专利名称：miRNA-539及其反义核苷酸的用途和其药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种内源性的非编码小RNAs的新药用途，尤其涉及miRNA-539及其反义核苷酸在预防或治疗心脏疾病中的用途，属于心脏疾病的诊断、预防和治疗领域。
背景技术：
心血管疾病是人类健康和生命的主要威胁，是人类健康的头号杀手，全世界范围内每年有一千七百万人死于心血管疾病，其死亡率已接近所有癌症死亡 率的总和。在我国，随着人民生活水平日益提高和饮食结构的改变，心血管疾病死亡率呈明显上升趋势，已超过癌症成为第一大致死原因。根据国家卫生部2004年底公布的最新统计结果表明，我国18岁及以上居民高血压患病率为18. 8%，估计全国患病人数I. 6亿多，由此造成的心肌肥大、心肌梗死、冠心病、以及心力衰竭等凋亡相关心脏疾病的病人达几千万。目前关于心脏疾病发病机理尚不完全清楚，心脏疾病的预防、诊断和治疗尚不能达到让人满意的效果，急需开发新的技术、方法用于心脏病的诊断、防治。miRNA是新近研究发现的一类内源性非编码小RNA分子，许多研究表明miRNA对于维持心脏正常生理功能具有重要作用，心脏中的miRNA异常表达与许多心脏疾病的发生相关。因此，将miRNA作为心脏疾病治疗的靶点，开发相关药物具有潜在的临床应用价值。单一的miRNA可以同时作用于多个祀基因的mRNA的表达,这样药物作用于一个miRNA可以调节多个参与心脏发病基因的表达，影响多个信号通路，从整体上达到治疗疾病的目的。由于miRNA在心脏病理状态下表达水平不同，因此可以通过检测miRNA的表达水平来预测诊断疾病。细胞凋亡(apoptosis)，又称程序性细胞死亡，是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束生命的过程。它是一个主动的、高度有序的、由基因控制及一系列酶参与的过程，对正常胚胎发育，维持细胞群体及恶性病变过程中均起重要作用，在保证多细胞生物的健康生存过程中扮演着关键的角色。在许多心肌损伤或心脏病理状态下，如心肌缺血再灌注损伤、心肌肥大、心力衰竭等，心肌细胞会发生凋亡。由于成熟的心肌细胞不能分裂增殖，心肌细胞过度凋亡必然会使心肌细胞数目减少，这一点可能是一些心脏疾病发病的机理。目前研究发现许多miRNA通过调控凋亡相关靶蛋白的表达参与细胞凋亡的发生，这些miRNA有促凋亡的，也有抑凋亡的。寻找心脏中特异表达的、参与心肌细胞凋亡的miRNA，阐明其作用机理，对于开发以miRNA为策略的心脏疾病的诊断、治疗具有及其重要的意义和应用前景。
发明内容
因此，本发明的目的是确定或发现调控心肌细胞凋亡的心脏特异性性表达的miRNA，进一步确定其在心肌缺血再灌、心肌梗死、冠心病、心肌肥大和心肌纤维化等心脏疾病中的关键作用，将其应用到这些心脏疾病的诊断、防治中。针对上述目的，本发明的技术方案如下
一方面，本发明提供一种miRNA-539反义核苷酸，所述反义核苷酸的序列为下述SEQ ID NO: I所示的核苷酸序列5 ’ -CCUCUUUAAUAGGAACCACACA-3 ’，其中每一个碱基均进行了 2' -O-甲基修饰。又一方面，本发明提供本发明所述的miRNA-539反义核苷酸在制备用于预防或治疗心脏疾病的药物或试剂盒中的用途。还一方面，本发明提供一种miRNA-539在制备用于诊断和/或预后评估心脏疾病的药物或试剂盒中的用途，所述miRNA-539的序列为下述SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列5，-UGUGUGGUUCCUAUUAAAGAGG-3，。优选地，所述心脏疾病选自肌梗死、心肌缺血损伤、心肌肥大和心肌纤维化中的一
种或多种。另一方面，本发明提供一种用于预防或治疗心脏疾病的药物组合物，所述药物组合物含有本发明所述的miRNA-539反义核苷酸和药学上可接受的载体、病毒或辅料。优选地，所述miRNA-539反义核苷酸的含量为O. 5 lg/ml。优选地，所述载体选自壳聚糖、胆固醇、纳米颗粒和脂质体中的一种或多种。优选地，所述药物组合物以口服或注射方式给药。优选地，所述注射为静脉注射、肌肉注射、冠状动脉内注射或直接心肌注射。再一方面，本发明提供一种用于预防或治疗心脏疾病的心脏疾病的试剂盒，所述试剂盒含有本发明所述的miRNA-539反义核苷酸。还一方面，本发明提供一种用于诊断和/或预后评估心脏疾病的试剂盒，所述试剂盒含有miRNA-539核苷酸或用于特异性检测miRNA-539的探针或引物；所述miRNA-539的序列为下述SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列5，-腳⑶G⑶UCCUAUUAAAGAGG-3，；所述探针或引物为SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。优选地，所述心脏疾病选自肌梗死、心肌缺血损伤、心肌肥大和心肌纤维化中的一种或多种。本发明通过实验发现miRNA-539在心肌缺血损伤及缺氧诱导的心肌细胞凋亡过程中miRNA-539表达显著上调。通过转染和注射miRNA-539反义核苷酸抑制miRNA-539的表达可以抑制心肌细胞凋亡及心肌缺血损伤，心肌梗死面积减少。以上实验说明miRNA-539反义核苷酸通过抑制心肌细胞凋亡对心脏具有保护作用，miRNA-539反义核苷酸对许多心脏疾病具有潜在的预防和治疗价值。而给予miRNA-539升高miRNA-539的表达则可以诱导心肌细胞凋亡，心肌缺血损伤会更加严重。具体的，本发明人发现miRNA-539 反义核苷酸(5’ -CCUCUUUAAUAGGAACCACACA-3’ )通过抑制心肌细胞凋亡对心脏具有保护作用。心肌细胞缺氧或心肌缺血损伤过程miRNA-539表达显著上调，miRNA-539的上调可能诱导了心肌细胞凋亡的发生。miRNA-539在缺血再灌注动物模型的心肌组织中表达上调，miRNA-539可作为诊断心脏病的标志，抑制内源性的miRNA-539小鼠，可以抵抗心肌缺血再灌注损伤，心肌梗死面积减少，心功能显著改善。将miRNA-539反义核苷酸与适当的载体结合形成药物,导入心脏或体内，对许多心脏疾病将具有预防及治疗作用。可以考虑将miRNA-539反义核苷酸与壳聚糖、胆固醇、脂质体、纳米颗粒等包装形成药物分子，通过口服、静脉注射、肌肉注射、冠状动脉内注射或直接心肌注射的方式，用于防治心脏疾病、改善心脏功能、阻止心肌纤维化及心肌重构的发生。
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中图I表明心肌缺血损伤及缺氧处理(Anoxia)的心肌细胞凋亡过程中miRNA-539表达水平的变化，其中图IA表明原代心肌细胞缺氧处理miRNA-539表达水平，其中纵坐标表示以O分钟的miRNA-539表达量为基准，在心肌缺血损伤及缺氧处理过程中不同时间下miRNA-539的表达量；图IB表明小鼠心肌缺血损伤miRNA-539表达水平，其中纵坐标表示以O分钟的miRNA-539表达量为基准，在心肌缺血损伤及缺氧处理过程中不同时间下miRNA-539的表达量；图2表明抑制内源性的miRNA-539对心肌细胞凋亡的抵抗作用，其中图2A表示原代心肌细胞转染miRNA-539反义核苷酸(anta_539)抑制内源性的miRNA-539的表达；图2B 表示对缺氧诱导的心肌细胞凋亡的影响，转染NC作为阴性对照，其中纵坐标表示，在心肌细胞凋亡过程中以未加任何物质处理的心肌细胞中miRNA-539的表达为基准，不同样品中miRNA-539的表达量；图3表明miRNA-539反义核苷酸对心肌缺血损伤的抵抗作用；其中图3A为小鼠心肌注射miRNA-539反义核苷酸后实施心肌缺血再灌注手术的试验结果，ARR/LV表示危险区总面积/左心室面积，INF/AAR表示梗死区面积/危险区总面积，INF/LV表示梗死区面积/左心室面积，其中每组从左到右依次为未加任何物质处理的对照组I，经缺血再灌注的对照组II (Con)，经缺血再灌注的阴性对照处理组(NC)和经缺血再灌注的miRNA-539反义核苷酸处理组(Anta-539);图3B为小鼠心肌注射miRNA-539反义核苷酸后检测miRNA-539反义核苷酸对心肌梗死面积的试验结果，其中每组从左到右依次为未加任何物质处理的对照组I，经缺血再灌注的对照组II (Con)，经缺血再灌注的阴性对照处理组(NC)和经缺血再灌注的miRNA-539反义核苷酸处理组(Anta_539);图3C为小鼠心肌注射miRNA-539反义核苷酸后心肌凋亡的结果，其中以未加任何物质处理的作为对照组。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。除非特别指出，以下各实施例中涉及的各种实验材料，实验方法和操作，包括原代心肌细胞培养，感染心肌细胞的剂量，细胞转染，心脏缺血再灌手术步骤，Evans blue/TTC双染，TUNEL 检测均可参见以下文献Wang JX, et al, miR-499 regulates mitochondrialdynamics by targeting calcineurin and dynamin-related protein-1. 2011 January17:71-78。上述文献在此全文引入作为参考。除非特别指出，以下试验中所用的材料试验动物为小鼠，其品种为小鼠品种为C57/BL6，购自北京医科大学。除非特别指明，以下实施例中所用的酶如限制性内切酶、扩增酶和逆转录酶等，均购自北京博奥生物有限公司。除非特别指明，以下实施例中所用的引物均委托北京华大基因所合成。
除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯级试剂，且可从正规渠道商购获得。实骀例I心肌缺血及心肌细朐缺氣诱导的心肌细朐凋亡讨稈中miRNA-539表汰情况检测对于心肌细胞凋亡实验模型，采用本实验室已建立的方法培养大鼠乳鼠原代心肌细胞，低氧培养箱(氧浓度低于1%)培养不同时间，提取RNA，实时荧光定量PCR技术检测miRNA-539 (SEQ ID NO: 2 :5’-UGUGUGGUUCCUAUUAAAGAGG-3’)的表达水平，PCR 体系 25 μ 1，PCR 条件如下95 °C Imin—个循环；95 °C 15s, 56 °C 15sec, 72 °C Imin 共 28 个循环；最后72°C延伸5min，PCR引物设计如下，扩增片段约126bp (miRNA-539的全长编码序列SEQ IDNO:4，其序列为 TCACTCCCAAGAGGCCTATGGATGCTGGTATTCCTGCTGTGCTACTGTTTCATACTTGAGGAGAAATTATCCTTGGTGTGTTGGCTCTTTTGGATGAATCATACAAGGATAATTTCTTTTTGAGTA,其中标下划线的部分为上下游引物，下游引物与该序列的C末端序列反向互补)
上游引物5'-TCACTCCCAAGAGGCCTATGG-3' (SEQ ID N0:5),下游引物5'-TACTCAAAAAGAAATTATCCT-3 (SEQ ID N0:6) '。miRNA-539 表达水平在低氧处理4h-8h内显著上调(图1A)。本实验采用结扎大鼠冠状动脉建立心肌缺血模型，缺血不同时间取心脏缺血区及非缺血区心肌组织，提取总RNA，通过实时荧光定量PCR技术检测miRNA-539的表达水平，PCR 体系 25μ 1，PCR 条件如下95°C Imin—个循环；95°C 15s, 56°C 15s, 72°C Imin 共 28 个循环；最后72。。延伸5min)，扩增片段约126bp (SEQ ID N0:4), PCR引物设计如下上游引物5'-TCACTCCCAAGAGGCCTATGG-3' (SEQ ID NO:5)，下游引物5'-TACTCAAAAAGAAATTATCCT-3' (SEQ ID NO:6)。结果显示缺血30min-120min心肌缺血组织较非缺血组织及非缺血模型组miRNA-539表达水平显著上升(图1B)，其中以假手术组(sham)作为对照组。实验例2miRNA_539反义核苷酸抑制心肌细胞凋亡的实验本实验中使用原代培养的心肌细胞为模型。转染miRNA-539反义核苷酸(该序列由上海吉玛制药技术有限公司合成)(miRNA-539反义核苷酸序列是与miRNA-539序列完全反向互补的序列，5' -CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3' (SEQ ID NO: I，其中每一个碱基均进行了 W -O-甲基修饰。它可以与miRNA-539结合来抑制miRNA-539的表达)，转染实验方法可参看文章(Wang JX, et al, miR-499 regulates mitochondrial dynamics by targetingcalcineurin and dynamin-related protein-1. 2011 January 17:71-78)。转染 24 小时后，在低氧培养箱中培养处理细胞3小时，诱导细胞凋亡。台盼兰染色方法检测心肌细胞凋亡情况。结果见图2，结果显示抑制内源性miRNA-539可以显著抑制缺氧诱导的心肌细胞凋亡。实验例3miRNA_539反义核苷酸抑制心肌缺血损伤实验以C57/BL6小鼠为实验对象，每组8只小鼠，将测得的结果用one-way ANOVO统计软件进行统计学分析(参见 Wang JX, et al, miR-499 regulates mitochondrialdynamics by targeting calcineurin and dynamin-related protein-1. 2011 January17:71-78)，按照下述方法分别将30mg/kgmiRNA-539反义核苷酸(anta-539)和它的阴性对照(NC)注射小鼠(该miRNA是在，其中每一个碱基均进行了 2' -O-甲基修饰，即在核酸的2’端的羟基被甲氧基取代以增强核酸的稳定性。该修饰是由上海吉玛制药技术有限公司进行修饰的，其不抑制现有已知的任何基因的表达，其序列为SEQ ID NO:3 5' -CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3'，其中每一个碱基均进行了 W -O-甲基修饰)。小鼠称重并麻醉，仰卧位固定，剪毛并用碘酒消毒手术区。颈部正中切开气管并插管，连动物呼吸机进行正压通气，在胸骨左缘处及心脏搏动处纵行切开皮肤约3cm，逐层钝性分离皮下组织、肌肉，开胸，小心提起心包并剪开，充分暴露心脏。于磷酸盐缓冲液(PBS)中分别将按每只小鼠重量计算需要的反义核苷酸(anta-539)和它的阴性对照(NC)，稀释终体积为200 μ L，再分别通过26号导管从心尖进入动脉根部，注射同时夹闭主动脉及肺动脉，持续夹闭20秒。监测5min，待心脏恢复窦律后，清除胸腔内积血并用去针头注射器抽吸气体关闭胸腔。等小鼠清醒后，脱离呼吸机，放回笼中。心电图监测整个手术过程。注射反义核苷酸(anta-539)和它的阴性对照(NC) 3天后进行心脏缺血再灌注手术，具体操作如下小鼠麻醉后，背位固定于实验用木板上，并进行心电图监测。颈部正中切开气管并插管，连动物人工呼吸机，于第四肋间开胸，小心提起心包并剪开，充分暴露心脏、血管。在肺动脉圆锥和左心耳之间，以左冠状静脉主干为标志，于左心耳根部下方2_处进针，进针深度O. 5mm ;以6/0带针缝合线穿过心肌表层，在肺动脉圆椎旁出针；待心电图恢复·稳定IOmin后，予以结扎左冠状动脉前降支(LAD)。以I、aVL导联ST段弓背向上抬高大于O. Imv并持续O. 5h以上作为结扎成功的标志。缺血45min之后，松开结扎线开始再灌注。以ST段下降为标志。清除胸腔内积血并用去针头注射器抽吸气体关闭胸腔。再灌注24小时用Evans blue/TTC双染测定心肌梗死面积。结果显示注射miRNA-539反义核苷酸的小鼠I/R组心肌梗死面积比野生小鼠I/R组明显降低，有统计学差异(p〈0.01)，见图3A。心梗面积按如下方法计算左心室面积(left ventricle, LV)为蓝色、红色和白色面积之和；危险区总面积(area at risk, AAR)为红色和白色面积之和；梗死区面积(infarct area, INF)为白色面积。危险区面积(AAR/LV, %)=(危险区总面积/左心室面积)X 100%,心梗面积(INF/AAR，％)=(梗死区面积/危险区总面积)X 100%。同时又检测了注射miRNA-539反义核苷酸对I/R的凋亡的影响，用TUNEL检测(图3B)，结果显示miRNA-539反义核苷酸可显著抑制心肌缺血再灌注引起的心肌细胞凋亡的发生，其中以假手术组作为对照组。以上的结果说明小鼠经冠状动脉注射miRNA-539反义核苷酸可显著抑制心肌缺血再灌注损伤。
权利要求
1.一种miRNA-539反义核苷酸，所述反义核苷酸的序列为下述SEQ ID NO: I所示的核苷酸序列 5 ’ -CCUCUUUAAUAGGAACCACACA-3 ’，其中每一个碱基均进行了 2' -O-甲基修饰。
2.根据权利要求I所述的miRNA-539反义核苷酸在制备用于预防或治疗心脏疾病的药物或试剂盒中的用途。
3.—种miRNA-539在制备用于诊断和/或预后评估心脏疾病的药物或试剂盒中的用途，所述miRNA-539的序列为下述SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列 5’-腳⑶G⑶UCCUAUUAAAGAGG-3，。
4.根据权利要求2或3所述的用途，其特征在于，所述心脏疾病选自肌梗死、心肌缺血损伤、心肌肥大和心肌纤维化中的一种或多种。
5.一种用于预防或治疗心脏疾病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有权利要求I所述的miRNA-539反义核苷酸和药学上可接受的载体、病毒或辅料。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述miRNA-539反义核苷酸的含量为 O. 5 lg/ml。
7.根据权利要求5或6所述的药物组合物，其特征在于，所述载体选自壳聚糖、胆固醇、纳米颗粒和脂质体中的一种或多种。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物以口服或注射方式给药；优选地，所述注射为静脉注射、肌肉注射、冠状动脉内注射或直接心肌注射。
9.一种用于预防或治疗心脏疾病的试剂盒，所述试剂盒含有权利要求I所述的miRNA-539反义核苷酸。
10.一种用于诊断和/或预后评估心脏疾病的试剂盒，所述试剂盒含有miRNA-539核苷酸或用于特异性检测miRNA-539的探针或引物； 所述miRNA-539的序列为下述SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列 5’-腳⑶G⑶UCCUAUUAAAGAGG-3，； 所述探针或引物为SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列； 优选地，所述心脏疾病选自肌梗死、心肌缺血损伤、心肌肥大和心肌纤维化中的一种或多种。
全文摘要
本发明提供一种miRNA-539及其反义核苷酸的用途和其药物组合物，具体为所述miRNA-539反义核苷酸在制备用于预防或治疗心脏疾病的药物或试剂盒中的用途，所述miRNA-539反义核苷酸的序列为下述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列5’-CCUCUUUAAUAGGAACCACACA-3’，其中每一个碱基均进行了2′-O-甲基修饰；及miRNA-539在制备用于诊断和/或预后评估心脏疾病的药物或试剂盒中的用途。本发明说明miRNA-539反义核苷酸通过抑制心肌细胞凋亡对心脏具有保护作用，miRNA-539反义核苷酸对许多心脏疾病具有潜在的预防和治疗价值。
文档编号C12Q1/68GK102888403SQ20121025072
公开日2013年1月23日 申请日期2012年7月19日 优先权日2012年7月19日
发明者李培峰, 王昆 申请人:中国科学院动物研究所