专利名称：一种基于抑癌基因的抗肝癌制剂及制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明专利涉及一种基于腺病毒特异性表达的抑癌基因PTEN，可用于抑制肿瘤生长的抗癌制剂——甘露聚糖修饰的腺病毒-抑癌基因PTEN，即Manan-Ad5-PTEN，属于生物医药技术领域。背景技术：
目前对于肿瘤的治疗主要集中于手术、放疗和化疗等常规手段，但很多恶性肿瘤还是难以治愈，生物治疗已经成为肿瘤综合治疗的新模式，并受到越来越多的关注。由于癌症的产生是病毒或化学致癌物的作用使原癌基因激活成为癌基因，以及抑癌基因失活，引起细胞生长失控而形成，因此基因治疗的目的是通过外源基因的导入以修复或纠正病人体内基因表达系统，从根入手，阻断肿瘤的病理过程。
抑癌基因 PTEN (Phosphatase and tensin homologue deleted on chromosometen gene, PTEN)是1997年由Steck等3个研究小组分别发现并命名的一种新的抑癌基因。现已证实该基因的突变、失活与多种肿瘤的发生发展密切相关，成为继pl6、p27和p53后又一具有重要意义的抑癌基因。目前已发现在多种肿瘤中存在PTEN基因的突变，如错构瘤综合征(Cow den syndrome)、胶质瘤、前列腺癌、乳腺癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、肺癌、肾癌、肝癌、膀胱癌、消化道肿瘤等。研究发现，PTEN基因的缺失、突变或表达产物的失活等，影响肿瘤的发生与发展。基因的导入，根据载体的不同，可分为病毒转基因和质粒转基因两种。其中，以质粒为载体的基因治疗存在基因转染率较低的问题；病毒载体则具有更高的转染效率。腺病毒是目前基因治疗研究和临床试验中应用最广泛的病毒载体之一。由于腺病毒具有载体宿主范围宽广，感染效率高，可插入外源基因片段大，无插入突变等特点，因而受到特别的重视。但腺病毒载体介导的基因转移缺乏靶向特异性。在基因治疗的载体研究中，其中一个重要的研究方向是用配体或单克隆抗体对载体系统进行修饰，以提高靶组织、靶细胞对载体系统的摄取能力。研究发现，肝非实质细胞(如KupfTer细胞和肝窦内皮细胞)和巨噬细胞的细胞膜上存在有甘露糖受体，它可以与含糖基的复合物结合。因此，通过一定的方式，利用甘露糖受体介导系统将腺病毒与甘露糖受体结合，可达到对肝脏的靶向性。由于腺病毒存在潜在的免疫原性和毒性，并且体内应用时易被广泛存在的腺病毒抗体中和。为克服腺病毒的无靶向性、免疫原性以及在体内应用时易被腺病毒抗体中和等缺点，有研究者对病毒的衣壳蛋白进行聚乙二醇化，形成一种“隐形病毒”，逃避免疫系统的监视，降低了 T细胞毒性和抗体的产生，进而延长了基因表达。本发明将腺病毒的衣壳蛋白通过甘露聚糖糖基化，可将重组腺病毒在体内靶向至DC细胞和肝癌细胞，诱导了抗肿瘤抗原的免疫应答；可延长基因表达，降低其免疫原性和毒性。三、发明目的
本发明的目的在于充分利用腺病毒载体高效率转导基因的优点，避免其免疫原性和毒性的产生，制备一种利用抑癌基因原理有效抑制肿瘤生长的新型的抗肝癌制剂，为恶性肿瘤的治疗提供一种有效的治疗途径。
四
发明内容
本发明利用腺病毒转运抑癌基因PTEN，并利用甘露聚糖修饰腺病毒载体，从而制备了一种新型的抗肝癌制剂。本发明涉及的抑癌制剂的具体制备方法如下
第一步特异性表达PTEN基因的重组腺病毒即Ad5-PTEN的大量扩增。利用微量的商品化的Ad5-PTEN腺病毒种源感染293细胞，48h后95%的细胞胞质收缩变圆呈葡萄串样，即判断为出现细胞病变效应(CPE);收集细胞悬液，4°C，5000 rpm离心10 min，上清备用；将细胞重悬于2.0 mL完全培养基中，于液氮中冻结细胞，37°C水浴溶解，剧烈振荡，此步骤共进行4次；然后4°C, 5000 rpm离心10 min,收集上清后合并前一步骤的病毒上清进一步感染100 _培养皿中的细胞；细胞出现病变效应后，按照前述方法收集病毒，并进而将其感 染150 mm培养皿中的293细胞，以获得足够量的病毒。第二步Ad5_PTEN的纯化。采用氯化铯(CsCl)密度梯度离心法纯化重组腺病毒，氯化铯密度分别为I. 45 g/m!^P1.25 g/mL。操作步骤如下各个超速离心管依次加入I. 25区/1111氯化铯1.25 mL,然后各管管底小心加入I. 45 g/mL氯化铯I. 25 mL以顶起低密度的氯化铯溶液；最上层加入2. 4 mL待纯化样品，100000Xg，4°C离心3 h，收集第二层乳白色病毒条带。接着进行第二次密度梯度离心各个超速离心管同上依次加入I. 65 mL I. 25g/mL氯化铯和I. 65 mL I. 45 g/mL氯化铯,最上层加入I. 6 mL第一步离心后收集的病毒条带，IOOOOOXg 4°C离心15-18 h。第一次密度梯度超速离心后，上层为一些细胞碎片和一些缺陷型病毒颗粒，第二条有白色乳光的带层为病毒层；第二次离心后出现一条分界清晰的乳白色半透明的薄层病毒带即为所需腺病毒。第三步抑癌制剂的制备。I)透析袋处理制备氧化型甘露聚糖前，对透析袋进行预处理，以激活透析袋；处理步骤如下将透析袋剪成适当长度(10-20 cm)的小段；置于2% (W/V)碳酸氢钠和ImM EDTA (pH 8. 0)混合溶液中煮沸10分钟；蒸馏水彻底清洗；ImM EDTA (pH 8.0)中煮沸10分钟；冷却后，加上封盖存放于4°C，透析袋始终浸没在溶液内，取用透析袋时必须戴手套；用前在透析袋内装满缓冲液清洗干净。2)氧化型甘露聚糖的制备反应按照图I进行，反应步骤如下甘露聚糖以0. I M磷酸缓冲液(pH 6. 0)配成一定浓度的溶液，用0.01-1.0 M的高碘酸钠于适当温度氧化60分钟，加入10 mL乙二醇于适当温度再孵育30分钟。反应产物加入透析袋以碳酸盐缓冲液适当温度下平衡透析5小时。3)目标化合物一抗癌制剂的制备氧化型甘露聚糖与Ad5-PTEN反应，将纯化后的腺病毒Ad5-PTEN与一定浓度的氧化型甘露聚糖溶液混合，室温孵育过夜，产物保存于一 80°C冰箱。五具体实施例方式 本发明制备的抗癌制剂，工艺简单，反应步骤较少，我们依托本校科研平台对这种抗癌制剂进行了动物试验，临床研究正在积极筹备中。已经进行的动物实验主要步骤为(I)小鼠肝癌细胞H22接种小鼠；6天后，将动物随机分为四组，每组10只小鼠，各组给药情况如下(采用瘤内注射，体积 100 mL) I Ad5-PTEN ； II =Docetaxel ；III PBS ；IV :Man-Ad5_PTEN。给药后每天用游标卡尺测量实体瘤长径和短径，按照公式V=0. 52'长径’短径’短径，计算出各组每只动物的肿瘤体积和每组每一个测量点的平均值，第19天，绘出各组给药后肿瘤体积增长曲线(图2);处死各组小鼠，分离瘤块，并称重，结果见图3。
六、有益效果
本发明涉及的抗肝癌制剂从肿瘤的发病机理入手，利用抑癌基因PTEN从根源上抑制肿瘤的生长，利用甘露聚糖修饰腺病毒表面，避免了腺病毒的免疫原性和毒性的产生，提高了腺病毒在体内的稳定性。将此新型抑癌制剂应用于荷瘤小鼠瘤内给药，产生了显著的肿瘤抑制效应。对附图
的说明
图I是甘露聚糖修饰腺病毒表面的反应过程 图2是小鼠肿瘤生长体积变化曲线图 图3是荷瘤小鼠瘤块重量比较图
权利要求
1.一种具有抑制肿瘤生长的抗肝癌制剂Manan-Ad5-PTEN的组成要素，其特征是，中心要素包括抑癌基因PTEN，PTEN的表达载体腺病毒，以及对腺病毒进行表面修饰的化学物质甘露聚糖。
2.根据权利要求I所述的抗癌制剂Manan-Ad5-PTEN的制备方法，其特征是甘露聚糖以0. I M磷酸缓冲液(pH 6. 0)配成一定浓度的溶液，用0. 01-1. 0 M的高碘酸钠于适当温度氧化60分钟，加入10 mL乙二醇于适当温度再孵育30分钟；反应产物加入透析袋以透析液适当温度下平衡透析5小时；制备好的氧化型甘露聚糖与纯化后的Ad5-PTEN反应，室温孵育过夜，产物保存于-80°C冰箱。
3.根据权利要求I所述的抗癌制剂Manan-Ad5-PTEN的制备方法，其特征是所述的甘露聚糖溶液的浓度为20-50 mg/mL。
4.根据权利要求I所述的抗癌制剂Manan-Ad5-PTEN的制备方法,其特征是所述的适当温度是4°C -30°C。
5.根据权利要求I所述的抗癌制剂Manan-Ad5-PTEN的制备方法,其特征是所述的透析液为碳酸盐缓冲液(pH 6. 0 - 9. 0)。
全文摘要
本发明涉及一种可用于抑制小鼠肿瘤增长的抗肝癌制剂及其制备工艺。本发明的目的在于以腺病毒表达的PTEN抑癌基因为治疗药物，利用腺病毒载体高效转导基因的优势，通过化学方法对腺病毒表面进行修饰以避免其免疫原性和毒性的产生，制备一种从根源入手利用抑癌基因原理有效抑制肿瘤生长的新型的抗癌制剂，为恶性肿瘤的治疗提供一种有效的治疗途径。本发明的抑肝癌制剂制备工艺简单，不需要特殊的生产条件。
文档编号C12N15/64GK102743766SQ20121024327
公开日2012年10月24日 申请日期2012年7月13日 优先权日2012年7月13日
发明者刘中兵, 李劲薇, 柯发敏, 钟志容 申请人:钟志容