专利名称：利用pCold-sumo表达载体高效表达PCV 2 Cap蛋白的方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种利用pCold-sumo表达载体高效表达猪圆环病毒2型(PCV2)的缺失核定位信号肽的Cap蛋白的方法。
背景技术：
猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type2,PCV2)是近年来新发现的一种重要病原微生物，该病毒被认为是断乳仔猪多系统衰竭综合征(Post-weaning multisystemicwasting syndrome,PMWS)的主要病原(Allan, Meehan et al. 1998)。PCV2 的感染，会使动物机体产生免疫抑制，使机体的免疫抵抗力下降，造成其它病原的继发感染，从而引起更加严重的临床症状。PCV2除了引起PMWS而外，还可导致猪皮炎/肾病综合征(Porcine dermatitis and nephropathy sundrome, PDNA)、猪呼吸道病复合症(Porcine respiratorydisease complex, PRDC)等相关疾病(Allan, McNeilly et al. 2000;Kim, Chung etal. 2003; Ramamoorthy and Meng2009)。PMWS自1991年首次在加拿大被发现，目前多个国家和地区存在该病的流行(Kennedy and Allanl998)。PCV2感染引起的相关疾病在我国的流行情况也十分严重(朗洪武，张广川等.2000;张朝霞，刘长明等.2008)。虽然目前市场上开始出现可以预防PCV2感染的疫苗，但是其价格高昂，大部分猪场无力使用，并且其质量参差不齐，猪场仍然无控制和消灭pCV2感染的有效措施。所以PCV2给我国养猪业造成了巨大的经济损失。PCV2基因组为单股环状负链DNA，全长为1767bp或1768bp。PCV2的基因组共编码11个开放阅读框架(open reading frames, ORFs),其中功能上重要的是ORFl和0RF2。ORFl 编码与病毒 DNA 滚环复制相关的 Rep 蛋白(Mankertz, Mankertz et al. 1998)。ORF2共有702个核苷酸，位于基因组互补链上，编码病毒的核衣壳蛋白，即Cap蛋白。Cap蛋白是PCV2病毒粒子唯一的结构蛋白，蛋白分子量大小约32kDa，同时也是PCV2主要的免疫原性蛋白。Cap蛋白的N端65 87aa、113 147aa、157 183aa区域及C端4个氨基酸为病毒的主要抗原位点。其中N端69 83aa和117 131aa两个抗原位点具有针对PCV2型特异性，能被PCV2多抗所识别，N端157 183aa抗原位点为PCVl和PCV2共同具有。虽然PCVl和PCV2的Cap蛋白存在一个共同的抗原位点，但血清学实验结果显示，两种血清型的Cap蛋白之间不存在抗原交叉性，这可能是因为整个Cap蛋白掩盖了其共同的抗原位点。Cap蛋白经体外表达后，能自我组装成类病毒样颗粒，具有PCV2病毒粒子的免疫学特性，在流行病学诊断及疫苗的研究中具有十分重要地位，因此Cap蛋白在体外的高效表达是PCV2的研究热点。Cap蛋白的N端有一段由41个氨基酸组成的核定位信号肽(nuclearlocalization signal,NLS) (Liu, Tikoo et al. 2001),该 NLS 核酸序列含有约 30% 的大肠埃希菌(E. coli)稀有密码子(Trundova and Celer2007),严重阻碍Cap蛋白在大肠埃希菌表达系统中的有效表达(Lou，Li et al.2011)。另外，目前Cap蛋白在原核表达系统中的表达情况多以包涵体形式表达(Kong, Kong et al.2011;赵玲，朱玲等.2011),对蛋白的纯化带来不便，其反应原性和免疫原性亦不如可溶性蛋白好。所以，目前Cap蛋白的体外有效表达、纯化是Cap蛋白应用于流行病学诊断及疫苗的研究中急需攻克的难点。
发明内容
为了克服现有方法中Cap蛋白表达量低、表达产物以包涵体形式存在给后续纯化带来诸多不便，以及表达产物的反应原性和免疫原性不如可溶性蛋白好等缺陷，本发明的目的在于提供一种利用pCold-sumo表达载体高效表达PCV2缺失核定位信号肽的Cap蛋白的方法，该方法能够高效表达可溶性的猪圆环病毒2型缺失核定位信号肽的Cap蛋白，并且表达产物的免疫学反应活性更佳。本发明的目的通过下述技术方案实现—种利用pCold-sumo表达载体高效表达PCV 2 Cap蛋白的方法,包括以下步骤 (I)抽提PCV2病毒的DNA ;根据PCV 2 0RF2的序列设计引物，扩增得到PCV2去核定位信号肽的Cap蛋白的基因片段；(2)将步骤(I)扩增得到的基因片段连接到pCold-SUMO质粒中，构建重组质粒pCold-SUMO-dCap ；(3)将重组质粒 pCoId-SUMO-dCap 转化大肠杆菌 ArticExpress Escherichiacoli,得到重组大肠杆菌Artic Exp. E. coli / pCold-Sumo-dCap ;然后对重组大肠杆菌Artic Exp. E. coli / pCold-Sumo-dCap低温诱导表达,表达产物经纯化后得到可溶性的sumo-dCap融合蛋白；步骤(I)所述的引物，其序列为引物PI : 5，-ATCAggatccAATGGCATCTTCAACACCCG-3，；引物P2 :5 ’ -ATCACTGCAGTTAAGGGTTAAGTGGGGGGTCTTT-3，；步骤(2)所述的将步骤(I)扩增得到的基因片段连接到pCold-SUMO质粒中，是将扩增片段插入到pCold-SUMO质粒的BamHI与PstI克隆位点；步骤(3)所述的重组大肠杆菌Artic Exp. E. coli/pCold-Sumo-dCap 已于 2012年5月4日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC 6080，分类命名是大肠埃希氏菌Escherichia coli ；步骤(3)所述的低温优选15°C ;步骤(3)所述的纯化是用NI-NTA树脂纯化。本发明的机理是由于PCV2主要抗原位点均不在Cap蛋白的NLS区域，NLS对PCV2主要起细胞核内定位作用，因而在表达Cap蛋白的过程中，本发明通过将NLS序列截除以实现Cap蛋白的有效表达。为了实现异源性蛋白在E. coli中的可溶性表达,各种表达元件被应用在蛋白表达过程中，包括增加启动子、融合标签，优化菌体生长环境，密码子优化等。其中融合标签的作用效果较为明显，例如SUMO标签及pET表达载体中的Nus、Trx、GST标签等。本发明通过选择带有SUMO标签的pCold-sumo表达载体以实现Cap蛋白在E. coli中的高效可溶性表达。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果I、本发明的方法能成功克服PCV2 Cap蛋白在大肠埃希菌中不表达或是表达量极低的难题。2、本发明方法表达的Cap蛋白主要以可溶性形式存在。3、本发明方法表达的Cap蛋白的纯化方法简单可行，纯化效果很好。4、Westernblot分析结果证明，本发明方法表达的Cap蛋白具有很好的免疫学反应原性，可以应用于流行病学诊断方法的建立及疫苗的研究。
图I是PCV2去NLS的Cap蛋白基因片段的PCR扩增凝胶电泳图；其中，M1-DNAMarker DL2000 ;1_PCR 扩增产物(约 579bp)。 图2是pCo I d-SUMO-dCap质粒的菌液PCR鉴定和双酶切鉴定凝胶电泳图；其中，Ml-DNA Marker DL2000 ;M2_DNA Marker DL15000 ; I-菌液 PCR 扩增产物(约 579bp);
2-BamHI、PstI 双酶切 pCold-SUMO-dCap 产物。图3是重组蛋白SUMO-dCap的SDS-PAGE分析图；其中，M-蛋白相对分子质量标准；l-pCold-SUM0-dCap未诱导对照；2-诱导的pCoId-SUMO空载体对照；3、4-pCold-SUMO-dCap诱导后菌体裂解沉淀；5-pCold-SUM0-dCap诱导后的菌体裂解上清；6-pCold-SUM0-dCap诱导后的菌体蛋白；7_纯化后的SUMO-dCap融合蛋白。图4是重组蛋白SUMO-dCap的Western Blot鉴定结果图；其中,M-蛋白相对分子质量标准；1_诱导的pCold-SUMO空载体上清；2_纯化的SUM0-d0RF2融合蛋白；3_纯化的d0RF2可溶性蛋白。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例—种利用pCold-sumo表达载体高效表达PCV 2 Cap蛋白的方法,包括以下步骤一、重组表达载体pCo I d-sumo-dCap的构建I、PCV2 的 DNA 的提取将PCV2毒株接种于无PCV污染的PK15细胞，于37°C的CO2培养箱培养，收集并处理细胞，根据OMEGA公司的Blood DNA Kit试剂盒说明书抽提PCV2的DNA，作为模板DNA。2、PCR引物设计根据PCV2 0RF2序列设计一对特异性引物，引物序列如下引物Pl :5，-ATCAGGATCCAATGGCATCTTCAACACCCG-3> ；引物P2 :5，-ATCACTGCAGTTAAGGGTTAAGTGGGGGGTCTTT-3，；扩增去核定位信号肽(NLS)的0RF2基因(579bp)。其中上游引物包含BamHI位点，下游引物包含PstI位点。引物由Invitrogen公司合成。3、去NLS的0RF2基因的扩增PCR 反应体系为 50 μ L，其中模板 DNA I. 5 μ L，引物 Ρ1、Ρ2 (20pmol / L)各I μ L, dNTP s (2. 5mmol / L) 4 μ L，10 X Ex Taq Buffer 5 μ L, Ex Taq DNA 聚合酶(5U/yL)0. 5yL，去离子水37yL。PCR反应条件为94°C预变性3min ;进入PCR循环，94°C变性30s，58°C退火45s，72°C延伸40s，进行30个循环后，72°C延伸IOmin。反应结束后，用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果(图1)，并对PCR产物进行胶回收纯化。4、重组质粒 pCold-SUMO-dCap 构建对纯化的PCR产物和pCoId-SUMO质粒分别进行BamHI、PstI双酶切，回收纯化酶切产物。用T4DNA Ligase酶连接去NLS的0RF2基因和pCold-SUMO质粒，将连接产物转化DH5a感受态细胞，通过PCR鉴定、双酶切鉴定、DNA测序鉴定筛选阳性重组质粒，获得pCold-SUMO-dCap 质粒(图 2)。二、融合蛋白SUMO-dCap的诱导表达与纯化将阳性重组质粒pCold-SUMO-dCap转入表达宿主菌大肠杆菌ArcticExpressEscherichia coli (购自Invitrogen公司)感受态细胞,挑选生长良好的单菌落,接入含 IOOmg / L氨苄青霉素的2mL LB液体培养基，37°C振荡培养10h，菌液PCR鉴定。将鉴定为阳性的培养物(即重组大肠杆菌Artic Exp. E. coli / pCold-Sumo-dCap)按1:100接种于含IOOmg / L氨苄青霉素的IOOmL LB液体培养基，37°C 180r / min振荡培养至OD6tltlnm约0.6，取出培养物冷却至15°C，再静置30min，加入适量IPTG至终浓度为0. 4mM,15°C 180r/min振荡培养20 24h。离心收集菌体沉淀，加5mL的菌体重悬缓冲液(20mM Tris-HCl ρΗ7·9，0·5Μ NaCl)重悬菌体沉淀，冰上静置30min，超声破碎菌体，超声破碎后产物12000r/min离心20min，收集上清。将上清进行Ni-NTA树脂亲和柱层析，加入30mL杂蛋白洗脱缓冲液A (20mMTris-HCl pH7.9，0. 5M NaCl，20mM咪唑)洗去部分杂蛋白，再加入4mL杂蛋白洗脱缓冲液B(20mM Tris-HCl pH7. 9,0. 5M NaCl，80mM咪唑)洗去其它杂蛋白，最后用3mL蛋白洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl pH7. 9,0. 5M NaCl,200mM Imidazole 咪唑)洗脱得到 SUMO-dCap 融合蛋白，质量浓度约I. 2mg/mL。结果显示构建成功的pCold-SUMO-dCap质粒能够高效表达去NLS的Cap蛋白，并且可溶性的SUMO-dCap融合蛋白表达量高，经过NI-NTA树脂亲和柱层析后纯化后，可以得到纯度较高的SUMO-dCap融合蛋白(图3)。Western blot分析表明SUMO-dCap融合蛋白具有很好的反应原性(图4)。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.ー种利用pCold-sumo表达载体高效表达PCV 2 Cap蛋白的方法,其特征在于包括以下步骤 (1)抽提PCV2病毒的DNA;根据PCV 2 0RF2的序列设计引物，扩增得到PCV2去核定位信号肽的Cap蛋白的基因片段； (2)将步骤(I)扩增得到的基因片段连接到pCold-SUMO质粒中，构建重组质粒pCold-SUMO-dCap ； (3)将重组质粒pCold-SUMO-dCap 转化大肠杆菌 ArticExpress Escherichia coli,得到重组大肠杆菌Artic Exp. E. coli / pCold-Sumo-dCap ;然后对重组大肠杆菌Artic Exp.E. coli / pCold-Sumo-dCap低温诱导表达,表达产物经纯化后得到可溶性的sumo_dCap融合蛋白； 步骤(I)所述的引物，其序列为引物 Pl :5，-ATCAGGATCCAATGGCATCTTCAACACCCG-3> ；引物 P2 :5’ -ATCACTGCAGTTAAGGGTTAAGTGGGGGGTCTTT-3，。
2.根据权利要求I所述的利用pCold-sumo表达载体高效表达PCV2 Cap蛋白的方法，其特征在于步骤(2)所述的将步骤(I)扩增得到的基因片段连接到pCoId-SUMO质粒中，是将扩增片段插入到pCold-SUMO质粒的BamHI与PstI克隆位点。
3.根据权利要求I所述的利用pCold-sumo表达载体高效表达PCV2 Cap蛋白的方法，其特征在于步骤(3)所述的低温为15°C。
4.根据权利要求I所述的利用pCold-sumo表达载体高效表达PCV2 Cap蛋白的方法，其特征在于步骤(3)所述的纯化是用NI-NTA树脂纯化。
全文摘要
本发明公开了一种利用pCold-sumo表达载体高效表达PCV 2 Cap蛋白的方法，该方法包括以下步骤抽提PCV 2病毒的DNA，扩增得到PCV 2去核定位信号肽的Cap蛋白的基因片段；将扩增片段连接到pCold-SUMO质粒中，构建重组质粒pCold-SUMO-dCap；将重组质粒转化大肠杆菌ArcticExpress Escherichia coli，然后低温诱导表达，表达产物经纯化后得到可溶性的sumo-dCap融合蛋白。本发明的方法能成功克服PCV 2 Cap蛋白在大肠埃希菌中不表达或是表达量极低的难题；本发明方法所表达的Cap蛋白主要以可溶性形式存在、纯化方法简单可行、纯化效果很好、具有很好的免疫学反应原性，可以应用于流行病学诊断方法的建立及疫苗的研究。
文档编号C12N15/70GK102839189SQ20121024863
公开日2012年12月26日 申请日期2012年7月18日 优先权日2012年7月18日
发明者樊惠英, 廖明, 陈春丽, 叶昱, 张 杰 申请人:华南农业大学