー种新基因GhLFY，将其进行转基因，得到转基因植物的开花时间提前，且抽薹时间也提前，同时植物莲座叶数量減少，茎生叶数量増加；因此利用该基因可用来培育生育期短的棉花，为转基因植物的培育奠定了基础。
、
图I为GhLFY荧光定量分析图2为植物表达载体pRI IOl-GhLFY表达载体的构建图3为转基因植株的PCR鉴定图4为长日照条件下3个转基因株系T3代纯合体转基因植株表型统计结果图5为长日照条件下GhLFy基因在拟南芥的超表达表型
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。供试材料为早熟棉品种中棉所36 (CCRI36)(购自中国农业科学院棉花研究所)，于2010年种植于中国农业科学院老所部试验田中，于2010年5月份取根、茎、叶、花、顶芽等不同组织，立即放入盛有液氮的液氮罐中，带回实验室后于_80°C冰箱存放备用。载体为pGEM '-TEasy Vector,购自 Promega 公司。菌种为大肠杆菌DH5ci购自天根生物技术有限公司。Taq DNA聚合酶购自普金生物有限公司，DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物技术有限公司，Amp、X_gal、IPTG、Rif、链霉素、Kan等抗生素为Sigma公司产品，SuperScriptTM III First-Strand Synthesis System for RT-PCR 试剂盒购自 invitrogen 公司，其余试剂均为进口或国产分析纯试剂。实施例I、棉花基因GhLFY的克隆一、棉花基因GHLFY的克隆1、RNA 的提取按照CTAB法，RNA的提取操作步骤(I)在离心管架上放置50ml的离心管，加15ml提取液于离心管后加入300ul
3-巯基乙醇，65°C水浴锅预热IOmin ；(2)将研钵及杵洗净擦干后倒入少许酒精燃烧杀菌，冷却后再加液氮预冷，将2_3g早熟棉品种中棉所36的不同组织放入冷却后的研钵中，迅速研磨，待研磨成细末状后，将其用预冷的小勺刮入65°C预热的提取液中，剧烈震荡后放入65°C温浴lOmin，期间震荡3-4次；(3)加入等体积的氯仿异戍醇(24:1),立即剧烈震荡IOmin, 13000rpm, 4°C下离心 5min;(4)小心取上清液，再加入等体积的氯仿异戊醇(24:1)，马上剧烈震荡，震荡IOmin, 13000rpm, 4°C离心 5min;(5)取上清液于一新管，在上清液中加入1/4倍体积的lOmol/lLicl，轻柔混匀，
4°C冰箱过夜沉淀RNA;(6)将经过夜沉淀后的溶液在4°C条件下，13000rpm离心12min，将上清液倒掉，用400ul DEPC处理过的水溶解沉淀；(8)加入等体积的酹后立即剧烈震荡，13000rpm,4°C离心5min ；(9)小心取上清液于一新管，在上清液中加入等体的氯仿异戊醇(24 :1)，立即剧烈震荡，IOOOOrpm, 4°C，离心 5min ；(10)小心取上清液于另一新管，加1/10倍体积的3mol/L醋酸钠和2. 5倍体积的无水乙醇，_70°C条件下沉淀大与30min ；(11) 4°C条件下，13000rpm 离心 IOmin,弃上清液，(12) 70%酒精洗沉淀1-2次；无水乙醇洗一次，风干后溶于20ul DEPC处理过水中，取Iul电泳检测，_70°C冰箱保存。2、cDNA的制备步骤使用Invitrogen 公司的 SuperScript III First-Strand Synthesis System forRT-PCR，使用前将每种复合物都短暂离心混匀。I)将DEPC处理过的0. 5ml的离心管放冰上，按下列顺序加入Total RNA3ug50uM Oligo (dT) 20IulIOmM dNTP MixIul用DEPC-treated water 补足 IOul,配成 RNA/Primer mixture ；2) 65°C 保温 5min，冰浴至少 Imin ；
3)在DEPC处理过的0. 5ml的离心管中准备cDNA SynthesisMix
CompenentVolume
IOxRT buffer2ul
25mM Mgcl24ul
0.IM DTT2ul
RNase OUTTM(40U/ul)Iul
SuperScriptTM III RTIul
Total VolumeIOul4)将 IOul cDNA SynthesisMix 加到 RNA/Primer mixture 中，轻柔混勻，短暂离心；5) 50°C保温50min ;85°C保温5min后放冰上，离心数秒收集反应液；6)加 IulRNaseH 到反应液中，37°C保温 20min ；7)取Iul反转录产物电泳检测，其余_20°C保存备用。3、RACE 步骤SMARTer RACE cDNA Amplification kit购自 Clotech 公司，3，-RACE-Ready cDNA 的制备I)先在DEPC处理过的0. 2ml离心管中按照下列配方准备足量的Buffer Mix
成份体积
SxFirst-Strand Buffer2. Oul
DTT(20mM)I. Oul
dNTP Mix(IOmM)LOul
Total Volume4. Oul涡旋混匀后短暂离心，室温放置，待用；2)在一新的 DEPC 处理过的 0. 2ml 离心管中加 3. 75ulRNA 和 Iul 3，-CDS PrimerA,涡旋混匀后短暂离心；在PCR仪上72°C孵育3min，42°C孵育2min后14000g离心IOsec ；3)按照下列顺序室温下准备Master Mix成份体积
Buffer Mix from step I)4. Oul
RNase Inhibitor(40U/ul)0 Z5ul
SMARTScribeTM Reverse Transcriptase(100U)I. Oul
Total Volume5.25ul4)将上一步配制的5. 25ul Master Mix加入到第2)步配制的4. 75ul反应液中，共IOul，轻轻吸打混匀后，在PCR仪上42°C孵育90min继而72°C孵育IOmin ；5)用20ul Tricine-EDTA Buffer稀释反应液,立即用于后续试验或_20°C保存备用。4、3，-RACE PCR 扩增I)按照下列顺序准备PCR Master Mix
成份体积
PCR-Grade Water34. bu丄
IOxAdvantage 2 PCR Buffer5ul
dNTP MixIul
50xAdbantage 2 Polymerase MixIul
Total Volume41. 5ul将反应液涡旋混匀后短暂离心。2)在 0. 5ml PCR 管中准备 PCR reactions
成份体积
3’ -RACE-Ready cDNA2. 5ul
UPM(IOx)5u I
GSP2(IOuM)Iul
Master Mix41. 5ul
Total Volume50ul3)在PCR仪上按照以下程序进行PCR:5cycles:94°C 30sec，72°C 3min5cycles:94°C 30sec，70°C 30sec，72°C 3min25cycles:94°C 30sec,68°C 30sec,72°C 3min琼脂糖电泳检测、胶回收、连接转化和测序。5、基因克隆在NCBI上下载蓖麻、杨树、葡萄、拟南芥、金鱼草、玉米、大豆、水稻等物种的LFY同源基因蛋白序列，在雷蒙德氏棉基因组数据库中执行blastx，将所得序列用CAP3在线拼接，将拼好的CONTIG在NCBI上做blastx分析。将通过在雷蒙德氏棉基因组数据库里做本地blast所得序列进行在线拼接，将拼接到的Contigs在NCBI上做blastx,根据比对结果，挑选含有起始密码子的Contig5设计上游引物，为得到较长序列挑选比对结果靠近3’端的Contigl的设计下游引物。根据Contig5 和 ContigI 设计的上下游引物(F: 5 ’ -ATGGACCCTGAGACTTTTGC-3 ’ ； R:5’-CATGTCCACCAGAAACCGAA-3’)，以中棉所36顶芽cDNA为模板进行PCR扩增，得到1095bp核心cDNA序列，为得到完整的0RF，以已扩增得到的cDNA核心序列为模板设计3’ RACE引物(F: 5，-GAGCACCCTTTCATCGTAACGGAGCC-3，; R: 5，-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3，(R 为试剂盒中提供的通用引物))，一次PCR即得到770bp的特异性条带，根据重叠序列的比较和polyA尾巴的发现，确定所得序列为目的序列。整合核心cDNA和RACE结果，设计引物(F:5，-ATGGACCCTGAGACTITTGCT-3’ ；R:5’ -GCGAGGCTAAACTAAACTAAAC-3’)扩增 cDNA 序列，送去测序得到1336bp序列，开放阅读框为1221bp，。1336bp的片段具有序列表中的序列1，将该序列所示的基因命名为GhLFY，其开放阅读框长为1221bp，为序列表中序列I自5’末端第11-1231位核苷酸，编码406个氨基酸，该基因编码的蛋白的氣基酸序列为序列表中的序列2。二、棉花基因GhLFY的时空表达模式分析以中棉所36不同组织的cDNA稀释50倍数作为模板，进行荧光定量，所用引物为F: 5 ’ -GCAGTGTCGGGATTTCTTGATT-3，;R:5 ’ -AGGCAATGTAGGGCGTAGCAAT-3，。具体操作步骤如下I)用01igo6.0设计荧光定量引物，PCR检测引物特异性；2)按照下列顺序配制荧光定量PCR体系
成份体积
SYBR GREEN I12. 5ul
Forward primerIul
Reverse primerIul
cDNA 模板2ul
ddHa09.5ul
Total Volume25ul设置3个重复，由于加样会存在些许误差，因此要按照样品的个数多配制一些，以防样品不足。3)采用相对定量A ACt法分析，以ACTIN为内参，引物序列为F:ATCCTCCGTCTTGACCTTG; R: 5 ’ -TGTCCGTCAGGCAACTCAT-3，4) PCR 程序首先95°C预变性lOmin，然后95°C变性10s，60°C退火35s，72°C延伸35s，40个循环，72°C延伸lOmin，在72°C，30s处收集荧光信号。5)数据分析为了研究GhLFY基因的表达模式，qRT-PCR被用于检测GhLFY在各个组织中的表达情况。
结果如图I所示，a) GhLFY在不同组织中的表达分析，b) GhLFY在顶芽不同发育时期的表达分析I、II、III、IV、V分别代表第一片真叶至第五片真叶展平时的顶芽；发现，GhLFY在顶芽中优势表达，而在根茎叶中表达量较低，这和其作为花分生组织特性基因控制花序分生组织向花分生组织转换的职能相吻合。实施例2、棉花基因GhLFY的在促进植物开花中的应用—、表达载体的构建以中棉所36顶芽cDNA为模板(也可以人工合成的序列I作为模板)，以infusion引物(F: 5 ’ -CACTGTTGATACATATGCTTCAAAAATGGACCCTGAGAC-3，(序列 3 ) ; R: 5 ’ -TGTTGATTCAGAAITCTTCAGITCCAACTTAAACCATACA-3’(序列4)，扩增得到包含GhLFY基因完整开放阅读框的PCR产物，经过测序，为序列表中序列I自5’末端第3-1300位核苷酸；将植物表达载体pRIlOl (Takara Code D3262)经过NdeI和EcoRI酶切，得到载体骨架； 将上述载体骨架与上述PCR产物用Clotech的Infusion连接试剂盒连接。pRIlOl的酶切体系如下
成份体积
IOxNEB缓冲液5ul
PRIlOl 质粒18ul
NdelIul
EcoRlIul
灭菌双蒸水26ul
总体积50ulInfusion连接试剂盒的连接体系如下
成份体积
5xInfusion Buffer2ul
In-fusion EnzymeIul
_切后的pRIlOl载体4ul
PCR纯化产物3ul
总体积IOul将连接产物37°C温育15min，50°C温育15min，放置冰上。用TE(PH8. 0)将连接液稀释50倍，转化大肠杆菌细胞，挑单克隆菌液提取质粒进行，结果为该质粒为将序列表中 的序列I自5，末端第3-1300位核苷酸插入pRIlOl的NdeI和EcoRI之间得到的载体，命名为pRIlOl-GhLFY，其结构示意图如图2所示。二、转GhLFY拟南芥的获得I、转GhLFY拟南芥的获得I)重组农杆菌的获得
将质粒pRI 101-GhLFY 转入农杆菌 LBA4404 (TAKARA Code :9115)感受态细胞中，得到重组菌。提取重组菌的质粒送去测序，该质粒为PRI 101-GhLFY，将含有该质粒的重组菌命名为 LBA4404/pRI 101-GhLFY。2)转化 (I)拟南芥的种植先将野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana(ecotypeColumbia) (ABRC seed stock,Ohio State University facility))种子消毒(75% 的酒精洗3min, ddH20洗5次,0. 1%升萊洗3min, ddH20洗5次),在无菌的滤纸上晾干,然后用无菌的牙签将其挑至MS培养基上，用封口膜封口，再包上锡箔纸放置4°C春化，2-3天后去掉锡箔纸将其转移至光温培养箱(22°C，16h光照/8h黑暗)培养，待长出四片叶子后移栽至土中，转移至拟南芥培养室培养架上(25°C，16h光照/8h黑暗)。(2)拟南芥的转化接种LBA4404/pRIIOl-GhLFY于5mlLB培养基(含终浓度为50ug/ml的卡那)中，28°C，180rpm，振荡过夜；以1:50比例转接到200mlLB培养基中，280C，180rpm培养至0D600=1. 2 ；4000rp离心15min收集菌体，将菌体重悬于渗透缓冲液，以重悬渗透液为对照，调节0D600=0. 8 ;将开花的野生型拟南芥植株已授粉和结荚的用消过毒的剪刀剪去，将拟南芥花浸入装有渗透缓冲液的小烧杯中浸染50seC，然后将浸染过的拟南芥植株放置大塑料桶中黑暗培养，24hr后于拟南芥培养室继续培养；待果荚成熟后混合收种，得到Ttl代转GhLFY拟南芥种子。将Ttl代种子经消毒春化后在加抗生素卡那霉素的MS培养基上培养，非转基因株不能正常生长，筛选得到阳性Ttl代转GhLFY拟南芥。2、转基因后代的分子鉴定提取阳性Ttl 代转 GhLFY 拟南芥的基因组 DNA，以 Forward primer (5’-GACGCACAATCCCACTATCC-3’)和 Reverse primer (5’-CCACCTATTACCATCTCCCAC-3’)为引物进行PCR扩增，以野生型拟南芥(WT)为对照。PCR 体系(25ul)如下
成份体积
ddH204ul
Kod Fx Neo buffer12. 5ul
dNTP5ul
Forward primerIul
Reverse primerIul
Kod Fx Neo0 5ul
DNAIul
Total Volume25ulPCR程序如下
权利要求
1.ー种蛋白，是如下(a)或(b): Ca)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过ー个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物开花相关的由序列2衍生的蛋白质。
2.编码权利要求I所述蛋白的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于所述基因为如下I)-5)中任一一种的DNA分子 1)序列表中序列I所不的DNA分子； 2)序列表中序列I自5’末端第11-1231位核苷酸所示的DNA分子； 3)序列表中序列I自5’末端第3-1300位核苷酸所示的DNA分子； 4)在严格条件下与I)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码与植物开花相关蛋白的DNA分子； 5)与I)或2)或3)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码与植物开花相关蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌； 所述重组载体具体为将权利要求2或3所述基因插入表达载体中，得到表达权利要求I所述蛋白的重组载体。
5.扩增权利要求2或3所述基因全长或其任意片段的引物对。
6.根据权利要求5所示的引物对，其特征在于所述引物对中的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列3，所述引物对中的另一条弓I物的核苷酸序列为序列表中的序列4。
7.权利要求I所述蛋白、权利要求2或3所述基因或权利要求4所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在如下I) -4)至少ー种中的应用 1)调节植物抽薹； 2)调节植物开花； 3)调节植物莲座叶数量； 4)调节植物茎生叶数量。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于 所述调节植物抽薹为促进植物抽薹； 所述调节植物开花为促进植物开花； 所述调节植物莲座叶数量为减少植物莲座叶数量； 所述调节植物茎生叶数量为增加植物茎生叶数量； 所述植物具体为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物进ー步具体为拟南芥。
9.ー种培育转基因植物的方法，为将权利要求I所述蛋白的编码基因导入目的植物中，得到转基因植物，所述转基因植物具有如下I)-4)中至少ー种表型 1)所述转基因植物的抽薹时间早于所述目的植物； 2)所述转基因植物的开花时间早于所述目的植物； 3)所述转基因植物的莲座叶数量少于所述目的植物； 4)所述转基因植物的茎生叶数量多于所述目的植物。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于 所述将权利要求I所述蛋白的编码基因通过权利要求4所述的重组载体导入目的植物； 所述目的植物具体为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物进ー步具体为拟南芥。
全文摘要
本发明公开了一种陆地棉GhLFY蛋白及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物开花相关的由序列2衍生的蛋白质。本发明的实验证明，本发明发现了一种新基因GhLFY，将其进行转基因，得到转基因植物的开花时间提前，且抽薹时间也提前，同时植物莲座叶数量减少，茎生叶数量增加；因此利用该基因可用来培育生育期短的棉花，为转基因植物的培育奠定了基础。
文档编号C12N1/19GK102718853SQ201210213009
公开日2012年10月10日 申请日期2012年6月26日 优先权日2012年6月26日
发明者喻树迅, 宋美珍, 庞朝友, 李洁, 范术丽, 魏恒玲 申请人:中国农业科学院棉花研究所