专利名称：一种构建辅酶氧化酶基因与脱氢酶类基因融合的方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种基因工程、生物催化与生物转化，尤其是涉及ー种构建辅酶氧化酶基因与脱氢酶类基因融合的方法和应用。
背景技术：
辅酶氧化酶是ー类能催化辅酶氧化，将电子从辅酶传给H2O2或H2O的酶类，实现了氧化型辅酶的再生，调节细胞内还原型辅酶和氧化性辅酶的水平，从而对细胞内代谢流向的控制与能量平衡发挥着不可替代的作用。迄今为止，已经有多种酶被研究用来转化再生NAD+:如，谷氨酸盐脱氢酶(GluDH)、乳酸脱氢酶(LDH)、こ醇脱氢酶(ADH)、NADH氧化酶(NOX)0而NADH氧化酶由于以O2为底物，不需要添加新的底物；没有副产物产生，且终产 物水不会对与之偶联的酶产生抑制；产物容易分离这些优点而被广泛应用，其主要生理能
(I)维持细胞内NADH/NAD+平衡，调节细胞代谢过程。胞内氧化还原水平是维持细胞生长和代谢的基本必要条件，而细胞内氧化还原水平极大地依赖于胞内两种嘧啶核苷酸系统，即NADH/NAD+和NADPH/NADP+浓度的比率。(2)作为细胞内氧代谢酶，清除细胞内氧毒性。研究表明氧气本身不会对细胞产生影响，然而在细胞代谢过程中形成的含氧中间物(如02、0Η_、Η202 等)会对细胞产生氧毒性(Fridovich I, et al. Biology, 1998，201:1203-1209)。细菌中NOX的存在使这些具有氧毒害作用的中间体维持在低水平状态,从而起到了保护细胞免遭氧毒害的作用。(3)发挥氧传感器作用。脱氢酶是ー类催化物质氧化还原反应的酶，天然受体是NAD+或NADP+，脱氢酶的底物经这类脱氢酶的催化使NAD (P) +还原生成NAD (P)H0甘油脱氢酶(⑶H)作为其中一种常见的依赖辅酶的氧化还原酶。GDH主要分为三种类型，其中有ー种是依赖NAD+的⑶H (EC1. I. I. 6)，能将甘油转化为DHA，DHA进ー步磷酸化，进入糖酵解途径，作为碳源为微生物生长提供ATP和NADH，在这个过程中伴随着NAD+还原生成NADH，这种GDH主要存在于各种细囷中，如 Bacillus substilis, Aerobacter areogenes, Eschericnia coli 和cellulomonassp.等;另ー种为依赖 NADP+ 的 GDH (EC1. I. I. 72 和 ECl. I. I. 56)，它将甘油氧化为DHA或甘油醛，期间也伴随着NADP+还原成NADPH，这种⑶H主要存在于霉菌和动物组织中。辅酶是一类可以辅助酶蛋白催化反应的有机小分子(Wagner, et al. ISBN, 1975,0-88275-258-8)，能与酶蛋白特异性结合，它是特定酶活性发挥所必要的。由于辅酶在酶催化反应中其化学组分发生了变化，因此可以认为辅酶是ー种特殊的底物或者称为“第二底物”。其中的辅酶I[NAD(H)]和辅酶II [NADP(H)]是氧化还原酶的最主要辅酶。辅酶I即烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,简称为NAD或NAD+,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸由一分子烟酰胺核苷酸(NMN)和一分子腺嘌呤二核苷酸联结而成，是氧化还原酶的辅酶，在生物氧化还原系统中起着氢和电子传递作用，还原形式NADH，它出现在细胞很多新陈代谢反应中。NAD+在氧化途径中是电子受体，而NADH在还原途径是电子供体。烟酰胺核苷酸(NMN)上吡啶环的C-4位置是辅酶I的反应中心，能接受或给出氢负离子，而分子中的腺嘌呤部分不直接參与氧化还原过程(黎高翔，生物工程学报，1985，I (4) :1)氢负离子含两个电子，辅酶在脱氢酶反应起着转移氢负离子(即两个电子)的作用。NAD+辅助脱氢酶蛋白作用，它在糖酵解、糖异生、三羧酸循环和呼吸链中发挥着不可替代的作用。中间产物会将脱下的氢递给NAD+，使之成为NADH。大部分氧化还原酶发挥催化作用的时候需要烟酰型辅酶[NAD(P)+，NAD(P)H]的參与，它在酶促反应中与酶蛋白结合，并作为氧化剂或还原剂直接參与反应。而NAD(P) +和NAD(P)H的价格昂贵，通常比酶促反应所得产物要贵得多。因此，从技术经济性的角度来看，很有必要对辅酶进行再生并循环使用。此外，辅酶再生能够使产物的分离简化，并有利于酶促反应向正反应方向移动。由于辅酶的再生对于维持酶反应体系的稳定是必要的，因此，辅酶的保留和再生成为酶工程研究中的ー个重要课题。近些年来，为了解决辅酶NAD+和 NADH再生这ー问题，提出了一系列包括化学法、电化学法、光化学、酶法等的方法，其中尤以酶法再生系统受到广泛重视。原因主要是(1)化学法缺乏特异性，钝化辅酶，化学试剂污染产物导致分离困难，酶的稳定性也受到反应介质影响，已少有研究；(2)电化学法再生效率低，有时还需要一些电子介体參与，其选择性差(吕陈秋，姜忠义，王姣等，有机化学，2004,24(11): 1366-1379)，辅因子易聚合，电极远处的酶无法发挥催化作用；(3)光化学法虽然廉价且洁净，可是需要光敏剂、电子媒介物、电子供体，至今效率低，体系复杂；由于酶法再生选择性好，再生效率高，所以受到广泛关注。不同的酶或细胞參与的各个再生体系都有其优缺点，基于酶或细胞的稳定性及活性、底物和产物对酶或细胞的影响程度作为选择的标准。迄今为止，fomate/FDH再生NADH，已达到エ业技术水平，变异的FDH也能够有效地再生NADPH。同时，利用NADH氧化酶再生NAD+由于操作简单、产物容易分离也具有广阔应用前景。融合酶因为融合了两种酶，而这两种酶同时能达到NAD+和NADH的再生，这使得两种酶在物理距离上缩短了，同时促进了转移反应的反应速率。有科学研究证明融合酶确实能提高产率。目前有将葡聚糖蔗糖酶和葡聚糖酶融合一起在大肠杆菌中表达来生产异麦芽寡糖，和単一的酶相比，其葡聚糖蔗糖酶的酶活和葡聚糖酶的酶活分别增长了
I.5倍和I倍，并且产率也比原来提高了 30倍(Seo, H. S.，Y. J. Koo, et al. Applied andenvironmental microbiology,2000,66(6):2484-2490)。
发明内容
本发明的目的在于针对由于脱氢酶类催化底物转化为产物时辅因子的不断消耗而导致产物产率下降等问题，提供ー种构建辅酶氧化酶基因与脱氢酶类基因融合的方法和应用。所述构建辅酶氧化酶基因与脱氢酶类基因融合的方法包括以下步骤I)产融合酶，具体方法为将构建好原核表达菌株BL21-pET32a-gdh-nox接种于LB培养基中进行37°C活化12h，按1%接种量转接至新的200mL培养基中，当0D600达0. 6 0. 8时，加入终浓度为ImM IPTG进行30°C诱导4h，用pH 7. O磷酸钾缓冲液洗涤菌体2次，离心收集菌体，并测定各自酶活性；NADH氧化酶(NOX)与甘油脱氢酶(GDH)測定方法如下超声破碎将洗涤后的菌体悬浮在缓冲液中，超声破碎功能300W，超声时间4min，随后在4°C下12000rpm离心lOmin，去除细胞碎片，所得上清即得粗酶液；NADH氧化酶(NOX)反应体系90 μ L pH 7. O磷酸钾缓冲液，IOyL粗酶液，终浓度为O. 2mM NADH，在340nm每隔6s读取一点，时间为Imin ;所述NADH氧化酶来源于短乳杆菌(Lactocbacillus brevisATCC 367,来源于中国科学院微生物研究所)；甘油脱氢酶(GDH)反应体系30.0mmol/L(NH4) 2S04、0. 2mol/LL 甘油、2. Ommol/LNAD+、I. O μ mo I/L Fe (NH4) 2 (SO4) 2、0. lmol/L 碳酸钾缓冲溶液(pH 12. O)，反应液的总体积为200 μし在340nm每隔6s读取一点，时间为Imin ;所述甘油脱氢酶(⑶H)来源于克雷柏菌(Klebsiella pneumoniae DSM 2026)；所述NADH氧化酶基因与脱氢酶类基因融合；
2)全细胞转化将离心收集到的重组表达菌体，重悬在100 200g/L的甘油溶液中，于三角瓶中转化，温度25°C，转速200rpm，转化时间为8 10h，用ニ苯胺显色法测定目的产物ニ羟基丙
酮得率。所述辅酶氧化酶(即NADH氧化酶，简称Ν0Χ)来源于短乳杆菌(LactocbacillusbrevisATCC 367，来源于中国科学院微生物研究所)基因与脱氢酶类基因融合，在制备由脱氢酶类催化合成目的产物中的应用。本发明运用重叠延伸PCR技木，将辅酶氧化酶基因与甘油脱氢酶基因融合在一起，形成ー个开放阅读框，并构建原核表达系统BL21-pET32a-gdh-noX。利用全细胞催化技术，合成目的产物。本发明的有益效果本发明利用基因融合技术，克服了脱氢酶类在催化反应时由于辅因子的不断消耗而带来目的产物得率下降的难点，从而大大提高目的产物得率，而且同时利用全细胞催化技木，稳定性好，也可使目的产物易于分离纯化，降低エ业生产成本。
图I为辅酶再生酶(NOX)基因与脱氢酶(⑶H)基因PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳。SI为NOX基因PCR产物，S2、S3为⑶H基因PCR产物，M为DNA标准。图2为表达菌株中融合酶基因的BamH I、Xho I双酶切鉴定結果。SOI、S02均为pET32a-gdh-nox双酶切电泳结果，较小带为gdh-nox在2000-3000bp,较大带为pET32a酶切后载体，M为DNA标准。图3为脱氢酶类催化反应时辅酶自我再生示意图。融合酶在催化底物转化为产物的同时，氧化型辅酶NAD+也在不断消耗。由于融合酶同时具有NADH氧化酶功能，能够实现NAD+的再生，从而使得由融合酶催化的反应得以持续进行。
具体实施例方式实施例I基因组采用东盛生物科技有限公司基因组提取试剂盒。取I. 2mL处于对数生长期的菌液，置于1.5mL离心管中，12000rpm离心Imin ;向收集到菌体中加入180yL缓冲液(pH8. 020mMTris 2mM EDTA, I. 2%Ttrton 100)和终浓度为 20mg/mL 的溶菌酶，37°C振荡混匀30min ;加入20 μ L蛋白酶K溶液，55°C水浴30min ;加入裂解液MS，65°C水浴lOmin。加入220 μ L无水こ醇混勻，颠倒混勻，转移至纯化柱中，12000rpm离心Imin ;分别用蛋白液和漂洗液洗涤纯化柱；加60 μ L去离子水洗脱，即得Lactobacillus brevisATCC 367基因组DNA。用同样方法可得Klebsiellapneumoniae DSM 2026 基因组 DNA。
实施例2引物设计为扩增上述两种酶基因，分别设计如下两对引物Pl CGGGATCCATGCTAAAAGTTATTCAATCTCC,划线部分为 BamHI 酶切位点；P2 :CCAACAACTGTGACTTTCATACGCGCCAGCCACTGCTGG。P3 CCAGCAGTGGCTGGCGCGTATGAAAGTCACAGTTGTTGG ；P4 :CCGCTCGAGAGCGTTAACTGATTGGG,划线部分为 Xho I 酶切位点。实施例3⑶H与NOX基因PCR扩增弓丨物P1、P2于扩增⑶H基因，P3、P4用于扩增NOX基因，扩增反应体系如表I:表I
权利要求
1.ー种构建辅酶氧化酶基因与脱氢酶类基因融合的方法，其特征在于包括以下步骤 1)产融合酶，具体方法为将构建好原核表达菌株BL21-pET32a-gdh-nOX接种于LB培养基中进行37°C活化12h，按1%接种量转接至新的200mL培养基中，当0D600达O. 6 O. 8时，加入终浓度为ImM IPTG进行30°C诱导4h，用pH 7. O磷酸钾缓冲液洗涤菌体2次，离心收集菌体，并测定各自酶活性；NADH氧化酶与甘油脱氢酶測定方法如下 超声破碎将洗涤后的菌体悬浮在缓冲液中，超声破碎功能300W，超声时间4min，随后在4°C下12000rpm离心lOmin，去除细胞碎片，所得上清即得粗酶液； NADH氧化酶反应体系90 μ L pH 7. O磷酸钾缓冲液，10 μ L粗酶液，终浓度为O. 2mMNADH,在340nm每隔6s读取一点，时间为Imin ;所述NADH氧化酶来源于短乳杆菌(Lactocbacillus brevis ATCC 367); 甘油脱氢酶反应体系30. Ommol/L (NH4) 2S04、0. 2mol/LL 甘油、2. Ommo I/L NAD+、1.0ymol/L Fe (NH4)2(SO4)2、0· lmol/L碳酸钾缓冲溶液，反应液的总体积为200 μ L0在340nm姆隔6s读取一点，时间为Imin ;所述甘油脱氢酶来源于克雷柏菌(Klebsiellapneumoniae DSM2026)； 所述NADH氧化酶基因与脱氢酶类基因融合； 2)全细胞转化 将离心收集到的重组表达菌体，重悬在100 200g/L的甘油溶液中，于三角瓶中转化，温度25°C，转速200rpm，转化时间为8 10h，用ニ苯胺显色法测定目的产物ニ羟基丙酮得率。
2.辅酶氧化酶基因与脱氢酶类基因融合，在制备由脱氢酶类催化合成目的产物中的应用。
全文摘要
一种构建辅酶氧化酶基因与脱氢酶类基因融合的方法和应用，涉及一种基因工程、生物催化与生物转化。运用重叠延伸PCR技术，将辅酶氧化酶基因与甘油脱氢酶基因融合在一起，形成一个开放阅读框，并构建原核表达系统BL21-pET32a-gdh-nox。利用全细胞催化技术，合成目的产物。所述辅酶氧化酶基因与脱氢酶类基因融合，在制备由脱氢酶类催化合成目的产物中的应用。利用基因融合技术，克服了脱氢酶类在催化反应时由于辅因子的不断消耗而带来目的产物得率下降的难点，从而大大提高目的产物得率，而且同时利用全细胞催化技术，稳定性好，也可使目的产物易于分离纯化，降低工业生产成本。
文档编号C12N9/04GK102732488SQ20121022069
公开日2012年10月17日 申请日期2012年6月28日 优先权日2012年6月28日
发明者周强, 方柏山, 王静 申请人:厦门大学