专利名称：一种结核分支杆菌Ag85A口服DNA疫苗的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种疫苗的制备方法，特别是涉及一种结核分支杆菌Ag85A 口服DNA疫苗的制备方法。
背景技术：
近年来随着人口流动增加，艾滋病蔓延以及新型结核菌株，多重耐药菌株的出现，结核病一改过去逐年递减的趋势，发生回潮，病例数明显增加，发病率以每年20%的速度递增，成为死亡率最高的感染性疾病。因此预防接种对结核病的控制和消灭起着关键性的作用。目前预防接种防治结核病以卡介苗(BCG)作为唯一临床使用的疫苗，预防效果并不稳定。BCG是由一株患结核性乳腺炎的奶牛身上分离到的牛型结核分支杆菌，经过230次·连续传代减毒而失去了一些编码具有免疫保护作用的抗原基因。同时BCG的接种会使结核菌素试验阳性，对结核病的诊断产生干扰，延误治疗时间，因此研制新疫苗成为当前结核病防治的首要任务。口服疫苗不但能有效地诱导膜系统的特异性免疫力，而且口服给药的途径简单、安全，避免了注射疫苗所需要的严格标准，不需高度专业训练的卫生人员即可同时开展大量人群的免疫，因此口服DNA疫苗是一种易于普遍接受的疫苗接种形式。本发明选用目的抗原基因为Ag85A，相对分子质量为32 KD,存在于结核杆菌和BCG的细胞壁及培养滤液中，可显著刺激细胞免疫功能增强。本发明涉及重组真核表达质粒P⑶NA3. l+/Ag85A的构建，其编码蛋白可在肠粘膜、脾和淋巴结等处表达，可明显刺激全身性的细胞免疫和体液免疫应答，如细胞毒活性和特异性IgG抗体产生，还可以使肠粘膜局部产生特异性分泌型IgA，可极大增强免疫应答，而经注射途径不能诱导此种分泌型IgA的分泌。以往单纯应用裸DNA疫苗存在极大缺陷，经口服摄入在胃肠道内稳定性差，而且胃肠粘膜对抗原递呈产生的免疫应答较弱，所以口服免疫所需的抗原量大，这就限制了口服疫苗的应用。本发明选用脂质体为运载体包裹口服疫苗，防止降解，有效的诱导机体产生免疫应答，同时脂质体可用作疫苗的保护剂，可防止核酸被体内物质降解，可将其特异性传递到靶细胞中；无毒、无免疫性，具有生物惰性，可生物降解；易于制备，使用方便，可将大的DNA片断转运到细胞中；基因转染率高，100%离体细胞可以瞬间表达外源基因。
发明内容
本发明的目的在于提供一种结核分支杆菌Ag85A 口服DNA疫苗的制备方法，以脂质体为运载体的结核分支杆菌Ag85A 口服DNA疫苗具备稳定表达目的蛋白的免疫预防效果，由于脂质体的运载达到无毒无干扰的安全口服要求，可显著刺激细胞免疫功能增强，为口服DNA疫苗的临床应用研究奠定基础。本发明的目的是通过以下技术方案实现的
一种结核分支杆菌Ag85A 口服DNA疫苗的制备方法,其所述方法包括重组真核表达质粒pCDNA3. l+/Ag85A的构建、薄膜分散法制备脂质体、脂质体为运载体的结核分支杆菌Ag85A 口服DNA疫苗的制备，具体过程为重组真核表达质粒p⑶NA3. l+/Ag85A的构建包括引物设计、结核分支杆菌H37Rv株接种改良罗氏培养基、聚合酶链式反应扩增Ag85A基因、纯化聚合酶链式反应产物TA克隆入载体pUCm-T载体、蓝白斑筛选、亚克隆入真核表达载体p⑶NA3. 1+鉴定正确后将重组质粒转化感受态大肠杆菌菌株DH5 a，构建重组真核表达质粒p⑶NA3. l+/Ag85A，从受体菌DH 5a中提取纯化pUCm_Ag85A，碱变性方法提取重组真核表达质粒P⑶NA3. l+/Ag85A ;薄膜分散法制备脂质体包括磷酸盐缓冲液的配制及得到脂质体；脂质体为运载体的结核分支杆菌Ag85A 口服DNA疫苗的制备包括将溶液I. 5毫升加A 5毫升离心管中，同时加入I. 5毫升的重组真核表达 质粒p⑶NA3. l+/Ag85A,将5毫升离心管置于漩涡混合器充分混合震摇5分钟后放入4 1冰箱静置2小时，使成均匀的DNA脂质体混悬液，取出5毫升离心管，充氮气后用胶塞密闭置于4 °C冰箱保存备用，此离心管中的混悬液即为结核分支杆菌Ag85A 口服DNA疫苗。所述的一种结核分支杆菌Ag85A 口服DNA疫苗的制备方法,其所述结核分支杆菌H37Rv株接种改良罗氏培养基，为37°C培养8周，小量抽提DNA为模板；聚合酶链式反应扩增Ag85A基因；为94°C预变性15分钟，热启动后转入94°C变性I分钟，60°C退火I. 5分钟，72°C延伸2分钟，进行30个循环，72°C延伸10分钟后终止反应，反应结束后取5微升产物于1%琼脂糖凝胶电泳，鉴定正确后采用胶回收试剂盒纯化聚合酶链式反应产物。所述的一种结核分支杆菌Ag85A 口服DNA疫苗的制备方法，其所述纯化聚合酶链式反应产物TA克隆入载体pUCm-T载体按pUCm-T载体PCR扩增试剂盒建立反应体系IOx缓冲液I微升，pUCm-T载体I微升，聚合酶链式反应产物3微升，T4 DNA连接酶I微升，加双蒸水至10微升，25 °C连接30分钟；连接产物转化到受体菌DH 5a感受态细胞，取100微升转化后的菌液铺于10毫升含600微克氨苄青霉素、800微克IPTG、80微克X_gal的肉汤蛋白胨琼脂平板，平放30分钟后，37°C倒置培养12-16小时；蓝白斑筛选待蓝色充分显现，挑取白色菌落于10毫升含600微克氨苄青霉素的肉汤蛋白胨培养基，于37°C水浴锅中以200转/分钟速度振摇培养过夜，并扩增氨苄青霉素抗性克隆，质粒提取试剂盒小量抽提质粒。所述的一种结核分支杆菌Ag85A 口服DNA疫苗的制备方法，其所述受体菌DH 5 a中提取纯化pUCm-Ag85A，经限制性内切酶Xho I及BamH I双酶切，回收小片段作为目的基因，将其亚克隆入真核表达载体P⑶NA3. 1+同样经Xho I及BamH I双酶切后所回收的大片段；连接反应体系载体I微升，目的基因4微升，IOx缓冲液I微升，T4 DNA连接酶I微升，加双蒸水至10微升，4°C过夜。第二天取连接产物转化到受体菌DH 5a感受态细胞，挑取阳性克隆，抽提质粒行双酶切及测序鉴定；碱变性方法提取重组真核表达质粒p⑶NA3. l+/Ag85A,将所得质粒保存于pH8. 0 Tris盐酸缓冲液，使其终浓度为250微克/毫升。所述的一种结核分支杆菌Ag85A 口服DNA疫苗的制备方法，其所述薄膜分散法制备脂质体包括
(1)磷酸盐缓冲液的配制称取磷酸氢二钠0.37克与磷酸二氢钠2. 0克；加蒸馏水溶解并稀释至1000毫升，调节该溶液PH值为5. 7 ;
(2)称取注射用豆磷脂0.9克、胆固醇0. 3克；加入50ml容量的小烧杯中，加入无水乙醇2毫升，置于65 70°C水浴锅中，用玻璃棒搅拌使豆磷脂及胆固醇充分溶解，旋转该小烧杯使磷脂的乙醇液在杯壁上成膜，用吸耳球轻吹风，将乙醇挥发除去；
(3)将步骤二中第I点所述的磷酸盐缓冲液30毫升加入小烧杯中并将小烧杯置于65 70°C水浴锅中预热，20分钟后，将预热的磷酸盐缓冲液30毫升加入步骤二中第2点所制备的含有磷脂和胆固醇脂质膜的小烧杯中，65 70°C水浴中搅拌水化10分钟；随后将小烧杯置于磁力搅拌器上，室温下搅拌30分钟，如果溶液体积减少，可补加水至30毫升，充分混匀，即可得到脂质体。对本发明技术方案进一步说明
一、重组真核表达质粒P⑶NA3. l+/Ag85A的构建
1.引物设计 根据基因文库中Ag85A基因序列，聚合酶链式反应所用引物上游引物5’ - CAGGATCCGCGCGCGCAGTCTGACCTAGTTGAGGATGC -3’，含限制性内切酶BamHI酶切位点；下游引物5’-GTCTCGAGAGGGCCGCCGCCGTTAATCGCT-3’含限制性内切酶Xho I酶切位点，并在开放阅读框架终止密码子之后，Ag85A含信号肽序列，确保克隆基因开放读码框正确；
2.结核分支杆菌H37Rv株接种改良罗氏培养基，37°C培养8周，小量抽提DNA为模
板；
3.聚合酶链式反应扩增Ag85A基因；
94°C预变性15分钟，热启动后转入94°C变性I分钟，60°C退火I. 5分钟，72°C延伸2分钟，进行30个循环，72°C延伸10分钟后终止反应，反应结束后取5微升产物于1%琼脂糖凝胶电泳，鉴定正确后采用胶回收试剂盒纯化聚合酶链式反应产物；
4.纯化聚合酶链式反应产物TA克隆入载体pUCm-T载体
按pUCm-T载体PCR扩增试剂盒建立反应体系IOx缓冲液I微升，pUCm_T载体I微升，聚合酶链式反应产物3微升，T4 DNA连接酶I微升，加双蒸水至10微升，25 °C连接30分钟；连接产物转化到受体菌DH 5a感受态细胞，取100微升转化后的菌液铺于10毫升含600微克氨苄青霉素、800微克IPTG、80微克X-gal的肉汤蛋白胨琼脂平板，平放30分钟后，37°C倒置培养12-16小时；
5.蓝白斑筛选
待蓝色充分显现，挑取白色菌落于10毫升含600微克氨苄青霉素的肉汤蛋白胨培养基，于37°C水浴锅中以200转/分钟速度振摇培养过夜，并扩增氨苄青霉素抗性克隆，质粒提取试剂盒小量抽提质粒；
6.亚克隆入真核表达载体p⑶NA3.1+鉴定正确后将重组质粒转化感受态大肠杆菌菌株DH5 a，构建重组真核表达质粒pCDNA3. l+/Ag85A ；
7.从上述受体菌DH5a中提取纯化pUCm-Ag85A，经限制性内切酶Xho I及BamH I双酶切，回收小片段作为目的基因，将其亚克隆入真核表达载体P⑶NA3. 1+同样经Xho I及BamH I双酶切后所回收的大片段；连接反应体系载体I微升，目的基因4微升，IOx缓冲液I微升，T4 DNA连接酶I微升，加双蒸水至10微升，4°C过夜。第二天取连接产物转化到受体菌DH 5a感受态细胞，挑取阳性克隆，抽提质粒行双酶切及测序鉴定；
8.碱变性方法提取重组真核表达质粒p⑶NA3.l+/Ag85A,将所得质粒保存于pH8. 0Tris盐酸缓冲液，使其终浓度为250微克/毫升；采用此方法获得的重组真核表达质粒p⑶NA3. l+/Ag85A经PCR及双酶切证实成功构建了携带Ag85A基因的重组真核表达质粒p⑶NA3. l+/Ag85A，后者成功转化感受态大肠杆菌DH5a ;分别以17启动子引物和BGH通用序列对重组质粒进行正反双向测序，表明Ag85A DNA已被克隆到真核表达载体p⑶NA3. 1+中CMV启动子的下游，且插入后阅读框正确；经测序分析所克隆Ag85A与基因文库中结核分枝杆菌Ag85A核苷酸编码的氨基酸同源性为100% ；
二.薄膜分散法制备脂质体
1.磷酸盐缓冲液的配制称取磷酸氢二钠0.37克与磷酸二氢钠2. 0克；加蒸馏水溶解并稀释至1000毫升，调节该溶液PH值为5. 7 ;
2.称取注射用豆磷脂0.9克、胆固醇0. 3克；加入50ml容量的小烧杯中，加入无水乙醇2毫升，置于65 70°C水浴锅中，用玻璃棒搅拌使豆磷脂及胆固醇充分溶解，旋转该小烧·杯使磷脂的乙醇液在杯壁上成膜，用吸耳球轻吹风，将乙醇挥发除去；
3.将步骤二中第I点所述的磷酸盐缓冲液30毫升加入小烧杯中并将小烧杯置于65 70°C水浴锅中预热，20分钟后，将预热的磷酸盐缓冲液30毫升加入步骤二中第2点所制备的含有磷脂和胆固醇脂质膜的小烧杯中，65 70°C水浴中搅拌水化10分钟；随后将小烧杯置于磁力搅拌器上，室温下搅拌30分钟，如果溶液体积减少，可补加水至30毫升，充分混匀，即可得到脂质体；
三.脂质体为运载体的结核分支杆菌Ag85A口服DNA疫苗的制备
将步骤二中第3点所述的溶液I. 5毫升加入5毫升离心管中，同时加入I. 5毫升的步骤一中第8点所述的重组真核表达质粒p⑶NA3. l+/Ag85A,将5毫升离心管置于漩涡混合器充分混合震摇5分钟后放入4 1冰箱静置2小时，使成均匀的DNA脂质体混悬液，取出5毫升离心管，充氮气后用胶塞密闭置于4 °C冰箱保存备用，此离心管中的混悬液即为结核分支杆菌Ag85A 口服DNA疫苗。本发明根据结核分枝杆菌Ag85A的基因序列自行设计了一对PCR引物，以人型结核杆菌H37Rv标准毒力株的DNA为模板，经过PCR扩增出其Ag85A目的基因，将回收的PCR产物用限制性核酸内切酶Xhol和BamHI双酶酶切后，经T4 DNA连接酶作用，与真核表达载体p⑶NA3. 1+连接，筛选得到的阳性克隆经DNA测序鉴定证实为Ag85A基因，且被克隆到载体p⑶NA3. 1+中的CMV启动子的下游，构建重组质粒p⑶NA3. l+/Ag85A.将其转化大肠杆菌并使之大量扩增，并采用碱变性方法提取重组真核表达质粒P⑶NA3. l+/Ag85A，应用薄膜分散法制备脂质体进行包裹，制得结核杆菌Ag85A 口服DNA疫苗，具备稳定表达目的蛋白的免疫预防效果，并且由于脂质体的运载达到无毒无干扰的安全口服要求，可显著刺激细胞免疫功能增强，达到预防结核病的最终目的，为口服DNA疫苗的临床应用研究奠定基础。本发明的优点与效果是
本发明提供一种结核分支杆菌Ag85A 口服DNA疫苗的制备方法，该方法制备的以脂质体为运载体的结核分支杆菌Ag85A 口服DNA疫苗具备稳定表达目的蛋白的免疫预防效果，并且由于脂质体的运载达到无毒无干扰的安全口服要求，可显著刺激细胞免疫功能增强，达到预防结核病的最终目的，为口服DNA疫苗的临床应用研究奠定基础。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。实施例
一种结核分支杆菌Ag85A 口服DNA疫苗的制备方法，包含三个连续的步骤，具体方法如
下
一、重组真核表达质粒p⑶NA3. l+/Ag85A的构建 I.引物设计
根据基因文库中Ag85A基因序列，聚合酶链式反应所用引物上游引物5’ - CAGGATCCGCGCGCGCAGTCTGACCTAGTTGAGGATGC -3’，含 BamHI 酶切位点；下游引物 5’ -GTCTCGAGAGGGCCGCCGCCGTTAATCGCT-3’含Xho I酶切位点，并在开放 阅读框架终止密码子之后。Ag85A含信号肽序列。确保克隆基因开放读码框正确。2.结核分支杆菌H37Rv株接种改良罗氏培养基，37°C培养8周，小量抽提DNA为模板。3.聚合酶链式反应扩增Ag85A基因
94°C预变性15分钟，热启动后转入94°C变性I分钟，60°C退火I. 5分钟，72°C延伸2分钟，进行30个循环，72°C延伸10分钟后终止反应。反应结束后取5微升产物于1%琼脂糖凝胶电泳，鉴定正确后采用胶回收试剂盒纯化聚合酶链式反应产物。4.纯化聚合酶链式反应产物TA克隆入载体pUCm-T载体
按pUCm-T载体PCR扩增试剂盒建立反应体系IOx缓冲液I微升，pUCm_T载体I微升，PCR产物3微升，T4 DNA连接酶I微升，加双蒸水至10微升，25 °C连接30分钟。连接产物转化到受体菌DH 5a感受态细胞，取100微升转化后的菌液铺于10毫升含600微克氨苄青霉素、800微克IPTG、80微克X-gal的肉汤蛋白胨琼脂平板，平放30分钟后，37°C倒置培养14小时。5.蓝白斑筛选
待蓝色充分显现，挑取白色菌落于10毫升含600微克氨苄青霉素的肉汤蛋白胨培养基，于37°C水浴锅中以200转/分钟速度振摇培养过夜，并扩增氨苄青霉素抗性克隆，质粒提取试剂盒小量抽提质粒。6.亚克隆入真核表达载体p⑶NA3. 1+鉴定正确后将重组质粒转化感受态大肠杆菌DH5 a，构建重组真核表达质粒pCDNA3. l+/Ag85A。7.从上述受体菌DH 5a中提取纯化pUCm_Ag85A，经Xho I及BamH I双酶切，回收小片段作为目的基因，将其亚克隆入真核表达载体P⑶NA3.1+同样经Xho I及BamH I双酶切后所回收的大片段。连接反应体系载体I微升，目的基因4微升，IOx缓冲液I微升，T4 DNA连接酶I微升，加双蒸水至10微升，4°C过夜。第二天取连接产物转化到受体菌DH 5a感受态细胞，挑取阳性克隆，抽提质粒行双酶切及测序鉴定。经PCR及双酶切证实成功构建了携带Ag85A基因的重组真核表达质粒p⑶NA3. l+/Ag85A，后者成功转化感受态大肠杆菌DH5 a。分别以17启动子引物和BGH通用序列对重组质粒进行正反双向测序，表明Ag85A DNA已被克隆到真核表达载体p⑶NA3. 1+中CMV启动子的下游，且插入后阅读框正确。经测序分析所克隆1141bp Ag85A与基因文库中结核分枝杆菌Ag85A核苷酸编码的氨基酸同源性为100%。二.薄膜分散法制备脂质体I.磷酸盐缓冲液的配制称取磷酸氢二钠0. 37克与磷酸二氢钠2. 0克，加蒸馏水溶解并稀释至1000毫升，调节该溶液PH值为5. 7。2.称取注射用豆磷脂0. 9克、胆固醇0. 3克，加入50ml容量的小烧杯中，加入无水乙醇2毫升，置于70°C水浴锅中，用玻璃棒搅拌使豆磷脂及胆固醇充分溶解，旋转该小烧杯使磷脂的乙醇液在杯壁上成膜，用吸耳球轻吹风，将乙醇挥发除去。3.将步骤二中第I点所述的磷酸盐缓冲液30毫升加入小烧杯中并将小烧杯置于70°C水浴锅中预热，20分钟后，将预热的磷酸盐缓冲液30毫升加入步骤二中第2点所制备的含有磷脂和胆固醇脂质膜的小烧杯中，70°C水浴中搅拌水化10分钟。随后将小烧杯置于磁力搅拌器上，室温下搅拌30分钟，如果溶液体积减少，可补加水至30毫升，充分混匀，即可得到脂质体。三.脂质体为运载体的结核分支杆菌Ag85A 口服DNA疫苗的制备·
将步骤二中第3点所述的溶液I. 5毫升加入5毫升离心管中，同时加入I. 5毫升的步骤一中第8点所述的重组真核表达质粒p⑶NA3. l+/Ag85A,将5毫升离心管置于漩涡混合器充分混合震摇5分钟后放入4 1冰箱静置2小时，使成均匀的DNA脂质体混悬液，取出5毫升离心管，充氮气后用胶塞密闭置于4 °C冰箱保存备用，此离心管中的混悬液即为结核分支杆菌Ag85A 口服DNA疫苗。
权利要求
1.一种结核分支杆菌Ag85A ロ服DNA疫苗的制备方法，其特征在于，所述方法包括重组真核表达质粒p⑶NA3. l+/Ag85A的构建、薄膜分散法制备脂质体、脂质体为运载体的结核分支杆菌Ag85A ロ服DNA疫苗的制备，具体过程为重组真核表达质粒p⑶NA3. l+/Ag85A的构建包括引物设计、结核分支杆菌H37Rv株接种改良罗氏培养基、聚合酶链式反应扩增Ag85A基因、纯化聚合酶链式反应产物TA克隆入载体pUCm-T载体、蓝白斑筛选、亚克隆入真核表达载体P⑶NA3. 1+鉴定正确后将重组质粒转化感受态大肠杆菌菌株DH5 a，构建重组真核表达质粒P⑶NA3. l+/Ag85A，从受体菌DH 5a中提取纯化pUCm_Ag85A，碱变性方法提取重组真核表达质粒PCDNA3. l+/Ag85A ;薄膜分散法制备脂质体包括磷酸盐缓冲液的配制及得到脂质体；脂质体为运载体的结核分支杆菌Ag85A ロ服DNA疫苗的制备包括将溶液I.5毫升加入5毫升离心管中，同时加入I. 5毫升的重组真核表达质粒p⑶NA3. l+/Ag85A,将5毫升离心管置于漩涡混合器充分混合震摇5分钟后放入4で冰箱静置2小时，使成均匀的DNA脂质体混悬液，取出5毫升离心管，充氮气后用胶塞密闭置于4で冰箱保存备用，此离心管中的混悬液即为结核分支杆菌Ag85A ロ服DNA疫苗。
2.根据权利要求I所述的ー种结核分支杆菌Ag85Aロ服DNA疫苗的制备方法，其特征在于，所述结核分支杆菌H37Rv株接种改良罗氏培养基，为37°C培养8周，小量抽提DNA为模板；聚合酶链式反应扩增Ag85A基因；为94°C预变性15分钟，热启动后转入94°C变性I分钟，60°C退火I. 5分钟，72°C延伸2分钟，进行30个循环，72°C延伸10分钟后终止反应，反应结束后取5微升产物干1%琼脂糖凝胶电泳，鉴定正确后采用胶回收试剂盒纯化聚合酶链式反应产物。
3.根据权利要求I所述的ー种结核分支杆菌Ag85Aロ服DNA疫苗的制备方法，其特征在于，所述纯化聚合酶链式反应产物TA克隆入载体pUCm-T载体按pUCm-T载体PCR扩增试剂盒建立反应体系10x缓冲液I微升，pUCm-T载体I微升，聚合酶链式反应产物3微升，T4 DNA连接酶I微升，加双蒸水至10微升，25で连接30分钟；连接产物转化到受体菌DH 5a感受态细胞，取100微升转化后的菌液铺于10毫升含600微克氨苄青霉素、800微克IPTG、80微克X-gal的肉汤蛋白胨琼脂平板，平放30分钟后，37°C倒置培养12-16小时；蓝白斑筛选待蓝色充分显现，挑取白色菌落于10毫升含600微克氨苄青霉素的肉汤蛋白胨培养基，于37°C水浴锅中以200转/分钟速度振摇培养过夜，并扩增氨苄青霉素抗性克隆，质粒提取试剂盒小量抽提质粒。
4.根据权利要求I所述的ー种结核分支杆菌Ag85Aロ服DNA疫苗的制备方法，其特征在于，所述受体菌DH 5 a中提取纯化pUCm-Ag85A，经限制性内切酶Xho I及BamH I双酶切，回收小片段作为目的基因，将其亚克隆入真核表达载体P⑶NA3. 1+同样经Xho I及BamH I双酶切后所回收的大片段；连接反应体系载体I微升，目的基因4微升，IOx缓冲液I微升，T4 DNA连接酶I微升，加双蒸水至10微升，4°C过夜；第二天取连接产物转化到受体菌DH 5a感受态细胞，挑取阳性克隆，抽提质粒行双酶切及测序鉴定；碱变性方法提取重组真核表达质粒p⑶NA3. l+/Ag85A,将所得质粒保存于pH8. 0 Tris盐酸缓冲液，使其终浓度为250微克/毫升。
5.根据权利要求I所述的ー种结核分支杆菌Ag85Aロ服DNA疫苗的制备方法，其特征在于，所述薄膜分散法制备脂质体包括 (I)磷酸盐缓冲液的配制称取磷酸氢ニ钠0. 37克与磷酸ニ氢钠2. 0克；加蒸馏水溶解并稀释至1000毫升，调节该溶液PH值为5. 7 ; (2)称取注射用豆磷脂0.9克、胆固醇0. 3克；加入50ml容量的小烧杯中，加入无水こ醇2毫升，置于65 70°C水浴锅中，用玻璃棒搅拌使豆磷脂及胆固醇充分溶解，旋转该小烧杯使磷脂的こ醇液在杯壁上成膜，用吸耳球轻吹风，将こ醇挥发除去； (3) 将步骤ニ中第I点所述的磷酸盐缓冲液30毫升加入小烧杯中并将小烧杯置于65 70°C水浴锅中预热，20分钟后，将预热的磷酸盐缓冲液30毫升加入步骤ニ中第2点所制备的含有磷脂和胆固醇脂质膜的小烧杯中，65 70°C水浴中搅拌水化10分钟；随后将小烧杯置于磁力搅拌器上，室温下搅拌30分钟，如果溶液体积减少，可补加水至30毫升，充分混匀，即可得到脂质体。
全文摘要
一种结核分支杆菌Ag85A口服DNA疫苗的制备方法，涉及一种疫苗的制备方法。据结核分枝杆菌Ag85A的基因序列设计一对PCR引物，以人型结核杆菌H37Rv标准毒力株的DNA为模板，经过PCR扩增出Ag85A基因，将回收的PCR产物用限制性核酸内切酶Xhol和BamHI双酶酶切后，经T4DNA连接酶作用，与真核载体pCDNA3.1+连接，得到的阳性克隆经DNA测序鉴定证实为Ag85A基因，被克隆到载体pCDNA3.1+中的CMV启动子的下游，构建重组质粒pCDNA3.1+/Ag85A.将转化大肠杆菌并使之扩增，制得结核杆菌Ag85A口服DNA疫苗，为口服DNA疫苗的临床应用研究奠定基础。
文档编号C12N15/31GK102784389SQ201210246838
公开日2012年11月21日 申请日期2012年7月17日 优先权日2012年7月17日
发明者姜燕 申请人:沈阳大学