专利名称：产低温乳糖酶的拉恩氏菌筛选及培养方法
技术领域：
本发明涉及一种从新疆天山冻土中分离得到的拉恩氏菌R3 (Rahnella sp. R3);本发明涉及该拉恩氏菌R3 (Rahnella sp. R3)的筛选及培养方法。
背景技术：
乳糖酶(β-D-半乳糖苷水解酶，EC3. 2. I. 23)，可来源于植物、动物和微生物，能够催化乳糖中β_半乳糖苷键水解为葡萄糖和半乳糖。乳糖是牛乳中最主要的碳水化合物，含量约为4. 5% 5.0%。某些人群不能吸收利用乳糖，会引发乳糖不耐症。目前，解决乳糖不耐症的最佳方法是用乳糖酶水解乳糖来生产低乳糖或者无乳糖乳制品。现在商业化的乳糖酶大多是常温型的，酶的最适反应温度是37°C或者更高，在低温下催化活性很低。由于乳品加工大部分操作都是在低温(4°C左右)进行，因此在乳品加工采用常温型或耐热型乳糖酶水解乳糖并不合适，而低温乳糖酶在低温有较高活性，能在低温下有效水解牛乳中 的乳糖，因此具有很好的应用前景。目前国内外报道分离筛选的产低温乳糖酶菌株主要来自于极地和深海，多数为细菌，少数为酵母。天山冻土属我国高海拔高山常年冻土类型，在这种冻土环境中微生物产生了一系列适应低温、寡营养、强辐射、冻融等极端因子的分子机制，为冻土微生物生理生化多样性提供了可能。
发明内容
本发明的目的是筛选产低温乳糖酶且酶活较高的菌株，经鉴定，分类命名为拉恩氏菌R3 (Rahnella sp. R3)，于2012年6月26日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址中国.武汉.武汉大学，，保藏编号CCTCC NO M 2012250，采用单因素实验及正交实验的方法进行该菌株的发酵条件优化，获得最优的培养基及培养条件。I.筛选方法(I)初筛吸取富集后的培养液用倍比稀释法制不同的稀释度移入初筛平板中，涂匀，15°C培养，筛选蓝色菌落，分离纯化，斜面保存。(2)复筛选取上限温度为40°C，即在该温度不生长的菌株为低温菌，选取此菌为试验菌株。活化斜面保藏试验菌株，转接发酵培养基于15°C进行摇瓶培养(50mL/250mL)48h。提取粗酶液，测定15°C下水解活力，选取活性较高菌R3为试验菌株。2.发酵条件优化(I)培养基组成对菌体产酶的影响选取蛋白胨、酵母浸膏、乳糖、氯化钠4个因子，采用4因素3水平的正交表L16(34)设计实验，考察不同培养基对菌体产酶的影响。根据极差分析(见表I)，产酶影响因子排序为乳糖>蛋白胨>氯化钠>酵母膏，最优组合为A3B3C3Dp按照最优组合的培养基进行实验，测得发酵液酶活为5. 84U/mL，高于表中的任一值。
表I发酵培养基组成正交试验设计与结果
权利要求
1.一种产低温乳糖酶的拉恩氏菌筛选方法，包括以下步骤 (1)初筛吸取富集后的培养液用倍比稀释法制不同的稀释度移入初筛平板中，涂匀，15°C培养，筛选蓝色菌落，分离纯化，斜面保存。
(2)复筛选取上限温度为40°C不生长的菌株为试验菌株。活化斜面保藏试验菌株，转接发酵培养基于15°C进行摇瓶培养(50mL/250mL)48h。提取粗酶液，测定15°C下水解活力，选取高酶活菌株Rahnella sp. R3为产低温乳糖酶的菌株。
2.一种利用产低温乳糖酶的拉恩氏菌制备产酶发酵液的方法，其特征在于 (1)采用入权利I所述的产低温乳糖酶的Rahnellasp. R3为生产菌株； (2)设定最佳发酵工艺乳糖5%，蛋白胨1.5%，酵母浸膏1.0%，氯化钠0.3%，装液量为250mL三角瓶装50mL，培养基初始pH7. O ±O. 2 ;接种量4%，15°C，200r. mirT1发酵32h。
3.权利要求I所述的拉恩氏菌R3(Rahnella sp. R3)菌株具有以下特征 (1)生长特征菌株最适生长温度为15°C;最适生长pH为7 (2)菌体特征革兰氏阴性，短杆菌，长度I.5μπι 2μπι，有荚膜，无芽孢。
(3)菌落特征菌落呈黄色，圆形隆起，质地粘稠，边缘光滑，不透明，易挑取。
(4)生理生化特征发酵D-葡萄糖产酸产气，明胶水解试验显阴性，赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶及精氨酸双水解酶都呈阴性，硝酸盐还原、MR(甲基红)、VP(伏-普二氏试验)呈阳性。可发酵乳糖、麦芽糖、蔗糖、L-鼠李糖、棉籽糖、纤维素糖。
全文摘要
本发明是一种拉恩氏菌R3(Rahnella sp.R3)筛选及培养方法，采用细菌富集培养基(1/4TSB)及以乳糖为底物、X-Gal为显色剂琼脂鉴定平板初筛与发酵酶活测定复筛的方法获得高产低温乳糖酶菌株Rahnella sp.R3。采用单因素实验与正交实验分析获得最佳发酵产酶配方与发酵条件，最终摇瓶发酵水平可达5.92U/mL。
文档编号C12N9/38GK102965287SQ20121022873
公开日2013年3月13日 申请日期2012年7月4日 优先权日2012年7月4日
发明者杨瑞金, 沈莲莲, 华霄 申请人:江南大学