一种改良Trizol法提取马铃薯块茎总RNA的方法
【专利摘要】本发明提供一种改良Trizol法提取马铃薯块茎总RNA的方法，该方法的特征在于用常规的Trizol法(Invitrogen公司)提取RNA后，加入苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)进行抽提一次，然后转移上清液至一新管，加入上清液0.7倍体积异丙醇和总体积0.2倍体积1mol/L醋酸钠进行沉淀RNA，所获得的RNA使用1mL?3mol/L醋酸钠(pH＝5.2)和1mL?75％乙醇各清洗一次，最后经过干燥，用DEPC水溶解，这种改良Trizol法提取马铃薯块茎总RNA获得率高，量大，并且质量好、纯度高，可以满足反转录、Northern杂交、基因体外翻译、cDNA文库构建、cDNA末端快速扩增等分子生物学研究。
【专利说明】—种改良Tr i zo I法提取马铃薯块茎总RNA的方法
一、【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种提取马铃薯块茎RNA的方法。
二、【背景技术】
[0002]马铃薯(Solaunm tuberosum L.)是世界上重要的粮食作物、工业原料和保健食品，尤其是块茎与人类的关系尤为密切，在马铃薯基因组序列测定后，研究块茎中基因的功能至关重要，而获得高纯度、高质量的RNA是进行Northern杂交、基因体外翻译、cDNA文库构建、cDNA末端快速扩增等分子生物学研究必要前提和关键。
[0003]马铃薯块茎中含有大量淀粉、多糖、多酚类物质以及较多次级代谢产物，会严重影响其总RNA提取质量，例如液氮研磨时块茎中的大量淀粉会失水成干粉状，加入变性液后干粉迅速吸水呈凝胶状，即使通过高速离心亦无法使其与液相分离，导致RNA被包裹其中而无法提取；而块茎中的多糖会使RNA沉淀难溶于水，或者溶解后成粘稠状，同时多糖可以抑制许多酶的活性；多酚类化合物在研磨后匀浆时会被释放出来，氧化后使匀浆液变为褐色，被氧化的酚类化合物(如醌类)能与RNA稳定地结合，从而影响RNA的分离纯化。
[0004]目前，总RNA提取方法很多，主要有异硫氰酸胍法、CTAB法、Chan法、SDS法、Logeman法、苯酹法、Trizol法等。DAVID等(1998)通过采用加有尿素的裂解液和氯化锂沉淀的方 法，从马铃薯块茎周皮组织中提取到高质量的RNA;杨建文等(2006)利用改进的异硫氰酸胍法提取到高质量的马铃薯块莖RNA ;赵宝勰等(2010)分别采用Chan法和Trizol法提取马铃薯块茎总RNA，结果表明:Chan法比Trizol法更适宜提取马铃薯块茎总RNA ;刘柏林等(2012)选用3种快捷的商品化提取试剂提取马铃薯块茎总RNA，结果表明:3种商品化试剂均可不同程度的提取马铃薯块茎总RNA，但纯度和浓度存在较大差异。Trizol法自问世以来，由于其操作简单方便，耗时较短，被广泛应用于组织的RNA提取，但它对于富含淀粉、多糖、多酚类物质以及较多次级代谢产物马铃薯块茎效果不理想。
三、
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于克服现有方法的缺点与不足，提供一种改良Trizol法提取马铃薯块茎总RNA的方法，该方法提取的马铃薯块茎总RNA获得率高，量大，并且质量好、纯度闻。
[0006]本发明的目的通过下述技术方案实现:一种改良Trizol法提取马铃薯块茎总RNA的方法，包含以下步骤:
[0007](I)取新鲜块茎加液氮研磨至粉末状，迅速转移到1.5mL离心管中，加入ImLTrizol试剂，充分混匀，25°C静置5min ；
[0008](2) 4°C, 12000r/min离心5min,直接倒上清入新1.5mL离心管中；
[0009](3)将步骤(2)收集的上清液中加入200 μ I氯仿，颠倒混匀，室温静置5min，4°C，12000r/min 离心 15min ；
[0010](4)将步骤(3)收集的上清至新1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，_20°C沉淀30min ；
[0011](5) 4°C, 12000r/min 离心 IOmin,弃上清，加入 ImL 75 % 乙醇洗沉淀，4°C, 8000r/min离心5min,弃上清，干燥；
[0012](6)将步骤(5)干燥的沉淀加入500 μ I DEPC水溶解，再加入500 μ I苯酚/氯仿/ 异戍醇(25: 24:1),颠倒混匀，4°C, 12000r/min 离心 20min ;
[0013](7)将步骤(6)收集的上清转移至新1.5mL离心管中，加入上清液0.7倍体积异丙醇和总体积0.2倍体积lmol/L醋酸钠，上下颠倒混匀；
[0014](8) _20°C沉淀 30min。4°C, 12000r/min 离心 20min,弃上清，加入 ImL 3mol/L 醋酸钠(PH = 5.2)清洗，4°C, 10000r/min 离心 5min ；
[0015](9)弃上清，用ImL 75 %乙醇洗涤沉淀，在超净工作台干燥，加入DEPC水溶解，-20°C储存备用。
[0016]RNA提取中所用的试剂和耗材均用DEPC进行处理。
[0017]综上所述改良Trizol法提取马铃薯块茎总RNA的方法适用于富含淀粉、多糖、多酚类物质以及较多次级代谢产物的植物组织的总RNA提取。
[0018]本发明相对于 现有Trzol法，具有如下的优点及有益效果:
[0019]本发明所述改良Trzol法提取马铃薯块茎总RNA的步骤虽然繁琐一些，时间较长一些，但是总RNA获得率高，量大，并且质量好、纯度高，可以满足反转录、Northern杂交、基因体外翻译、cDNA文库构建、cDNA末端快速扩增等分子生物学研究，例如利用本法提取的马铃薯块茎总RNA杂质较少，28S、18S和5S条带清晰，28S条带的亮度是18S条带的两倍左右，而常规Trizol法(Invitrogen公司)提取的电泳效果要差一些,28S条带的亮度并不是18S条带的两倍左右，杂质较多(附图1)，通过对两种方法提取的RNA进行纯度检测，发现改良Trizol法提取马铃薯块茎总RNA0D26Q/0D28Q比值在1.8-2.0之间，要明显高于常规Trizol法(Invitrogen公司)提取的INA样品(表1)，说明改良Trizol法提取RNA纯度较好，而常规Trizol法(Invitrogen公司)提取的RNA0D26(l/0D28(l比值低于1.8，说明有蛋白质和有机溶剂的污染，对于这4个样品的RNA0D26(i/0D23(i比值高于2，说明没有盐离子的残
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[0020]表1提取RNA样品的纯度检测
[0021]
【权利要求】
1.一种改良Trizol法提取马铃薯块茎总RNA的方法，其特征在于以下操作: a、取新鲜块茎约0.lg，加液氮研磨至粉末状，迅速转移到1.5mL离心管中，加入ImLTrizol试剂,充分混匀，25°C静置5min, 4°C, 12000r/min离心5min,直接倒上清入新1.5mL离心管中，加入200 μ I氯仿,颠倒混匀，室温静置5min, 4°C, 12000r/min离心15min,吸取上清至新1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，_20°C沉淀30min ； b、4°C,12000r/min 离心 IOmin,弃上清，加入 ImL 75 % 乙醇洗沉淀,4 °C, 8000r/min离心5min，弃上清，加入500 μ I DEPC水溶解沉淀，再加入500 μ I苯酚/氯仿/异戊醇(25: 24: I)，颠倒混匀，4°C，12000r/min 离心 20min ; C、吸取上清至新1.5mL离心管中，加入0.7倍体积异丙醇和0.2倍体积ImoVL醋酸钠，上下颠倒混匀，_20°C沉淀30min, 4°C, 12000r/min离心20min,弃上清,加入ImL 3mol/L醋酸钠(PH = 5.2)清洗，4。。，10000r/min离心5min，弃上清，75%乙醇洗沉淀； d、沉淀在超净工作台干燥，加入40 μ I DEPC水溶解，储存备用。
【文档编号】C12N15/10GK103540585SQ201210256346
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2012年7月15日 优先权日:2012年7月15日
【发明者】李立芹, 王西瑶, 王伟, 杨先泉, 倪苏, 刘帆 申请人:四川农业大学