专利名称：用于检测aml-evi1融合基因相对表达量的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属生命科学和生物技术领域，特别是一种基因检测试剂盒，采用探针实时突光定量PCR技术,能够对人类慢性髓细胞性白血病(chronic myelognous leukemia,CML)患者体内AMLl- EVIl融合基因表达水平进行检测，可有效的节约检测时间，提高检测精度。
背景技术：
白血病是一类造血干细胞异常的克隆性恶性疾病。在骨髓和其他造血组织中白血病细胞大量增生积聚并浸润其他器官和组织，同时使正常造血受抑制，临床表现为贫血、出血、感染及各器官浸润症状。根据白血病细胞的成熟程度和自然病程，白血病可分为急性和慢性两大类。急性白血病病情进展迅速，自然病程仅有数周至数月。一般可根据白血病细胞系列归属分为急性髓系白血病(AML)和急性淋巴细胞白血病(ALL)两大类。而慢性白血病常见的有慢性粒细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。由于白血病类型不同，治疗方案及预后亦不尽相同。慢性髓细胞性白血病，简称慢粒(chronic myelognous leukemia , CML),是临床上一种起病及发展相对缓慢的白血病。病程从数月到数年不等，临床上该病可分为3期慢性期、加速期和急变期(CML-BC)，初诊时大部分患者为慢性期，一般在确诊2-5年内由慢性期进展到加速期，最后发展到急变期(CML-BC)，急变后化疗有效率不超过30%，中位生存期1-13个月，预后极差。CML-BC期可涉及所有系的造血细胞，而不同急变类型的预后及治疗原则不尽相同，此时细胞形态学和组织化学难以完全确定急变类型，需辅以免疫分型加以鉴别，结合细胞遗传学和分子生物学检查，有助于急变类型的诊断、治疗和预后的判断。Nueifora等报道的t (3 ;21)中，21号染色体上的AMLl在runt区和转录激活区之间断裂并分别与MDSl和EVIl形成了 AMLl / MDSl和AMLl / EVIl融合基因。在AMLl /EVIl转录本中，AMLl的第5个外显子被连接到EVIl的第2个非翻译外显子，导致了一个长的复合多肽的产生，它包含了 AMLl的runt区和几乎全部EVII。AMLl / EVIl编码一个180kD的融合蛋白，含3个DNA结合区。近年来，许多临床和实验观察都显示，慢粒急变期，除bcr / abl融合基因外，60%-80%还呈现某些新的细胞或分子遗传学改变。其中AMLl /EVIl融合基因也是慢粒急性变的重要机制之一。EVIl与AMLl基因融合产生的AMLl / EVIl融合蛋白具有双重的功能，一方面阻断分化；另一方面则刺激增殖，这分别依赖于AMLl上的结构域和EVIl的第2个锌指结构域。众多报道显示，慢粒急变EVIl阴性的患者中，可能部分患者EVIl基因产生了融合，使用EVIl特异性的引物则检测不出。若使用更敏感的方法同时检测AMLI / EVIl融合基因可能会提高慢粒急性变的预测性。目前临床上已经将AML1-EVI1融合基因作为动态评估患者病情及预后的手段之一。常用的检测技术有荧光原位杂交技术(FISH)、RT-PCR、RQ-PCR等方法。FISH法尽管结果较为直观，但是试验过程繁琐，涉及试剂种类繁多，费时费力，且结果需经验丰富的专业人士来判读，结果判读存在较大的主观性。而单纯RT-PCR法则为终点定量，无法对起始模板量进行准确的估算。此外，由于砷剂及全反式维甲酸的应用，APL治疗效果得到很大的提高，微小残留病是其复发的主要原因，因而急需一种高敏感性、高特异性、高自动化程度、污染控制好的方法来对AMLl-EVI I融合基因mRNA残留进行检测。RQ-PCR米用Taqman探针突光定量技术,综合生物学、酶学和突光化学于一体，从扩增到结果分析均在PCR反应管封闭状态下进行，解决了 PCR产物污染而导致假阳性的问题，同时也提高了敏感度，其结果用拷贝数表示，实现了对PCR产物的准确定量，易于统一标准，与定性PCR技术相比，具有特异度好，灵敏度高，线性关系好，操作简单，自动化程度高、防污染，有较大的线性范围等优点。能够满足AML1-EVI1融合基因mRNA微量残留的检测，被认为是目前首选检测方法，用于评价治疗效果、预测预后。实时荧光定量PCR中常见的方法有SYBR GreenI染料法，双探针杂交法以及Taqman技术等。其中SYBR GreenI由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法以及Taqman法，必须通过观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针法杂交法成本又较为昂贵。因此本研究采用实时荧光PCR技术结合Taqman探针法应用于AMLl-EVII的基因检测
发明内容
鉴于现有技术中检测AMLl- EVIl融合基因的不足，本发明设计了检测内参/目的基因用引物、探针序列，用荧光定量PCR技术检测白血病AMLl- EVIl融合基因相对表达量。通过调整两个基因的引物探针浓度及比例，优化PCR的反应体系和反应条件，开发了一种用于检测白血病AMLl- EVIl融合基因相对表达量的试剂盒。用于检测AMLl- EVIl融合基因相对表达量的试剂盒，包括红细胞裂解液、TRIzol、氯仿、无水乙醇、ReverTra Ace qPCR RT KU、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品，其特征在于
检测体系PCR反应液包括THUNDERBIRD qPCR MIX、检测目的基因用上下游引物AMLl-EVII-F, AMLl-EVI 1-R,探针 AML1-EVII-Probe，检测内参基因 Abl 用引物 abl_F，abl-R,探针 abl-Probe ;其中，
AMLl-EVII-F: GACCATCACTGTCTTCAAMLl-EVI1-R: AGTCTTCGCAGCGATAT
AMLl-EVI1-Probe: FAM-AATCACAGTGGATGGGCCCCGAG-TAMRA
abl-F: GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG
abl-R: ATGATATAGAACGGGGGCTC
abl-Probe: FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA。进一步地，检测用上下游引物和探针的比例优选为AML1-EVI1_F AMLl-EVII-R AMLl-EVIl-Probe 的摩尔比为 2 : 2 : I。参照用上下游引物和探针的比例优选为abl-F abl-R abl-Probe的摩尔比为 2 : 2 : I。所述阳性对照品为含有AML1-EVI1基因的溶液；所述阴性对照品为无AMLl- EVIl基因的溶液。其中的ReverTra Ace qPCR RT Kit为Τ0Υ0Β0公司生产的qPCR用cDNA试剂盒产
品OTHUNDERBIRD qPCR MIX为TOYOBO公司生产的定量PCR试剂，产品规格为QPS-101。
使用本发明的试剂盒，将实时荧光PCR技术结合采用Tapman探针，可以对AMLl-EVIl融合基因的表达水平进行检测，检测精度高，而且操作简单，可降低检测成本，节约检测时间。采用双标准曲线法，通过构建AMLl- EVIl和内参基因abl的标准定量曲线，精确定量样本的内参基因拷贝数和AMLl- EVIl拷贝数，相比于以往的免疫组化方法和现今的ΔΔ CT法，该试剂盒具有精度高，结果便于判读等优点。加之该试剂盒将反应体系所需的引物、探针进行合理配比和优化，使扩增效率和速率等实验条件达到最佳，从而省去了繁琐的条件摸索环节，大大提升了实验效率。该试剂盒经测试特异性好，灵敏度高，操作简便。有助于临床上慢性髓细胞性白血病(chronic myelognous leukemia,CML)患者体内AMLl-EVIl融合基因的微量残留检测，对于及时干预治疗避免血液学复发、调整治疗方案、评价治疗效果、预测预后、预防临床复发都具有重要意义。
图I :AML1-EVI1型阳性结果示意图。图2 :AML1-EVI1型阴性结果示意图。
具体实施例方式实施例I
本发明的用于检测AML1-EVI1融合基因相对表达量的试剂盒，包括
红细胞裂解液；
TRIzol ；
氯仿；
无水乙醇；
检测体系 PCR 反应液ReverTra Ace qPCR RT Kit (TOYOBO 公司);THNDERBIRD ProbeqPCR Mix (2X )、AML1-EVI1 上、下游引物各 0. 8uM,AMLl-EVII 探针 0. 4 uM ；abl 上、下游引物各 O. 8uM、abl-probe (探针)0. 4uM ；
其中AML1-EVI1-F: GACCATCACTGTCTTCA ；
AMLl-EVI1-R: AGTCTTCGCAGCGATAT ；
AMLl-EVI1-Probe: FAM-AATCACAGTGGATGGGCCCCGAG-TAMRA ；abl-F: GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG ；abl-R: ATGATATAGAACGGGGGCTC ；abl-Probe: FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA ；
阳性对照品含AML1-EVI1基因组溶液；阴性对照品不含AML1-EVI1基因组溶液。实施例2
本发明试剂盒的使用方法
(I)抽提血液中的组织RNA:在洁净的I. 5ml的离心管中加入Iml红细胞裂解液，取抗凝血0. 5ml混勻。室温静置IOmin ；5000rpm离心5min,弃上清,收集底部的细胞；再次加入0. 5ml红细胞裂解液，5000rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；向细胞中加入ImlTRIzol，反复吹打直至沉淀完全溶解，室温静止5min ;加入0. 2ml氯仿，震荡均匀；HOOOrpm40C离心lOmin，吸取上清层转移至另一新的离心管中；加入等体积的异丙醇，上下充分混勻，室温静置IOmin ；14000rpm 4°C离心IOmin,弃上清,加入75%乙醇Iml,轻轻上下颠倒洗漆管壁；14000rpm 4°C离心5min,弃乙醇；室温干燥10_15min,加入20ulRNase_free水溶解沉淀。(2)参考TOYOBO公司的Rever Tra Ace qPCR RT Kit试剂盒说明书，将RNA反转为 cDNA。(3)试剂配置按检测人份数配置检测体系PCR反应液各X ul，每人份23ul分装 X=23ul反应液X (8份内参(标准曲线)+8份目的基因(标准曲线)+η份标本+1份阳
性对照+1份阴性对照+1份空白对照)；
(4)加样加入检测体系PCR反应液中2ulcDNA ;阳性对照和阴性对照直接加2ul阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2ul生理盐水或不加任何物质。(5)检测检测在实时荧光PCR仪上进行，可用仪器包括ABI7300，7500 (美国Applied Biosystems 公司)等。反应条件95°C预变性 Imin ;95°C 15s, 58°C 35sec 40 个循环，突光信号于58°C 35 sec时米集。(6)结果判断将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，系统根据标准曲线和CT值自动计算出拷贝数。I)内参阳性时，检测结果才认为有效；
2)阳性判断标准，Ct〈36，为阳性；35 ^ Ct ^ 38，为疑似阳性，需要再次验证；Ct >38，为阴性。实施例3
采用本发明核酸检测试剂盒检测临床标本
取送检的慢性髓细胞性白血病(CML)患者抗凝血标本共80例，按实施例2所述方法提取基因组RNA、配制试剂并检测。每份标本加入检测体系PCR反应液中2ul。同时做阳性，阴性，空白对照，内参基因/目的基因的标准曲线各一份。一台96孔的荧光PCR仪可同时检测38份样品，每个样本2次重复，一份阳性对照，一份阴性对照和一份空白对照。检测时间仅为100分钟。实验结果与特检实验室的报告结果相比较，确定样品检测的准确率。部分阳性结果如下表
权利要求
1.用于检测AMLl-EVIl融合基因相对表达量的试剂盒，包括红细胞裂解液、TRIzol、氯仿、无水乙醇、ReverTra Ace qPCR RT KU、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品，其特征在于 检测体系PCR反应液包括THUNDERBIRD qPCR MIX、检测目的基因用上下游引物AMLl-EVII-F, AMLl-EVI 1-R,探针 AML1-EVII-Probe，检测内参基因 Abl 用引物 abl_F，abl-R,探针 abl-Probe ;其中，AMLl-EVII-F: GACCATCACTGTCTTCAAMLl-EVII-R: AGTCTTCGCAGCGATATAMLl-EVI1-Probe: FAM-AATCACAGTGGATGGGCCCCGAG-TAMRAabI-F: GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG abl-R: ATGATATAGAACGGGGGCTCabl-Probe: FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA。
2.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于AMLl-EVII-F AMLl-EVI I-R AMLl-EVIl-Probe 的摩尔比为 2 : 2 : I。
3.如权利要求I所述的试剂盒,其特征在于abl-F: abl-R : abl-Probe的摩尔比为2: 2 : I0
4.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述阳性对照品为含有AMLl-EVIl基因的溶液；所述阴性对照品为无AMLl- EVIl基因的溶液。
全文摘要
本发明公开了用于检测AML1-EVI1融合基因相对表达量的试剂盒，包括红细胞裂解液、TRIzol、氯仿、无水乙醇、ReverTraAceqPCRRTKit、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品，其特征在于检测体系PCR反应液包括THUNDERBIRDqPCRMIX、检测目的基因用上下游引物AML1-EVI1-F，AML1-EVI1-R，探针AML1-EVI1-Probe，检测内参基因Abl用引物为abl-F，abl-R，探针abl-Probe。本发明试剂盒能够对慢性髓细胞性白血病(chronicmyelognousleukemia，CML)患者体内AML1-EVI1融合基因表达水平进行检测，可有效的节约检测时间，提高检测精度。
文档编号C12Q1/68GK102776282SQ20121023367
公开日2012年11月14日 申请日期2012年7月6日 优先权日2012年7月6日
发明者周晓犊, 徐建成, 王淑一 申请人:武汉艾迪康医学检验所有限公司