专利名称：微生物催化法制备2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺的方法及菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种微生物催化法制备2-氨基-2，3-ニ甲基丁酰胺的方法，以及在生产过程中用到的新菌株。
(ニ)
背景技术：
2-氨基-2，3-ニ甲基丁酰胺,英文名 2-amino_2，3_dimethylbutyamide,外观为白色片状晶体，熔点为84°C，能溶于水和大多数有机溶剤。是咪唑啉酮类超高效除草剂如咪唑 こ烟酸、咪唑喹啉酸和甲氧咪草烟等的通用中间体，市场需求广阔。其中味唑こ烟酸和咪唑喹啉酸曾占据美国大豆除草剂市场主导地位达10年之久；而我国自从1990年大批量进ロ咪唑こ烟酸并在黑龙江省大面积应用以来，用量持续增加。特别是在国内该除草剂产品问世以后，由于其价格低廉，除草效果良好，故而被大范围使用，成为黑龙江与内蒙古地区大豆田除草剂的主导品种。2-氨基-2，3-ニ甲基丁酰胺目前主要通过化学法生产。其生产过程可分为两个部分3_甲基-2-丁酮通过斯特雷克(Strecker)反应得到氨基腈，后者在酸或碱催化下水解
得到产物(见下式)。
NH2NH2O
NaCN 卜H2S°4 ‘ /T^axNH2
NH4ClNH4OH孙晓红等(西北大学学报，1994，24 (3) :227_234)报道了该氨基腈的合成方法，先将氯化铵溶于水后，加入氰化钠和氨水，搅拌均匀后，加少量苄基三こ基氯化铵，滴加甲基异丙基甲酮，搅拌回流4飞小时，用ニ氯甲烷提纯后，得无色透明液体，纯度为95%，收率为90%。Peter J.等(US 6339158)报道了由2_氨基_2，3_ ニ甲基丁腈制备2_氨基-2，3- ニ甲基酰胺的方法，首先加入29. 7ml浓硫酸，慢慢加入11. 8g2_氨基-2，3- ニ甲基丁腈，保证反应体系温度不超过25°C，加热至100°C并在该温度下反应lh，反应结束后冷却，加入85ml浓氨水，过程中控制体系温度不超过75°C，然后用ニ氯甲烷萃取、結晶，最終得到11. 2g2-氨基-2，3-ニ甲基酰胺，收率为81.7%。吕晓东等(辽宁化工，2001，30 (10)455-456)报道将2-氨基-2，3- ニ甲基丁腈在一定的温度下滴加入95%的浓硫酸中，升温，反应数小吋。反应完毕后，冷却至室温，滴加浓氨水中和至弱碱性，加萃取剂，搅拌一定时间，过滤，滤出物用萃取剂洗涤，并将洗液合并入滤液。滤液相分离，有机层蒸出萃取剂，釜底物加入石油醚，冷冻结晶，滤出的固体干燥后得到2-氨基-2，3-ニ甲基酰胺，最终收率为95%，产物纯度达到96%。由上可知，化学法生产2-氨基-2，3-ニ甲基酰胺的主要缺点是反应需要高温、强酸等条件，能耗原料消耗高，产品易受副产物污染，提纯步骤繁琐，周期长，收率低，产生大量含腈污水，不符合环保要求等。腈水合酶(Nitrile Hydratase)是ー种在自然界中广泛存在的微生物酶，它可催化多种腈化合物水解生成酰胺。微生物腈水合酶可广泛地应用于氨基酸、酰胺、羧酸及其衍生物的合成。1980 年，Asano 等(Agricultural and Biological Chemistry,1982,46(5) :1183-1189)首次发现微生物 Rhodocococcus sp. N-774 可降解有毒的 ZJ青，不久即被成功地应用于エ业生产丙烯酰胺。近年来，腈水合酶也被用于制备手性药物，如Gilligan 等(Applied Microbiology and Biotechnology, 1993, 39:720-725)成功地用Rhodocococcus equi TG328腈水合酶和酰胺酶催化外消旋2_苯基丙腈立体选择性水解,生成了非留体类抗炎药S-(+)_2-苯基丙酸。现有的研究表明，腈水合酶催化的反应具有高选择性、高效性、条件温和、环境污染小、成本低、产物光学纯度高等优点，符合原子经济和绿色化学的发展方向，有着化学方法无可比拟的优越性，从而促进了精细化工产品和手性药 物的研制和开发。因此利用腈水合酶的高效性、高选择性和反应条件温和等特点来催化生产2-氨基-2，3- ニ甲基丁酰胺，将可以提高产率和产品质量、降低生产成本和减小环境污染。据报道，a -氨基腈在水溶液中极不稳定，容易自发水解生产HCN和酮(醛)等物质(Engineering in Life Sciences, 2004. 4:547-556)。这些副产物特别是 HCN 是臆水合酶的強烈抑制剂，它通过与腈水合酶活性中心的金属离子Fe2+或Co2+络合而使腈水合酶失活。Nagasawa 等(European Journal of Biochemistry, 1991. 196:581-589)报道，作为生产丙烯酰胺的高效催化剂Rhodococcus rhodochrous Jl生产的腈水合酶,在氰离子浓度为0. OlmM时即酶活损失62%。因此筛选得到耐受氰离子的腈水合酶，将有利于实现连续化生产2-氨基-2，3- ニ甲基丁酰胺，提高产物浓度。
发明内容
为克服上述化学合成法的缺陷，本发明提供了ー种微生物催化水合2-氨基-2，3- ニ甲基丁腈制备2-氨基-2，3- ニ甲基酰胺(ADBA)的方法，及制备过程中所用的新菌株。本发明采用的技术方案是ー种微生物催化法制备2-氨基-2，3- ニ甲基丁酰胺的方法，所述方法包括在以2-氨基-2，3_ ニ甲基丁腈为底物，以庆筌红球菌(Rhodococcus qingshengii) CCTCC No:M2010050发酵产生的腈水合酶为催化剂的反应体系中，于pH6. (TlO. 0、2(T40°C下进行催化水合反应，制得所述的2-氨基-2，3- ニ甲基丁酰胺。所述腈水合酶存在于菌体细胞中，具体制备时，可直接将发酵获得的含菌体细胞的发酵液作为催化剂參与反应，也可以将菌体细胞分离后，作为催化剂參与反应，所述腈水合酶用于催化2-氨基-2，3- ニ甲基丁腈制备2-氨基-2，3- ニ甲基酰胺的反应原理如下列
反应式所示
权利要求
1.ー种微生物催化法制备2-氨基-2，3-ニ甲基丁酰胺的方法，所述方法包括在以2-氨基-2，3_ ニ甲基丁腈为底物，以庆筌红球菌(Rhodococcus qingshengii) CCTCC No:M2010050发酵产生的腈水合酶为催化剂的反应体系中，于pH6. (TlO. 0、2(T40°C下进行催化水合反应，制得所述的2-氨基-2，3- ニ甲基丁酰胺。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于所述反应在水或pH6.(TlO. O的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中进行。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于所述反应体系中底物初始浓度为0.03、. 3M。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于所述腈水合酶来自庆笙红球菌CCTCCNo:M2010050经发酵获得的含酶菌体细胞，所述含酶菌体细胞在反应体系中添加量以含酶细胞湿重计为5 50g/L。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述含酶菌体细胞由如下方法制备得到 (1)将经斜面活化的庆笙红球菌CCTCCNo :M2010050接入种子培养基中，于2(T40°C下培养24 48h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成如下葡萄糖5 20. Og/L，酵母浸出粉 2 8. Og/L，蛋白胨 I 4. Og/L, KH2PO4O. 5 I. 5g/L, K2HPO4O. 5 I. 5g/L, NaClO. 5 3. Og/L,己内酰胺 0. 5 2. Og/L, MgSO4O. 05 0. 2g/L, CoCl2O. 01 0. 05g/L, FeSO4O. 01 0. 05g/L,溶剂为水，pH6. 0 8. 0 ； (2)将种子液以1 10%体积比接入产酶培养基中，于2(T40°C下培养48 96h，培养得到的发酵液经离心或膜分离，得所述含酶菌体细胞；所述产酶培养基终浓度组成如下蔗糖5. (TlO. 0g/L,柠檬酸钠2. 0 5. 0g/L,牛肉膏2. 0 8. 0g/L,酵母粉2. 0 8. 0g/L,氯化钠0. 5 2. 0g/L,磷酸ニ氢钾0. 5 2. 5g/L，氯化钴0. 005 0. 01g/L,氯化铁0. 005 0. 01g/L,氯化锰0. 005 0. 01g/L，诱导剂I. 0 3. 0g/L，溶剂为水，pH6. 0 8. 0 ;所述诱导剂为下列之一:谷氨酸钠、2，2-ニ甲基环丙甲酰胺、己内酰胺、丙烯酰胺、こ酰胺或尿素。
6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于所述方法如下将所述含酶菌体细胞用生理盐水洗涤后，悬浮于水或pH6. (TlO. 0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中，加入底物2-氨基-2，3-ニ甲基丁腈至底物浓度为0. 03^0. 3M，于15 40°C、10(T200rpm下反应l(T60min ;反应结束后，转化液经分离纯化得到所述2-氨基-2，3- ニ甲基丁酰胺。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述分离纯化方法如下反应结束后，取转化液12000rpm离心IOmin,收集上清液；加入粉末活性炭，加热搅拌脱色30min后转入真空抽滤装置抽滤，得到脱色清液；脱色清液转入旋转蒸发仪，在真空度-0. IMpa，水浴加热温度4(T60°C、转速6(Tl00rpm条件下减压蒸发除去底物2-氨基-2，3- ニ甲基丁腈和水，冷却得到2-氨基-2，3- ニ甲基丁酰胺粗品；将2-氨基-2，3- ニ甲基丁酰胺粗品溶于2(T65°C的こ酸こ酷，加入体积为こ酸こ酯体积10%盐析剂正己烧，于0 4°C保温结晶；过滤，取滤渣用正己烧洗漆，干燥得到2-氨基_2，3- ニ甲基丁酰胺晶体。
8.庆筌红球菌(Rhodococcusqingshengii)ZJB_09153,保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No :M2010050，保藏日期2010年3月10日。
全文摘要
本发明公开了一种微生物法生产咪唑啉酮类超高效除草剂中间体2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺的方法及其过程中所用的菌株。本方法以2-氨基-2,3-二甲基丁腈为原料，以通过发酵培养微生物庆笙红球菌(Rhodococcus qingshengii)CCTCC NoM2010050生产的腈水合酶为催化剂生产2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺。本方法反应条件温和，废水排放少，环境友好；产率高，转化时间短，成本低，易于实现工业化生产。
文档编号C12P13/02GK102776253SQ20121023954
公开日2012年11月14日 申请日期2010年6月21日 优先权日2010年6月21日
发明者林志坚, 沈寅初, 郑仁朝, 郑裕国 申请人:浙江工业大学