核酸的扩增检测方法以及试剂盒的制作方法

专利名称：核酸的扩增检测方法以及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于对核酸进行扩增、检测所扩增的核酸的方法以及试剂盒。
背景技术：
为了使用PCR对DNA进行扩增，需要以作为靶标的核酸为其一对间的区域的引物核酸、聚合酶、作为该聚合酶的底物并形成扩增后的核酸的核苷三磷酸。扩增后，使用任意的方法，例如使用具有与靶序列互补的序列的特异性探针核酸，能够检测作为靶标的核酸。另外，还有使用逆转录(RT)PCR对cDNA进行扩增的方法，此时，可以利用具有逆转录活性的聚合酶。而且，为了防止扩增产物的污染，已知有使用作为非天然型核苷三磷酸的脱氧尿·苷三磷酸的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG)法(专利第3392863号)。但是，在这样的现有技术中，一般存在如下问题，⑴具有逆转录活性的聚合酶的种类受限制；(2) —般的聚合酶大多不摄取作为扩增时的底物的脱氧尿苷三磷酸，有时不能利用UNG法中的尿嘧啶N糖基化酶进行分解，不能防止污染；(3)扩增的速度优选较快。这样，期待一种能够进行逆转录、能够使用脱氧尿苷三磷酸的迅速对长链的靶核酸进行扩增及检测的方法。

发明内容
本发明目的在于提供一种能够进行逆转录、能够使用脱氧尿苷三磷酸、能够防止合成的核酸链分解、迅速对长链的靶核酸进行扩增及检测的方法。本发明人发现，将序列编号I中的第651位的精氨酸取代为谷氨酸的Taq聚合酶具有逆转录活性，能够摄取脱氧尿苷三磷酸，而且通过使序列编号I中的第I 235位的氨基酸缺失，能够降低5’ 一3’核酸外切酶活性，从而完成了本发明。SP，本发明如下所述。(I) 一种对试样中所含的核酸进行扩增的方法，该方法包括(a)将用于对该核酸的任意区域进行扩增的引物、聚合酶、以及作为核酸扩增底物的核苷酸，与含有该核酸的试样混合的工序；以及(b)利用聚合酶反应对该区域进行扩增的工序，其中，该聚合酶具有由序列编号I构成的氨基酸序列或者与序列编号I同源的氨基酸序列，并且对应于该氨基酸序列的651位的氨基酸残基被谷氨酸取代。(2) 一种对试样中所含的核酸进行扩增并检测的方法，该方法包括(a)将用于对该核酸的任意区域进行扩增的引物、聚合酶、作为核酸扩增底物的核苷酸、以及用于检测所扩增的核酸的探针，与含有该核酸的试样混合的工序；(b)利用聚合酶反应对该区域进行扩增的工序；以及(C)使用该探针检测该区域的工序，其中，该聚合酶具有由序列编号I构成的氨基酸序列或者与序列编号I同源的氨基酸序列，并且对应于该氨基酸序列的651位的氨基酸残基被谷氨酸取代。(3)根据(2)中所述的方法，其中，所述(C)的检测工序通过扩增反应中蓄积的PCR产物的检测或者熔解曲线分析而进行。(4)根据⑴至(3)中任意一项所述的方法，其中，所述进行扩增的核酸为DNA或RNA。(5)根据(4)中所述的方法，其中，所述(b)的扩增工序为PCR或RT-PCR。(6)根据(I)至(5)中任意一项所述的方法，其中，所述作为核酸扩增底物的核苷
酸含有脱氧尿苷三磷酸。(7)根据⑴至(6)中任意一项所述的方法，其中，所述聚合酶是，为了使5’一 3’核酸外切酶活性缺失或降低而使N末端的氨基酸缺失的改性Taq聚合酶。
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(8)根据(7)中所述的方法，其中，所述聚合酶为序列编号I的氨基酸序列中的第I 235位的氨基酸缺失的改性Taq聚合酶。(9)根据⑴至⑶中任意一项所述的方法，其中，所述(b)工序为在20个碱基以上/秒的条件下对核酸进行扩增的工序。(10)根据(9)中所述的方法，其中，所述(b)工序为扩增600个碱基以上的碱基长
度的工序。(11) 一种试剂盒，其用于对试样中所含的核酸进行扩增，该试剂盒含有用于对任意的核酸区域进行扩增的引物、聚合酶、以及作为核酸扩增底物的核苷酸，其中，该聚合酶具有由序列编号I构成的氨基酸序列或者与序列编号I同源的氨基酸序列，并且对应于该氨基酸序列的651位的氨基酸残基被谷氨酸取代。(12) 一种试剂盒，其用于对试样中所含的核酸进行扩增并检测，该试剂盒含有用于对任意的核酸区域进行扩增的引物、聚合酶、作为核酸扩增底物的核苷酸、以及对所扩增的核酸进行检测的探针，其中，该聚合酶具有由序列编号I构成的氨基酸序列或者与序列编号I同源的氨基酸序列，并且对应于该氨基酸序列的651位的氨基酸残基被谷氨酸取代。(13)根据(11)或(12)中所述的试剂盒，其中，所述作为核酸扩增底物的核苷酸含
有脱氧尿苷三磷酸。本发明中使用的聚合酶由于具有逆转录活性，因此能够对DNA或RNA中任一种核酸进行扩增。本发明中使用的聚合酶由于能够摄取脱氧尿苷三磷酸，因此，优选实施UNG法，能够防止扩增产物的污染。通过本发明的方法，能够在20个碱基以上/秒的条件下对核酸进行扩增，能够提高扩增速度。本发明的方法尤其在对600个碱基以上的长链碱基长度进行扩增时极其有效。本发明中使用的聚合酶进一步通过使序列编号I中的第I 235位的氨基酸缺失，能够使5’ 一3’核酸外切酶活性缺失或降低。本发明的方法由此能够不分解反应液中的核酸探针，能够进行扩增中的探针检测行为和扩增后的熔解曲线分析。


图1A、图IB、图1C、图ID表示实施例I的对使用底物dNTPmix以及Taq时(图1A)、使用底物dNTPmix以及改性Taq时(图1B)、使用底物dAUGCmix以及Taq时(图1C)、使用底物dAUGCmix以及改性Taq时(图1D)的NAT2基因进行Tm解析时的每单位时间的荧光强度的变化量(_d荧光强度增加量/t)的变化。纵轴为每单位时间的荧光强度的变化量(-d荧光强度增加量/t)，横轴为温度(V )。图2A、图2B表示实施例2的对使用底物dAUGCmix以及Taq时(图2A)、底物dAUGCmix以及改性Taq时(图2B)的RNA (SWlnfHl区域)进行Tm解析时的每单位时间的荧光强度的变化量(_d荧光强度增加量/t)的变化。纵轴为每单位时间的荧光强度的变化量(-d荧光强度增加量/t)，横轴为温度(V )。图3A、图3B表示实施例3的对使用底物dAUGCmix以及Taq(图3A)或者改性Taq (图3B)的CYP2D6基因进行Tm解析时的每单位时间的荧光强度的变化量(_d荧光强度
增加量/t)的变化。纵轴为每单位时间的荧光强度的变化量(-d荧光强度增加量/t)，横轴为温度(V )。
具体实施例方式〈1>本发明的扩增以及检测方法本发明的方法为对试样中所含的核酸进行扩增的方法，其特征在于，该方法包括(a)将用于对该核酸的任意区域进行扩增的引物、聚合酶、以及作为核酸扩增底物的核苷酸，与含有该核酸的试样混合的工序；以及(b)利用聚合酶反应对该区域进行扩增的工序，其中，该聚合酶具有由序列编号I构成的氨基酸序列或者与序列编号I同源的氨基酸序列，并且对应于该氨基酸序列的651位的氨基酸残基被谷氨酸取代。另外，本发明的方法在上述工序(a)以及(b)后，还包括(C)使用探针检测该区域的工序。即，本发明的方法为对试样中所含的核酸进行扩增并检测的方法，其特征在于，该方法包括(a)将用于对该核酸的任意区域进行扩增的引物、聚合酶、作为核酸扩增底物的核苷酸、以及用于检测所扩增的核酸的探针，与含有该核酸的试样混合的工序；(b)利用聚合酶反应对该区域进行扩增的工序；以及(C)使用该探针检测该区域的工序，其中，该聚合酶具有由序列编号I构成的氨基酸序列或者与序列编号I同源的氨基酸序列，并且对应于该氨基酸序列的651位的氨基酸残基被谷氨酸取代。所述(c)的检测工序优选通过扩增反应中蓄积的PCR产物的检测或者熔解曲线分析而进行。本发明的方法通过上述工序(a)、工序(b)、以及根据需要的工序(C)而进行，除使用特定的聚合酶作为聚合酶以外，可以与现有技术的方法同样地进行工序(a) (C)。本发明中使用的聚合酶的特征在于，作为嗜热菌Thermus aquaticus产生的聚合酶(EC. 2. 7. 7. 7)(即Taq聚合酶)的、序列编号I的氨基酸序列的第651位的精氨酸被取代为谷氨酸。本发明中使用的序列编号I的第651位的精氨酸(序列编号I的第651位周边的氨基酸序列用-Phe Gly Val Pro Glu Ala Val Asp-表示,下划线部分表示651位的精氨酸)被取代为谷氨酸(序列编号I的第651位周边的氨基酸序列用-Phe Gly Val ProGlu Glu Ala Val Asp-表示,下划线部分表示被取代后的651位的谷氨酸)的改性Taq聚合酶，与第651位的精氨酸未被取代为谷氨酸的野生Taq聚合酶相比较，聚合酶活性增加。本发明中使用的聚合酶除可以为序列编号I的第651位的精氨酸被取代为谷氨酸的聚合酶以外，还可以为序列编号I中的第I 235位的氨基酸缺失、5’ 一 3’核酸外切酶活性缺失或降低的聚合酶。对本发明中使用的野生聚合酶进行编码的碱基序列例如有，登录为GenBank Acc.No. J04639的碱基序列。在本发明中，聚合酶具有由序列编号I构成的氨基酸序列或者与序列编号I同源·
在本发明的方法中使用上述的Taq聚合酶，但是，只要序列编号I的第651位的精氨酸被取代为谷氨酸，并且不丧失聚合酶活性，例如，还可以是在序列编号I的氨基酸序列或者序列编号I中的第I 235位的氨基酸缺失的氨基酸序列中，具有I个或多个、2 10个、或者2 5个氨基酸残基被取代、缺失、插入、或添加的氨基酸序列的蛋白质。上述氨基酸取代变异的位置为序列编号I的Taq聚合酶的氨基酸序列中的位置，但是，在序列编号I的氨基酸序列中，除所述特定的变异以外，在具有I个或多个氨基酸残基被取代、缺失、插入、或添加的氨基酸序列的Taq聚合酶的同系物或变异体中，在与序列编号I的氨基酸序列的对比中，表示对应于所述氨基酸取代位置的位置。例如，在I 650位的区域中，在具有I个氨基酸残基缺失的Taq聚合酶的保守变异体中，651位表示所述变异体的650位。另外，在具有第I 235位的氨基酸残基的缺失的Taq聚合酶的保守变异体中,651位表示所述变异体的416位。同样地，本发明的Taq聚合酶只要序列编号I的第651位的精氨酸(序列编号I的第651位周边的氨基酸序列用-Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp-表示,下划线部分表示651位的精氨酸)被取代为谷氨酸(序列编号I的第651位周边的氨基酸序列用-Phe Gly Val Pro Glu Glu Ala Val Asp-表示,下划线部分表示被取代后的651位)，并且不丧失聚合酶活性，也可以为相对于序列编号I的氨基酸序列或者序列编号I中的第I 235位的氨基酸缺失的氨基酸序列，至少具有80 %、85 %、90 %、或者95 %的氨基酸同一性的蛋白质。此外，本发明中使用的聚合酶具有逆转录活性，因此，即使以DNA和RNA中任一种为模板也可以进行扩增，还可以进行RT-PCR。混合使用逆转录酶和DNA聚合酶时，有时需要适当调节酶反应，但是，只要是本发明中使用的聚合酶就可以不进行细微调节而使用。另夕卜，由于能够使用单一的酶实施逆转录反应和PCR，因此，不需要在各自的管(tube)内进行逆转录反应和PCR的两步操作，可以利用一步操作实施RT-PCR。本发明中使用的引物，只要以对目标区域进行扩增的方式进行设计，就没有特别的限制，使用通常的方法设计即可。本发明中使用的优选的脱氧核糖核苷酸的组合为脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)、以及脱氧胸苷三磷酸(dTTP)的组合，或者，脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)、以及脱氧尿苷三磷酸(dUTP)的组合，还可以使用ddNTP或修饰核苷等。本发明的聚合酶由于能够摄取脱氧尿苷三磷酸，因此，在本发明的方法中，优选实施UNG法，还能够防止扩增产物的污染。本发明的方法中使用的用于检测所扩增的核酸的核酸探针，例如可以使用特开2001-286300号公报以及特开2002-119291号公报等中记载的末端部利用荧光染料标记的淬灭探针。核酸探针优选与未与靶序列杂交时比较，与靶序列杂交时荧光染料的荧光减少或者增加。本发明中的核酸探针优选为未杂交时荧光染料的荧光发光，杂交时荧光染料的荧光淬灭的淬灭探针。作为含有进行核酸扩增时的模板核酸的试样，含有核酸即可，没有特别的限制，例如为血液、口腔粘膜悬浊液、指甲或毛发等体细胞；生殖细胞、乳汁、腹水液、石蜡包埋组织、胃液、胃灌洗液、腹膜液、羊水、细胞培养等任意的来自于或能够来自于生物学起源的试样。作为模板的核酸，可以从该起源得到后直接使用，或者为使该样品的特性改变而进行前处·理后使用。另外，一般试样中的核酸为DNA或者RNA，可以为单链或者双链。本发明的方法中的上述工序(a)可以通过将规定量的上述聚合酶、引物、以及底物核苷酸、根据需要的核酸探针、与含有核酸的试样一起添加到反应液中并进行混合而进行。本发明的方法中的上述工序(b)可以通过通常的核酸扩增方法、例如PCR、RT_PCR等进行。另外，通过ICAN法可以使用DNA-RNA嵌合引物、RNase H、上述聚合酶对靶基因进行扩增。另外，还可以通过LAMP法使用内引物、外引物、环状引物、上述聚合酶对靶基因进行扩增。进行扩增核酸的检测时，优选在核酸探针的存在下进行扩增。即，进行上述工序(C)时，优选在工序(a)中增加探针。本发明的方法中的上述工序(b)可以通过使用本发明的聚合酶，优选在20个碱基以上/秒的条件下对核酸进行扩增。本发明的方法中的上述工序(C)优选为使用所述探针进行熔解曲线分析、检测扩增区域的工序。在本发明的方法中，除使用本发明的聚合酶以外，可以根据通常的核酸扩增以及熔解曲线分析(Tm解析)的方法进行。更优选工序(c)为对所扩增的核酸，通过使用利用荧光染料标记后的核酸探针来测定荧光染料的荧光，从而进行熔解曲线分析，并根据熔解曲线分析的结果来检测扩增区域的工序。本发明的方法中的工序(c)可以根据通常的熔解曲线分析(Tm解析)的方法来进行。或者，本发明的方法中的工序(C)还可以通过扩增反应中蓄积的PCR产物的检测来进行。具体地，工序(C)可以是使用依赖扩增产物的量而荧光变化的体系，通过荧光的测定来实时进行PCR中的扩增产物的定量，根据其结果来对样品中的DNA进行定量的定量PCR，还可以根据公知的方法进行。作为这样的方法的例子，可列举出使用与扩增产物杂交的荧光标记的探针的方法，作为荧光标记的探针，可以使用所述探针。本发明的方法中的工序(c)，除使用所述探针以外，可以根据通过测定荧光染料的荧光而进行的实时PCR法来进行。本领域技术人员容易根据所使用的探针来调节扩增的反应条件等。此外，在本发明的方法中，所述工序(C)还可以与所述工序(b)同时进行。
本发明的方法中的工序(C)，由于只在核酸的扩增后解析探针的Tm或者检测作为荧光值的PCR产物的量，因此，反应结束后没必要处理扩增产物。因而，不用担心扩增产物的污染。另外，由于可以利用与扩增所需的仪器相同的仪器进行检测，因此，甚至没必要移动容器。〈2>本发明试剂盒本发明试剂盒为用于本发明的检测方法的试剂盒。即，本发明的试剂盒用于对试样中所含的核酸进行扩增并检测，含有用于对任意的核酸区域进行扩增的引物、聚合酶、作为核酸扩增底物的核苷酸、以及用于对所扩增的核酸进行检测的探针，其特征在于，该聚合酶具有由序列编号I构成的氨基酸序列或者与序列编号I同源的氨基酸序列，对应于该氨基酸序列的651位的氨基酸残基被谷氨酸取代。另外，本发明的试剂盒还可以只用于核酸的扩增。
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S卩，本发明的试剂盒用于对试样中所含的核酸进行扩增，含有用于对任意的核酸区域进行扩增的引物、聚合酶、以及作为核酸扩增底物的核苷酸，其特征在于，该聚合酶具有由序列编号I构成的氨基酸序列或者与序列编号I同源的氨基酸序列，并且对应于该氨基酸序列的651位的氨基酸残基被谷氨酸取代。关于引物、聚合酶、底物核苷酸、以及探针，关于本发明的方法，如上所述。在本发明的试剂盒中，底物核苷酸优选含有脱氧尿苷三磷酸。本发明的试剂盒，除引物、聚合酶、底物核苷酸、以及探针以外，还可以含有进行本发明的检测方法中的核酸扩增所必要的试剂类。在本发明的试剂盒中，引物、聚合酶、底物核苷酸、探针以及其它的试剂类可以单独容纳，也可以将它们的一部分形成混合物。以下通过实施例对本发明进行具体说明。实施例实施例I (检测NAT2基因时)为了能够对含有 N-乙酰基转移酶 2 (N-acetyltransferase 2，NAT2)的 NAT2*5 的基因的位点(640bp)进行扩增，使用表I中所示的引物以及探针对。这样的引物以及探针记载在 W02008/066161 中。表I
名称序列(5' — 3')元(mer)~ SEQ ID N0~
探针gccgtcagtggtcac-(BODIPY FL)152
名称序列(5' — 3/ )^SEQ ID N0~
上游弓 I 物 tccagttaacaaatacagcactggcatgg293
下游弓 I 物 tgataattagtgagttgggtgatacatacacaaggg 364
使用Smart Cycler (Takara Bio株式会社制备)对25 μ I的含有IO3拷贝的人精制基因组的、混合各成分达到下表2的浓度的混合液进行PCR以及Tm解析。PCR以及Tm解析的条件如下述表3所示。Tm解析将Optics设定为Chi。底物丨※I)为dNTPmix或者dAUGCmix。dAUGCmix中，仅dUTP的最终浓度为600nM。dNTPmix 的组成为 dATP、dCTP、dGTP、dTTP, dAUGCmix 的组成为 dATP、dCTP、dGTP、dUTP。酶丨※〗)为Taq或改性Taq，Taq表示氨基酸第I 235位缺失的野生型Taq聚合酶，改性Taq表示氨基酸第I 235位缺失的R651E变异导入Taq聚合酶。Taq作为由大肠杆菌制备的重组酶生产。改性Taq通过特异性变异导入将651位的精氨酸取代为谷氨酸。表2反应液总量25 μ I

权利要求
1.一种对试样中所含的核酸进行扩增的方法，该方法包括 (a)将用于对该核酸的任意区域进行扩增的引物、聚合酶、以及作为核酸扩增底物的核苷酸，与含有该核酸的试样混合的工序；以及 (b)利用聚合酶反应对该区域进行扩增的工序， 其中，该聚合酶具有由序列编号I构成的氨基酸序列或者与序列编号I同源的氨基酸序列，并且对应于该氨基酸序列的651位的氨基酸残基被谷氨酸取代。
2.—种对试样中所含的核酸进行扩增并检测的方法，该方法包括 (a)将用于对该核酸的任意区域进行扩增的引物、聚合酶、作为核酸扩增底物的核苷酸、以及用于检测所扩增的核酸的探针，与含有该核酸的试样混合的工序； (b)利用聚合酶反应对该区域进行扩增的工序；以及 (C)使用该探针检测该区域的工序， 其中，该聚合酶具有由序列编号I构成的氨基酸序列或者与序列编号I同源的氨基酸序列，并且对应于该氨基酸序列的651位的氨基酸残基被谷氨酸取代。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其中，所述(c)的检测工序通过扩增反应中蓄积的PCR产物的检测或者熔解曲线分析而进行。
4.根据权利要求I至3中任意一项所述的方法，其中，所述进行扩增的核酸为DNA或RNA。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述(b)的扩增工序为PCR或RT-PCR。
6.根据权利要求I至5中任意一项所述的方法，其中，所述作为核酸扩增底物的核苷酸含有脱氧尿苷三磷酸。
7.根据权利要求I至6中任意一项所述的方法，其中，所述聚合酶是，为使5’一 3’核酸外切酶活性缺失或降低而使N末端的氨基酸缺失的改性Taq聚合酶。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述聚合酶为序列编号I的氨基酸序列中的第I 235号的氨基酸缺失的改性Taq聚合酶。
9.根据权利要求I至8中任意一项所述的方法，其中，所述(b)工序为在20个碱基以上/秒的条件下对核酸进行扩增的工序。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述(b)工序为扩增600个碱基以上的碱基长度的工序。
11.一种试剂盒，其用于对试样中所含的核酸进行扩增，该试剂盒含有用于对任意的核酸区域进行扩增的引物、聚合酶、以及作为核酸扩增底物的核苷酸，其中， 该聚合酶具有由序列编号I构成的氨基酸序列或者与序列编号I同源的氨基酸序列，并且对应于该氨基酸序列的651位的氨基酸残基被谷氨酸取代。
12.—种试剂盒，其用于对试样中所含的核酸进行扩增并检测，该试剂盒含有用于对任意的核酸区域进行扩增的引物、聚合酶、作为核酸扩增底物的核苷酸、以及对所扩增的核酸进行检测的探针，其中， 该聚合酶具有由序列编号I构成的氨基酸序列或者与序列编号I同源的氨基酸序列，并且对应于该氨基酸序列的651位的氨基酸残基被谷氨酸取代。
13.根据权利要求11或12所述的试剂盒，其中，所述作为核酸扩增底物的核苷酸含有脱氧尿苷三磷酸。
全文摘要
本发明涉及核酸的扩增检测方法以及试剂盒。具体地，本发明提供了一种对试样中所含的核酸进行扩增的方法，其中，该方法包括(a)将用于对该核酸的任意区域进行扩增的引物、聚合酶、以及作为核酸扩增底物的核苷酸，与含有该核酸的试样混合的工序；以及(b)利用聚合酶反应对该区域进行扩增的工序。其中，该聚合酶具有由序列编号1构成的氨基酸序列或者与序列编号1同源的氨基酸序列，对应于该氨基酸序列的651位的氨基酸残基被谷氨酸取代。
文档编号C12Q1/68GK102876661SQ20121024476
公开日2013年1月16日 申请日期2012年7月12日 优先权日2011年7月12日
发明者细见敏也, 平井光春 申请人:爱科来株式会社