专利名称：一种与倍半萜合成相关的蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种与倍半萜合成相关的蛋白及其编码基因与应用。
背景技术：
桃蚜是广食性害虫，寄主约有350多种，主要危害烟草、桃、李、梅、梨等果树和白菜、萝卜、辣椒、菠菜等蔬菜，造成了很大的经济损失。近年来，由于全球气候变暖、耕作制度变化等因素，使蚜虫的繁殖能力和适应性显著增强，其危害日趋严重。目前，蚜虫防治以喷洒农药为主，但大量使用农药，不仅对人畜有害，而且造成了严重的环境污染。培育抗蚜虫小麦和蔬菜品种是防止蚜虫危害的最有效途径，但由于现有种质资源中缺乏有效的抗蚜基因，抗性机制尚不明确，常规育种难以奏效。挖掘和利用新型抗蚜基因并通过基因工程培育小麦、棉花和蔬菜抗蚜新种质具有重要意义。 倍半萜类化合物在植物与植食性昆虫互作中发挥重要作用，参与植物的防御反应。法尼烯焦磷酸合成酶(farnesyl pyrophosphate synthase,FPS)是職类化合物合成途径中的关键酶之一，其催化合成的产物FPP可在细胞质中通过MVA(Mevalonate pathway)途径作为[反]-β -法尼烯(Ε)_β-farnesene, Εβ F合成酶的底物。E^F是重要的倍半職类化合物，是一种无色无味挥发物，是小麦麦长管姆(Sitobion avenae Fabricius)、禾谷纟益管姆(Rhopalosi phum padi Linnaeus)、麦无网长管姆(Metopolophium dirhodumWalker)和麦二叉姆(Schizaphis graminum Rondani)等姆虫报警信息素的唯一成份,可以使蚜虫产生骚动、从植株上脱落，并吸引蚜虫天敌，有效控制蚜虫危害。研究发现，许多植物中含有E β F合成酶，能释放E β F，具有天然的蚜虫驱避特性。但小麦、棉花、大豆等重要农作物中，只含有FPS，但不含有E β F合成酶。Yu等发现转E β F合成酶烟草表明E β F的释放量受前体物质FPP供应量的限制。目前已有20多种植物的FPS编码基因得到分离，但其在其它植物的表达和功能研究只有以下两例报道。Chen等利用农杆菌介导法所获得的转棉花fps基因的黄花蒿(Artemisia annua)的倍半職生物合成途径的代谢流明显增加,使抗痕类药物一青蒿素增加明显，部分株系比野生株系高4倍。崔红等将薄荷fps基因导入烟草发状根，抑菌试验发现转基因发状根汁液对赤星病菌具有抗性。小麦fps基因的分离克隆、表达特性、酶活特性和在植物中(拟南芥)的表达与抗蚜虫功能研究尚无报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种与倍半萜合成相关的蛋白及其编码基因。本发明提供的蛋白，是如下I)或2)的蛋白质I)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与倍半萜合成和/或驱避蚜虫相关蛋白的由I)衍生的蛋白质。
上述(a)或(b)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得至IJ。上述(b)中的蛋白的编码基因可通过将序列表中序列I所示的DNA序列缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表2所示的标签的编码序列得到。上述蛋白的氨基酸序列中一个或几个氨基酸残基的取代、替换和/或添加，有的是由于自然发生的变异引起的，有的是由人工诱变处理引起的。上述倍半萜为法尼醇和/或β -石竹烯；上述蚜虫为桃蚜。上述蛋白的编码基因也是本发明保护的范围。上述编码基因为为I) -4)中任--种I)序列表中序列I所示的DNA分子；2)序列表中序列I自5’末端第650-1129位核苷酸所不的DNA分子；3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA序列杂交且编码与倍半萜合成和/或驱避蚜虫相关蛋白的DNA分子；4)与I)或2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码与倍半萜合成和/或驱避蚜虫相关蛋白的DNA分子。上述严格条件为在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65° C下杂交，然后用2 X SSC, O. 1%SDS 和 I X SSC, O. 1%SDS 各洗膜一次。 扩增上述基因全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围。含有上述编码基因的重组载体或转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。上述重组载体为将上述编码基因插入到表达载体中，得到表达所述蛋白的载体。上述重组载体具体为如下I)或2):I)将序列表中序列I插入载体pEASY-El的EcoR V和BstX I酶切位点间得到的载体；2)将序列表中序列I插入载体PBI121的Xma I和Sac I间得到的载体。上述重组菌为将上述的I)所示的重组载体导入目的菌得到的重组菌；所述目的菌具体为大肠杆菌。上述蛋白或上述编码基因或上述重组载体或上述的重组菌在合成倍半萜和/或驱避蚜虫中的应用也是本发明保护的范围。上述应用中，上述倍半萜为石竹烯和/或法尼醇；上述蚜虫为桃蚜。本发明的第二个目的是提供一种培育释放倍半萜转基因植物的方法。本发明提供的方法，为将上述蛋白的编码基因导入目的植物得到转基因植物，所述转基因植物的倍半萜释放量高于所述目的植物；上述蛋白的编码基因具体通过上述2)所示的重组载体导入目的植物； 上述倍半萜具体为β -石竹烯；上述目的植物具体为双子叶植物或单子叶植物，上述双子叶植物进一步具体为拟南芥。本发明的第三目的是提供一种培育抗蚜虫转基因植物的方法。本发明提供的方法，为将上述蛋白的编码基因导入目的植物得到转基因植物，所述转基因植物的抗蚜虫能力高于所述目的植物；上述倍半萜具体为β -石竹烯；上述蛋白的编码基因具体通过上述2)所示的重组载体导入目的植物；上述目的植物具体为双子叶植物或单子叶植物，上述双子叶植物进一步具体为拟南芥。本发明的实验证明，本发明得到普通小麦Tafpsl 基因型中的Tafps-BlcDNA的核酸序列及Tafps-Bl编码蛋白序列，桃蚜可诱导苗期小麦Tafps-Bl基因在根中表达量降低，在茎表达量升高，其中在叶片中表达量显著升高(Ρ〈0. 05);抽穗期小麦Tafps-Bl基因在叶片(Ρ〈0. 01)和茎(Ρ〈0. 05)中的表达量显著升高，在幼胚中轻微升高，在颖壳中显著降低(Ρ〈0. 05 )，根中轻微降低，推测该基因与小麦对蚜虫侵害的应激抗性反应相关，具有防御反应诱导的表达特性。利用大肠杆菌中表达的TaFPS-Bl蛋白；发现其可以具有FPP合成活性，可催化前体化合物异戍基焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate, IPP)和香叶草基焦憐酸(geranyl pyrophosphate, GPP)合成法尼基焦憐酸(farnesyl pyrophosphate, FPP)；采用农杆菌介导法体获得转Tafps-Bl拟南芥，GC及GC-MS分析表明苗期转Tafps-Bl的拟南芥倍半萜β -石竹烯的释放量是野生型的5. 5倍；4通道嗅觉仪检测有翅桃蚜对花期转Tafps-Bl的拟南芥挥发物的反应表明转Tafps-Bl的植株对蚜虫有极其显著得驱避作用(Ρ〈0. 01)，与野生型拟南芥相比，转Tafps-Bl的植株可显著驱避蚜虫。表明普通小麦Tafps-Bl的编码区序列可应用于通过转基因技术提高小麦、棉花和蔬菜等农作物抗蚜性的研究。
图I为普通小麦Tafps-BlcDNA的PCR扩增图2为普通小麦接种蚜虫后Tafpsl基因表达量的变化图3为Tafps-Bl基因体外酶化反应产物法尼醇的鉴定图4为转Tafps-Bl的拟南芥的分子检测图5为GC及GC-MS对苗期转Tafps-Bl的拟南芥β -石竹烯的释放量的比较分析图6为4通道嗅觉仪检测有翅桃蚜对花期转Tafps-Bl的拟南芥挥发物的取食反应的比较图
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中野生型拟南芥Col-O 型(Cunillera N, Arro M, Delourme D, KarstF.,Boronat A.，FerrerA. 1996，Arabidopsis thaliana contains two differentiallyexpressed farnesyl-diphosphate synthase genes.Journal of BiologicalChemestry271 (13) :7774-7780.公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得)种植于中国农业科学院作物科学研究所人工气候箱中(温度(22 ± 2) °C,湿度60% — 80%，光周期L D=16 8)。下述实施例中桃姆记载Beale MH, Birkett MA, Bruce TJA, Chamberlain K, FieldLMj Huttly AK，Martin 几，Parker R，Phillips AL，Pickett JA，Prosser IMj ShewryPR, Smart LEj Wadhams LJj Woodcock CM，Zhang YH. 2006. Aphid alarm pheromone producedby transgenic plants affects aphid and parasitoid behavior. Proc Natl Acad SciUSA, 103(27)，10509-10513，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得；将蚜虫接种到拟南芥植株上(人工饲养)，温度(20±2) °C，湿度60%80%，光周期L D=16 8。下述实施例中质粒提取试剂盒购自Biomega公司，内切酶Xma I和Sac I购自NEB公司，高保真酶pfu、T-easy载体、大肠杆菌菌株DH5 α、反转录试剂盒购自北京全式金公司，rTaq DNA聚合酶购自TaKaRa公司，总RNA的提取试剂盒购自天根生化科技有限公司，去憐酸酶 Alkaline Phosphatase 购自 Promega (Catalog :M1821),底物 IPP (ProductNumber :10503)和GPP (Product Number :G6772)以及正己烧等其他化学试剂均购自sigma公司，其他化学试剂为国产分析纯，引物和测序均由北京华大基因完成。实施例I、普通小麦Tafps-BlcDNA的获得一、普通小麦Tafps-BlcDNA的获得·I、普通小麦总RNA的提取和cDNA的合成普通小麦的总RNA的提取参照天根生化科技有限公司RNA simple总RNA提取试剂盒中的说明手册提取。琼脂糖凝胶电泳检测并通过NanoDrop测定浓度。cDNA第一链的合成采用北京全式金生物技术有限公司的TransScriptFirst-Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒。方法参照试剂盒中的说明手册。具体操作如下第一链cDNA合成
权利要求
1.一种蛋白，是如下I)或2)的蛋白质 O由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； 2)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与倍半萜合成和/或驱避蚜虫相关蛋白的由I)衍生的蛋白质。
2.权利要求I所述蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述编码基因为1)-4)中任一一种 1)序列表中序列I所不的DNA分子； 2)序列表中序列I自5’末端第650-1129位核苷酸所不的DNA分子； 3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA序列杂交且编码与倍半萜合成和/或驱避蚜虫相关蛋白的DNA分子； 4)与I)或2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码与倍半萜合成和/或驱避蚜虫相关蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体或转基因细胞系或重组菌。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于所述重组载体为将权利要求2或3所述编码基因插入到表达载体中，得到表达所述蛋白的载体。
6.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于所述重组菌为将权利要求4所述的重组载体导入目的菌得到的重组菌；所述目的菌具体为大肠杆菌。
7.权利要求I所述蛋白或权利要求2或3所述编码基因或权利要求4或5所述重组载体或权利要求4或6所述的重组菌在合成倍半萜和/或驱避蚜虫中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述倍半萜为β_石竹烯和/或法尼醇；所述蚜虫为桃蚜。
9.一种培育释放倍半萜转基因植物的方法，为将权利要求I所述蛋白的编码基因导入目的植物得到转基因植物，所述转基因植物的倍半萜释放量高于所述目的植物； 所述权利要求I所述蛋白的编码基因具体通过权利要求4或5所述重组载体导入目的植物； 所述倍半萜具体为β_石竹烯； 所述目的植物具体为双子叶植物或单子叶植物，所述双子叶植物进一步具体为拟南芥。
10.一种培育抗蚜虫转基因植物的方法，为将权利要求I所述蛋白的编码基因导入目的植物得到转基因植物，所述转基因植物的抗蚜虫能力高于所述目的植物； 所述权利要求I所述蛋白的编码基因具体通过权利要求4或5所述重组载体导入目的植物； 所述倍半萜具体为β_石竹烯； 所述目的植物具体为双子叶植物或单子叶植物，所述双子叶植物进一步具体为拟南芥。
全文摘要
本发明公开一种与倍半萜合成相关的蛋白及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白，是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与倍半萜合成和/或驱避蚜虫相关蛋白的由1)衍生的蛋白质。本发明的实验证明，本发明得到普通小麦Tafps-B1cDNA的核酸序列及Tafps-B1编码蛋白序列；大肠杆菌中表达的TaFPS-B1蛋白具有FPP合成活性；采用农杆菌介导法体获得转小麦Tafps-B1基因拟南芥，结果表明转Tafps-B1的植株可显著驱避蚜虫。
文档编号C12N15/82GK102776159SQ20121025864
公开日2012年11月14日 申请日期2012年7月24日 优先权日2012年7月24日
发明者夏兰琴, 张彦, 马有志 申请人:中国农业科学院作物科学研究所