一种用于扩增短链rna的引物及其相关方法
【专利摘要】一种用于短链RNA扩增的引物及其相关方法，该引物为一条寡核苷酸，其5`端一段核苷酸序列是固定的，形成一个核苷酸环和核苷酸茎的结构，其3`端连接6-8个核苷酸与成熟miR?3`端相互配对形成特异性互补结合，在核苷酸环的3`端含一段GC含量达70%以上长的核苷酸序列，称为通用探针区；由引物5`端第8-30位核苷酸组成通用反向引物区。本引物存在一个内部双链结构由于空间位阻的关系，不会与位于核苷酸链内部的特异性序列结合，该类序列不会发生反转录反应；只与3`末端特异性配对结合，特异性反转录。本发明的引物特异性高，不形成引物二聚体，设计简单，合成方便，适合短链RNA尤其是成熟miR的反转录。
【专利说明】—种用于扩增短链RNA的引物及其相关方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子检测领域，特别涉及反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)中检测全长为18-25nt的成熟miR所用的反转录引物的设计与应用【技术领域】。
【背景技术】
[0002]成熟miR是最近发现的一类全长为18_25nt的单链小分子非编码RNA，是由茎环结构的转录前体(包括pr1-miRNA约lOOObp、pre-miRNA约60_70bp)加工而成。2011年11月Sanger miRBase数据库(18.0版)公布,发现了 2万多种转录本,包括人类的近2000种。miRNAs是Victor Ambros及其同事首先在线虫体内发现的，是一类非编码的内源性单链小分子RNA。其5'端的2_8nt种子区域(seed region)可与其革E mRNA的3'UTR以Waston-Crick碱基全部或部分互补配对(Watson-Crick basepairing),从而发挥转录调控作用。人们预测大约30%的人类基因受miRNAs的调控，每种miRNA调控大约200种靶基因，而每种基因又受多种miRNA调控。各项研究亦表明它参与了人体重要的生物学进程，如发育、造血、器官形成、细胞分化、凋亡和增殖、癌症发生等。随着对miRNAs研究的日趋深入，众多的研究数据显示超过50%的miRNAs基因位于癌基因或脆性基因区域，发挥着癌基因或抑癌基因的作用，在多种癌症中表达上调或降低。
[0003]第一篇有关miRNA的论文发表于1993年，随后的十年间相关的研究论文相当有限，然而近5-6年来有关miRNA的研究论文数成倍增加，2010年大约就有近12000篇论文公开发表并且有文献表明，成熟miRNA具有组织特异性、疾病特异性、存在于外周血且非常稳定。因此，miRNA不仅有治疗价值而且有诊断价值。miRNA已经成为广大学者研究的热点，并逐渐向应用领域转化。如何进行准确、特异地检测miRNA成为首先要解决的问题。虽然miRNAs是一类表达相对丰富的转录本，但他们在不同物种和组织中的表达水平变化非常大。低丰度的miRNAs,通常用 克隆、northern blot和芯片的技术将难以检测。如果要精确和定量检测miRNA尤其是低丰度miRNA，qRT-PCR技术无疑是最佳选择，因为实时荧光定量PCR技术是检测基因表达的金标准。1985年，美国科学家Kary Mullis在高速公路的启发下，经过两年的努力，发明了 PCR技术，并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。从此，PCR技术得到了生命科学界的普遍认同，Kary Mullis也因此而获得1993年的诺贝尔化学奖。PCR的基本工作原理就是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。通过不断重复这一过程，可以使目的DNA片段得到扩增。另一方面，新合成的DNA片段也可以作为模板，因而PCR技术可使DNA的合成量呈指数型增长。
[0004]PCR是一种级联反复循环的DNA合成反应过程。PCR技术的基本反应由三个步骤组成:
[0005]1.变性:通过加热使模板DNA完全变性成为单链，同时引物自身和引物之间存在的局部双链也得以消除；[0006]2.退火:将温度下降至适宜温度，使引物与模板DNA退火结合；
[0007]3.延伸:将温度升高，热稳定DNA聚合酶以dNTP为底物催化合成DNA链延伸。[0008]以上三步为一个循环，新合成的DNA分子又可以作为下一轮合成的模板，经多次循环后即可达到扩增DNA片段的目的。到目前为止，PCR技术已有十几种之多，例如，将PCR与反转录酶结合，成为反转录PCR (RT-PCR)用于RNA的扩增，将PCR与抗体等相结合就成为免疫PCR等。
[0009]应用PCR技术检测有一定长度(如IOObp到几个kb)的DNA或RNA，初学PCR的技术人员也不会有多大的困难，但是如何设计长度只有18-25nt的成熟miRNA的反转录引物、特异性的正向引物、标记染料的TaqMan探针和反向引物是解决miRNA定量RT-PCR检测的关键所在。因为普通引物的理想长度在15-30bp之间，按照常规的做法一条成熟miRNA的长度就几乎为引物链覆盖了，这样扩增将难以实现。目前解决这一问题的是美国的AB公司，她采用了一种茎环引物反转录成熟miR，来加长转录后的cDNA，实现PCR扩增检测的目的。
[0010]在中国专利文献库检索也没有相关文献。
【发明内容】
[0011]本发明所解决首要技术问题是提供一种用于短链RNA (包括成熟miR) RT-PCR扩增的新式引物。该引物在设计思路上与前述的当前引物根本不同，通过巧妙的设计将引物的特异性大大提高，设计简单，成本低，适用广。
[0012]本发明所解决另一个技术问题是提供一种相关的扩增短链RNA的方法。
[0013]本发明解决上述首要技术问题所采用的技术方案是:一种用于扩增短链RNA的引物，其引物共4条，分别为茎环反转录引物、特异性正向引物、通用反向引物和通用探针，其特征是:茎环反转录引物由5段不同长度的寡核苷酸组成，3'端的6-8bp组成第一区域与miRNA的3'端形成特异性互补，决定反转录的特异性，第二区域和第五区域互补结合，形成引物内部双链结构，其Tm值应高于反转录最适温度2-5°C，在反转录的过程中始终保持双链形式，靠近5'端的核苷酸环状结构第四区域设为通用反向引物区，其Tm值接近特异性正向引物或略高于2-5°C，靠近3'端的核苷酸环状结构第三区域设为通用探针区，探针区的GC含量一般大于70%，保证探针的长度不超过20bp且Tm值高于特异性正向引物的Tm值3-10°C，第三区域与第四区域之间应至少间隔3bp以上；
[0014]优选，所述的茎环反转录引物，其3'端和5'端分别有一段互补配对的序列长度15-20个核苷酸，并且3'端还有一段6-8个核苷酸的单链结构，该单链与成熟的靶miR特异性互补配对。
[0015]优选，所述通用探针区和通用反向引物区序列的Tm值接近或一致，并大于茎环引物内部双链Tm值2-5 °C。
[0016]作为优选，所述的特异性正向引物，其Tm值小于通用探针和通用反向引物Tm值2-5。。。
[0017]作为优选，所述的通用反向引物，其序列与茎环反转录引物的通用反向引物区序
列一致。
[0018]作为优选，所述的通用探针，其序列与茎环反转录引物的通用探针区序列一致。
[0019]本发明解决上述另一个技术问题所采用的技术方案是:[0020]一种上述引物扩增短链RNA的方法，其特征在于:
[0021]茎环反转录引物在合适的温度和反转录酶的作用下与靶miRNA的3'端特异性结合，并反转录成cDNA第一链；
[0022]特异性正向引物3'端由祀miR 5'端的10_18个碱基决定,其5'端的尾部序列可根据反应Tm值随机构成，通用反向引物由茎环引物的通用反向引物区序列构成，通用探针由茎环引物的通用探针区序列构成；
[0023]经过充分预变性后，当退火温度达到特异性正向引物特异性序列的Tm值时，特异性正向引物与cDNA第一链的3'端特异性结合，并在DNA合成酶的作用下延伸合成cDNA第二链；
[0024]再变性后，cDNA第二链与cDNA第一链6解链成单链，当退火温度达到通用反向引物和通用探针Tm值时，通用反向引物和通用探针与cDNA第二链配对结合，在DNA合成酶的作用下通用反向引物以cDNA第二链为模板延伸形成cDNA第二链的互补链，同时当延伸到通用探针时，通用探针被水解，通用探针两端的荧光基团和淬灭基团分开，荧光基团发出荧光，实现定量检测。
[0025]优选，所述茎环反转录引物其3'端和5'端分别有一段互补配对的序列长度15-20个核苷酸，该互补双链的Tm值应大于反转录最适温度2-5°C。
[0026]优选，所述通用探针区和通用反向引物区序列的Tm值接近或一致，并大于茎环引物内部双链Tm值2-5 °C。
[0027]最后，所述cDNA第二链的合成的退火温度为60_65°C，PCR扩增循环的退火温度为65-70。。。
[0028]本发明的引物所使用的`核苷酸可以是DNA，RNA, LNA (锁核酸)，或PNA (肽核酸)，或任何非自然核苷酸组成。
[0029]与现有技术相比，本发明的优点在于:
[0030]设计简单:茎环引物设计时没有太多的要求，只要茎环引物内部双链区Tm值高于反转录Tm值2-5°C，低于PCR扩增Tm值2_5°C。任何设计过PCR引物的人员均可以设计。
[0031]无引物二聚体产生:在反转录的过程中，由于反转录酶的最适温度低于茎环引物内部双链的Tm值2-5°C，引物内双链不会打开，呈茎环结构，不会与另一条引物形成双链，因此就不会扩增出引物二聚体。
[0032]特异性高:由于成熟miR是一类全长为18_25nt的单链小分子非编码RNA，是由茎环结构的转录前体(包括pr1-miRNA约1000bp、pre_miRNA约60_70bp)加工而成，因此,生物体内同时存在成熟miR、pr1-miRNA和pre-miRNA。在反转录时，茎环引物的内部双链的作用使得引物呈茎环结构，由于空间位组的关系茎环引物的3'端6-8个特异性碱基不能与pr1-miRNA和pre-miRNA顺利结合,只会特异地与成熟miR的3'端形成互补结合,实现转录，从而特异性地转录了成熟miR而不受pr1-miRNA和pre-miRNA的影响。
[0033]适用范围广:对于短小的RNA (甚至DNA)尤其是长度只有18_25nt的成熟miR，无论来自哪一种物种，或是非自然的短小核酸都有很好的适用性。
[0034]合成简单、成本低:无需任何特殊的仪器，只需要普通的DNA合成仪就可以完成。并且可以使用通用的反向引物和探针，可以大大减低合成成本。【专利附图】
【附图说明】
[0035]图1茎环引物及其反应原理示意图；
[0036]图2 cDNA第二链的合成与cDNA的PCR扩增示意图；
[0037]图3a、3b茎环RT引物用于实时PCR检测的特异性和有效性的示意图。
【具体实施方式】[0038]茎环特异性反转录引物的构成及与靶miR反应
[0039]本发明的莖环引物为一段寡核苷酸，其5'端核苷酸序列是固定的,形成一个核苷酸茎和核苷酸环的结构，其3'端连接一段核苷酸与成熟的靶miR3'端特异性互补。在核苷酸环的3'端含一段GC含量达70%以上的序列，称为通用探针区；5'端的序列为通用反向引物区。在一定的条件下，比如酸性、碱性或高温条件下，引物内部双链被打开，茎环结构消失，成线性结构，见图1。
[0040]根据图1，茎环引物由5段不同长度的寡核苷酸组成。3'端的6_8bp组成第一区域I与miR的3'端形成特异性互补，决定转录的特异性。第二区域2和第五区域5互补结合，形成引物内部双链结构，其Tm值应高于反转录最适温度2-5°C，在反转录的过程中始终保持双链形式。靠近核苷酸环状结构5'端的第四区域4设为通用反向引物区，其Tm值接近特异性正向引物或略高于3-10°C。靠近核苷酸环状结构3'端的第三区域3设为通用探针区，探针区的GC含量一般大于70%，保证探针的长度不超过20bp且Tm值高于特异性正向引物的Tm值3-10°C。第三区域3与第四区域4之间应至少间隔3bp以上。特异性反转录引物在合适的温度和反转录酶的作用下与靶miR的3'端特异性结合，并反转录成cDNA第一链。
[0041 ] cDNA第一链的特异性扩增(合成cDNA第二链)
[0042]特异性正向引物长约24-28个核苷酸，在3'端的10_18个核苷酸与相应的miR互补，而剩余的10-15个核苷酸的Tm值大于42°C。探针由核苷酸环的通用探针区20个核苷酸构成。通用反向引物为23个核苷酸，由茎环引物5'端第8-30位核苷酸组成，见图2。
[0043]根据图2，特异性正向引物由3'端的特异性序列7和5'端的尾部序列8构成，通用反向引物10由茎环引物的通用反向引物区的序列构成，通用探针11由茎环引物的通用探针区3的序列构成。经过充分预变性后，当退火温度达到特异性正向引物特异性序列7的Tm值时，特异性正向引物与cDNA第一链6的3'端特异性结合，并在DNA合成酶的作用下延伸合成cDNA第二链9 ;再变性后，cDNA第二链9与cDNA第一链6解链成单链，当退火温度达到通用反向引物10和通用探针IlTm值时，通用反向引物10和通用探针11与cDNA第二链9配对结合，在DNA合成酶的作用下通用反向引物10以cDNA第二链9为模板延伸形成9的互补链，同时当延伸到通用探针11时，通用探针11被水解，通用探针两端的荧光基团和淬灭基团分开，荧光基团发出荧光，实现定量检测。
[0044]实施例1:茎环RT引物结合探针用于实时PCR定量检测hsa-miR_30d
[0045]为考察茎环引物应用在实时PCR检测时的特异性和有效性，PCR模板分别为前体hsa-mir_30d
[0046](5'GUUGUUGUAAACAUCCCCGACUGGAAGCUGUAAGACACAGCUAAGCUUUCAGUCAGAUGUUUGCUGCUAC 3'带下划线的碱基为其成熟体的序列)和成熟hsa-miR-30d(5'UGUAAACAUCCCCGACUGGAAG3')的标准RNA样品、及一系列稀释的hsa_miR-30d标准cDNA样品。RT反应的体系总体积为 15μ 1，包括 1.5μ I 10Xbuffer，50U/y I 逆转录酶 1.Ομ 1，IOOmM dNTP 0.15μ I,20U/y I RNA 抑制剂0.19 μ 1，1μΜ RT 引物 3μ 1，0.01μΜ 模板 RNA 5 μ 1，DEPC 水 4.16 μ I。反转录PCR反应在BIO-RAD MyCycler定性PCR仪上进行。反应条件为:16°C 30min,42°C30min，85°C 5min，4°C^。实时 PCR 反应体系总体积为 20 μ 1，包括 Universal PCRMasterMix 10μ 1，10μΜ的正、反向引物及探针各0.5μ 1，102、103、104、105、106倍稀释的cDNA第一链模板1.5 μ 1，DEPC水7.0 μ I。实时PCR反应在AB 7500实时PCR仪上进行。反应条件为 95°C 10min,64°C 2min ；93°C 15s，69°C 40s (检测 FAM 荧光信号)，共 40 个循环。
[0047]茎环RT引物为:
[0048]5' ^tcgtatccagaggtcaiI cgaggtgctcgtagtcggagcgtccctgcgaggc
TIiTGACCTCTGGATACGACt cttccagt 3'方框中的碱基为茎环引物内部双链部分，靠近5'端带下划线的碱基为通用反向引物序列区，3'端带下划线的碱基为通用探针序列区，小写字体的碱基为与祀has-miR_30d 3'端特异性配对的碱基。
[0049]特异性正向引物为:TCAGCTTGTAAACATCCCCGACTGG,下划线的碱基为与靶has-miR-30d的cDNA第一链3'端特异性互补配对的碱基。
[0050]通用反向引物为:CCAGAGGTCATCGAGGTGCTCGT，通用探针为FAM-CGGAGCGTCCCTGCGAGGCT-TAMRA，均与 cDNA 第二链配对结合。
[0051]图3a显示茎环引物用于检测前体miRNA与成熟miR的特异性，对成熟miR的检测效果非常好(曲线12)，而前体miRNA则不能检测出(曲线13);图3b显示茎环引物用于实时RT-PCR检测的有效性。初始的靶浓度在稀释物最浓时的曲线14，曲线15、16、17、18分别表示当模板被连续10倍稀释4个梯度后的荧光曲线。曲线19说明无靶(水)的空白对照。
[0052]序列表
[0053]〈110〉刘晓光
[0054]〈120〉一种用于扩增短链RNA的引物及其相关方法
[0055]<160>6
[0056]<210>1
[0057]<211>70
[0058]<212>RNA
[0059]〈213〉人工序列
[0060]〈400〉I
[0061]gyygyygyaa acayccccga cyggaagcyg yaagacacag cyaagcyyyc agycagaygy
[0062]yygcygcyac70
[0063]<210>2
[0064]<211>22
[0065]<212>RNA
[0066]〈213〉人工序列
[0067]<400>2
[0068]ygyaaacayc cccgacygga ag22[0069]<210>3
[0070]<211>79
[0071]<212>DNA
[0072]〈213〉人工序列
[0073]<400>3
[0074]gtcgtatcca gaggtcatcg aggtgctcgt agtcggagcg tccctgcgag gctatgacct
[0075]ctggatacga ccttccagt79
[0076]<210>4
[0077]<211>25
[0078]<212>DNA
[0079]〈213〉人工序列
[0080]<400>4
[0081]tcagcttgta aacatccccg actgg25
[0082]<210>5`[0083]<211>23
[0084]<212>DNA
[0085]〈213〉人工序列
[0086]<400>5
[0087]ccagaggtca tcgaggtgct Cgt23
[0088]<210>6
[0089]<211>20
[0090]<212>DNA
[0091]〈213〉人工序列
[0092]<400>6`
[0093]cggagcgtcc ctgcgaggct20
【权利要求】
1.一种用于扩增短链RNA的引物，其引物共4条，分别为茎环反转录引物、特异性正向引物、通用反向引物和通用探针，其特征是:茎环反转录引物由5段不同长度的寡核苷酸组成，3'端的6-8bp组成第一区域与靶miR的3'端形成特异性互补，决定转录的特异性，第二区域(2)和第五区域(5)互补结合，形成引物内部双链结构，其Tm值应高于反转录最适温度2_5°C，在反转录的过程中始终保持双链形式，靠近核苷酸环状结构5'端的第四区域(4)设为通用反向引物区，其Tm值接近特异性正向引物或略高于3-10°C，靠近核苷酸环状结构3'端的第三区域(3)设为通用探针区，探针区的GC含量一般大于70%，保证探针的长度不超过20bp且Tm值高于特异性正向引物的Tm值3-10°C，第三区域(3)与第四区域(4)之间应至少间隔3bp以上。
2.如权利要求1所述的一种用于扩增短链RNA的引物，其特征在于:所述的茎环反转录引物，其3'端和5'端分别有一段互补配对的序列长度15-20个核苷酸，并且3'端还有一段6-8个核苷酸的单链结构，该单链与成熟的靶miR特异性互补配对。
3.如权利要求1所述的一种用于扩增短链RNA的引物，其特征在于:所述通用探针区和通用反向引物区序列的Tm值接近或一致，并大于茎环引物内部双链Tm值2-5 °C。
4.如权利要求1所述的一种用于扩增短链RNA的引物，其特征在于:所述的特异性正向引物，其Tm值小于通用探针和通用反向引物Tm值3-10°C。
5.如权利要求1所述的一种用于扩增短链RNA的引物，其特征在于:所述的通用反向引物，其序列与茎环反转录引物的通用反向引物区序列一致。
6.如权利要求1所述的一种用于扩增短链RNA的引物，其特征在于:所述的通用探针，其序列与茎环反转录引物的通用探针区序列一致。
7.一种采用权利1-6的任意一种引物扩增短链RNA的方法，其特征在于:` 茎环反转录引物在合适的温度和反转录酶的作用下与靶miR的3'端特异性结合，并反转录成cDNA第一链； 特异性正向引物由3'端的特异性序列(7)和5'端的尾部序列(8)构成，通用反向引物由茎环引物的通用反向引物区序列构成，通用探针由茎环引物的通用探针区序列构成； 经过充分预变性后，当退火温度达到特异性正向引物特异性序列(7)的Tm值时，特异性正向引物与cDNA第一链(6 )的3'端特异性结合，并在DNA合成酶的作用下延伸合成cDNA第二链(9)； 再变性后，cDNA第二链9与cDNA第一链6解链成单链，当退火温度达到通用反向引物和通用探针Tm值时，通用反向引物和通用探针与cDNA第二链(9 )配对结合，在DNA合成酶的作用下通用反向引物以cDNA第二链(9 )为模板延伸形成cDNA第二链(9 )的互补链，同时当延伸到通用探针时，通用探针被水解，通用探针两端的荧光基团和淬灭基团分开，荧光基团发出荧光，实现定量检测。
8.如权利要求7所述扩增短链RNA的方法，其特征在于所述茎环反转录引物其3'端和5'端分别有一段互补配对的序列长度15-20个核苷酸，该互补双链的Tm值应大于反转录最适温度2-5 °C。
9.如权利要求7所述扩增短链RNA的方法，其特征在于所述通用探针区和通用反向引物区序列的Tm值接近或一致，并大于茎环引物内部双链Tm值2-5 °C。
10.如权利要求7所述的扩增短链RNA的方法，其特征在于:所述cDNA第二链的合成的退火温度为60-65°C，PCR扩增循环的退火温度为65-70°C。
【文档编号】C12Q1/68GK103509789SQ201210217137
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2012年6月26日 优先权日:2012年6月26日
【发明者】刘晓光 申请人:刘晓光