专利名称：用于检测转基因玉米Bt176转化体特异性序列的引物组、试剂盒及方法
技术领域：
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种用于检测转基因玉米Btl76转化体特异性序列的引物组、试剂盒及方法。
背景技术：
随着转基因生物的迅速发展，其安全性在全球范围内引起激烈的争论与普遍关注。为保障消费者的知情权和选择权，世界上许多国家和地区都制定了相应的法律和法规，加强对进出口转基因产品的管理，这给为转基因生物安全监管提供技术支撑的转基因检测 工作带来更大的挑战。检测转基因产品的方法有很多，主要分为针对外源蛋白质的检测与针对外源核酸的检测两大类。但转基因产品，经过多道程序加工处理，绝大部分蛋白质已经被变性、破坏，检出率较低。所以针对外源核酸的检测更为普遍。转基因产品中转入的外源核酸一般包括启动子、标记基因、目的基因和终止子，针对这些基因进行扩增分析可筛选检测待检样品中的转基因成分。根据检测靶标的不同，转基因产品的检测方法分为筛查法、基因特异性检测法、结构特异性检测法、转化事件特异性检测法4个层次，检测的特异性由低到高。转化事件特异性检测法是针对插入的外源序列与植物基因组连接的边界序列(即转化体特异性序列)进行检测。由于插入位点的唯一性，转化事件特异性检测具有更高的特异性和准确性，不仅可判断待检样品中是否含有转基因成分，而且还可具体鉴定待检样品含有何种转基因品系，因此相比其它3种方法具有更好的特异性。转基因玉米Btl76具有抗鳞翅目尤其是玉米螟等害虫及耐草胺磷除草剂的抗性，自1995年在美国准许无限制种植以来，Btl76玉米已经在许多国家和地区大面积种植并作为食品和饲料广泛应用。目前国内外已建立了多种检测转基因玉米Btl76的普通PCR法、荧光定量PCR法，这些方法都需要特特殊的试剂(如荧光探针)和复杂昂贵的仪器(如PCR仪、real-time PCR仪)，不适于现场的快速检测和基层的普及使用。环介导等温扩增技术(Loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)是由日本荣研化学株式会社Notomi T等于2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法。该技术利用一种具有链置换活性的Bst DNA聚合酶在恒温条件(65°C左右)保温30-60分钟，即可实现核酸的大量扩增。其特点是操作简单、快速、特异性高、成本低廉，故被广大研究者认为是可能替代PCR的新的核酸扩增技术。因此针对转基因玉米Btl76建立一种高特异性、适于大范围推广应用的转化事件特异性检测方法具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种转基因玉米Btl76及其加工品的检测引物组。
本发明的另一个目的在于提供一种转基因玉米Btl76及其加工品的检测试剂盒。本发明的另一个目的在于提供一种转基因玉米Btl76及其加工品的检测方法。本发明所采用的技术方案是
转基因玉米Bt 176及其加工品的检测引物组，包括引物组I和引物组2，其中，引物组I包括外引物 zSSIIb-F3、zSSIIb-B3 和内引物 zSSIIb-FIP、zSSIIb-BIP，序列如下zSSIIb- F3 TGACCGTTAGCAATGGCTAC (SEQ ID N0:1)；zSSIIb- B3 AGCGTCTCGAACGTGTAGT (SEQ ID N0:2)；
zSSIIb-FIP ATGCCCTGCAGCTTCCAGTCGGGGAGCTGAAGACTTCGGAA (SEQ ID NO:3); zSSIIb-BIP CGTGAACGGCATCGACATGAGCTGGTGTAGTCGTCGGAGTG (SEQ ID N0:4)；
弓丨物组2包括外引物Btl76-F3、Btl76-B3和内引物Btl76_FIP、Btl76_BIP，序列如下 Btl76-F3 CGGCTTCAAGCACGGGA (SEQ ID NO:5)；
Btl76-B3 GAGGGAGAGAGAGGGAGC (SEQ ID N0:6)；
Btl76-FIP AGGACCGGACGGGGCAGTACACTGGCATGACGTGGGTT (SEQ ID NO:7);
Btl76- BIP TCTCCTCCATTGATGCACGCCGGGGGAAGGGAGAAACGG (SEQ ID N0:8)。转基因玉米Btl76及其加工品的检测试剂盒，包括(I)上述的引物组I ;(2)引物组2 ; (3) Bst DNA聚合酶；(4) LAMP反应液；(5)染色剂；(6)内对照；(7)阳性对照。弓丨物组I中外引物和内引物的添加摩尔比为1:8;所述引物组2中外引物和内引物的添加摩尔比为1:8。LAMP 反应液，由 O. 2 mol/L Mg2SO4,25 mmol/L dNTPUOXBst buffer,5 mol/L甜菜碱按I :4 :10 20的比例配比而成。染色剂为SYBR Green。内对照为含有玉米内参照基因zSSIIb (SEQ ID N0:9)的重组质粒；阳性对照为含有转基因玉米Btl76转化体特异性序列(SEQ ID NO: 10)的重组质粒。内对照和阳性对照的重组质粒的载体为PMD18-T载体。利用上述试剂盒检测转基因玉米Btl76及其加工品的方法，包括如下步骤
(1)提取纯化待检样品DNA；
(2)LAMP法检测；
Φ LAMP法检测玉米内参照基因zSSIIb :设置样品管(加样品DNA)、内对照(加含有
zSSIIb基因的重组质粒DNA)、空白对照(加灭菌去离子水)，25 μ L反应体系含有引物组I外引物对O. 2 μ mol/L，内引物对I. 6 μ mol/L，Bst DNA聚合酶0. 32U/μ L，LAMP反应液9 μ L，待检样品DNA50ng，用灭菌去离子水补齐到25 μ I。将配制好的反应管混匀后离心，并于65°C反应50min，并在80°C持续IOmin ;反应完毕后，往反应管中加入染色剂，混匀，根据显色结果来判断待检样品中是否含有zSSIIb基因；
LAMP法检测转基因玉米Bt176转化体特异性序列设置样品管(样品DNA)、阳性对
照(含有转基因玉米Btl76转化体特异性序列的重组质粒DNA)、空白对照(灭菌去离子水)，25 μ L反应体系含有引物组2外引物对0.2 μ mol/L，内引物对I. 6 μ mol/L ,Bst DNA聚合酶0. 32U/ μ L，反应液9 μ L，待检样品DNA50ng，用灭菌去离子水补齐到25 μ I。将配制好的反应管混匀后离心，并于65°C反应50min，并在80°C持续IOmin ;反应结束后，往反应管中加入染色剂，混匀，根据显色结果来判断待检样品中是否含有转基因玉米Btl76转化体特异性序列；
(3)结果判断如果步骤(2)中内对照、阳性对照呈阳性，空白对照呈阴性，而样品zSSIIb基因检测呈阳性、转基因玉米Bt 176转化体特异性序列检测呈阳性，则表明待检样品含有转基因玉米Btl76成分。本发明的有益效果在于
I、本发明设计了 2对LAMP引物组，引物组I检测内参照基因zSSIIb，可检出样品中的玉米成分，同时可排除假阴性结果；引物组2检测Btl76的转化体特异性序列，该序列为插入的外源基因与植物基因组连接的边界序列，具有高度特异性，可有效检出Btl76转基因 玉米成分。2、本发明所述的试剂盒自行研制了阳性对照物和内对照物，用于样品检测分析时分别设置了阳性对照、空白对照和内对照，可避免假阳性和假阴性的产生。3、本发明的检测试剂盒是在恒温下进行扩增检测，一台恒温水浴锅就能满足实验要求，不需要特殊的设备，检测成本低；检测结果通过反应液的颜色变化通过肉眼观察即可进行判定，鉴定简便，结果可视化；适用于现场快速检测及基层大样本量的筛查，易于大范围的推广应用。
图I是本发明检测方法的显色结果示意图(1，绿色，阳性；2，橙色，阴性)；
图2是转化体特异性序列的敏感性分析结果(I 2copies/ μ 1,2 20copies/ μ I,3 200copies/μ 1,4 2000copies/μ 1,5 20000copies/μ 1,6 200000copies/μ 1,7 2000000copies/μ I)。图3是特异性分析结果(Α引物组I检测结果1.转基因玉米Btl76，2.非转基因玉米，3.转基因水稻TT51-1，4.转基因油菜RT73，5.转基因甜菜H7_l，6.转基因玉米M0N810，7.抗草甘膦转基因大豆，8.内对照，9.空白对照；B引物组2检测结果1.转基因玉米Btl76，2.非转基因玉米，3.转基因水稻TT51-1，4.转基因油菜RT73，5.转基因甜菜H7-l,6.转基因玉米M0N810，7.抗草甘膦转基因大豆，8.阳性对照，9.空白对照)。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件操作，例如Sambrook等编著的分子克隆实验室手册(New York Cold Spring HarborLaboratory Press, 2001)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例I :转基因玉米Btl76检测试剂盒的研制
本发明的转基因玉米Btl76检测试剂盒由(I) Bst DNA聚合酶；(2)引物组I ;(3)引物组2 ;(4)反应液；(5)染色剂(SYBR Green) ； (6)内对照；(7)阳性对照组成，其中BstDNA聚合酶、反应液、显色液等可由相应公司购买，而检测引物组、内对照和阳性对照物为自行研制。
一、实验材料
转基因玉米Btl76 二、试剂
Bst DNA聚合酶、IOXifei buffer购自美国New England Biolabs公司；甜菜喊购自美国Sigma公司；dNTP、MgS04分析纯、Premix Taq DNA聚合酶、pMD18_T载体、DNA分子量Marker、转基因基因组DNA提取试剂盒(GMO DetectionVer. 2. O)购自宝生物工程(大连)有限公司；质粒小提试剂盒购自OMEGA公司；DH5a菌株为本实验室保存；引物由上海英潍捷基生物工程技术服务有限公司合成。三、主要仪器设备
ClOOO 型 PCR 仪(Bio-Rad Laboratories,Inc.)
Gel 型凝胶成像系统(Bio-Rad Laboratories, Inc.)
Biophotometer plus 紫外分光光度计(Eppendorf, Inc.)
其他仪器包括恒温水浴锅，离心机，恒温培养箱，电子天平，微量移液器等。四、实验方法和过程
I、引物组的设计
通过GenBank查询和检索相关国内外文献资料获得转基因玉米Btl76的内参照基因zSS II b (GenBank AF019297)和转化体特异性序列(GenBank AJ878607. I)。根据获得的序列信息，利用在线 http://primerexplorer. jp/e/PrimerExploerV4 软件分别设计了 2 组引物，分别用于扩增zSSII b基因和转基因玉米Btl76转化体特异性序列。zSSll b基因扩
增引物包括外引物zSS II b-F3、zSSn b-B3和内引物zSS II b_FIP、zSS II b-BIP ;转化体
特异性序列扩增引物由外引物Btl76-F3、Btl76-B3和内引物Btl76_FIP、Btl76_BIP组成。引物序列见表I.
权利要求
1.转基因玉米Bt176及其加工品的检测引物组，包括引物组I和引物组2，其中，引物组 I 包括外引物 zSSIIb-F3、zSSIIb-B3 和内引物 zSSIIb-FIP、zSSIIb-BIP，序列如下zSSIIb- F3 TGACCGTTAGCAATGGCTAC (SEQ ID NO:I)；zSSIIb- B3 AGCGTCTCGAACGTGTAGT (SEQ ID N0:2)；zSSIIb-FIP ATGCCCTGCAGCTTCCAGTCGGGGAGCTGAAGACTTCGGAA (SEQ ID NO:3);zSSIIb-BIP CGTGAACGGCATCGACATGAGCTGGTGTAGTCGTCGGAGTG (SEQ ID NO:4); 引物组2包括外引物Btl76-F3、Btl76-B3和内引物Btl76_FIP、Btl76_BIP，序列如下Btl76-F3 CGGCTTCAAGCACGGGA (SEQ ID NO:5)；Btl76-B3 GAGGGAGAGAGAGGGAGC (SEQ ID N0:6)；Btl76-FIP AGGACCGGACGGGGCAGTACACTGGCATGACGTGGGTT (SEQ ID NO:7);Btl76- BIP TCTCCTCCATTGATGCACGCCGGGGGAAGGGAGAAACGG (SEQ ID N0:8)。
2.转基因玉米Btl76及其加工品的检测试剂盒，包括(1)权利要求I所述的引物组I ; (2)权利要求I所述的引物组2 ；(3)Bst DNA聚合酶；(4)LAMP反应液；(5)染色剂；(6)内对照；(7)阳性对照。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，引物组I中外引物和内引物的添加摩尔比为1:8 ;所述引物组2中外引物和内引物的添加摩尔比为1:8。
4.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的LAMP反应液，由O.2 mol/L Mg2SO4,25 mmol/L dNTPUOXBst buffer,5 mol/L 甜菜碱按 I 4 10 20 的比例配比而成。
5.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述染色剂为SYBRGreen0
6.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的内对照为含有玉米内参照基因zSSIIb (SEQ ID N0:9)的重组质粒；所述阳性对照为含有转基因玉米Btl76转化体特异性序列(SEQ ID NO: 10)的重组质粒。
7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，内对照和阳性对照的重组质粒的载体为pMD18-T载体。
8.利用权利要求2的试剂盒检测转基因玉米Btl76及其加工品的方法，包括如下步骤 (1)提取纯化待检样品DNA； (2)LAMP法检测； 3 LAMP法检测zSSIIb基因设置样品管(加样品DNA)、内对照(加含有zSSIIb基因的重组质粒DNA)、空白对照(加灭菌去离子水)，25 μ L反应体系含有引物组I外引物对O.2 μ mol/L，内引物对 I. 6 μ mol/L ,Bst DNA 聚合酶 O. 32U/μ L，LAMP 反应液 9 μ L，待检样品DNA50ng，用灭菌去离子水补齐到25 μ I ;将配制好的反应管混匀后离心，并于65°C反应50min，并在80°C持续IOmin ;反应完毕后，往反应管中加入染色剂，混匀，根据显色结果来判断待检样品中是否含有zSSIIb基因； S LAMP法检测转基因玉米Btl76转化体特异性序列设置样品管(样品DNA)、阳性对照(含有转基因玉米Btl76转化体特异性序列的重组质粒DNA)、空白对照(灭菌去离子水)，25yL反应体系含有引物组2外引物对0.2ymol/L，内引物对L6ymol/L ,Bst DNA聚合酶O. 32U/yL，反应液9yL，待检样品DNA50ng，用灭菌去离子水补齐到25 μ I ;将配制好的反应管混匀后离心，并于65°C反应50min，并在80°C持续IOmin ;反应结束后，往反应管中加入染色剂，混匀，根据显色结果来判断待检样品中是否含有转基因玉米Btl76转化体特异性序列； (3)结果判断如果步骤(2)中内对照、阳性对照呈阳性，空白对照呈阴性，而样品zSSIIb基因检测呈阳性、转基因玉米Bt176转化体特异性序列检测呈阳性，则表明待检样品含有转基因玉米Btl76成分。
全文摘要
本发明公开了用于检测转基因玉米Bt176转化体特异性序列的引物组、试剂盒及方法。本发明设计了2对LAMP引物组，引物组1检测内参照基因zSSIIb，可检出样品中的玉米成分，同时可排除假阴性结果；引物组2检测Bt176的转化体特异性序列，该序列为插入的外源基因与植物基因组连接的边界序列，具有高度特异性，可有效检出Bt176转基因玉米成分。本试剂盒用于样品检测分析时分别设置了阳性对照、空白对照和内对照，可避免假阳性和假阴性的产生。检测不需要特殊的设备，检测成本低；检测结果通过反应液的颜色变化用肉眼观察即可进行判定，鉴定简便，结果可视化，适用于现场快速检测及基层大样本量的筛查，易于大范围的推广应用。
文档编号C12N15/11GK102766624SQ20121024240
公开日2012年11月7日 申请日期2012年7月12日 优先权日2012年7月12日
发明者佘之韵, 刘唐书, 周琳华, 张宝, 朱文亮, 梁宇斌, 肖维威 申请人:广东产品质量监督检验研究院