专利名称：苔藓PpDHN-31蛋白及其编码基因在提高植物抗旱性中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种苔藓PpDHN-31蛋白及其编码基因在提高植物抗旱性中的应用。
背景技术：
干旱严重制约植物的生长发育，常常造成各类农作物的大规模减产。在有限的水资源供给下，选择种植高耐逆性作物非常必要。分子育种是培育高耐逆性作物的一种行之有效的方法。该方法中最关键的技术瓶颈问题是有效抗旱基因的筛选与功能发现。苔藓植物是5亿年前出现的陆地先锋植物，生活史中配子体阶段较长，为主要营养组织。在配子体阶段，以具有假根、茎、叶的“茎叶体”为主。“茎叶体”叶片由单层细胞组 成，仅在其“中肋”处由少数几层细胞组成，无输导组织和气孔等调控水分代谢的组织结构，保留着明显的水生植物的特征。由于缺乏水分输导和调控系统，因此，当原始“苔藓植物”离水登陆时，必然首先面对两大胁迫水分亏缺、温度骤变。巨大的选择压力迫使苔藓植物进化出不同于维管植物(蕨类、种子植物)的干旱应对机制。事实表明苔藓植物的抗旱性远远高于维管植物，其细胞内的一些基因承担着应对严重干旱的责任。实验已经证明，这些基因可以保护细胞在脱水80%时免于干旱伤害。因此，这些苔藓基因是抗旱作物分子育种的重要“候选分子”。
发明内容
本发明的一个目的是提供苔藓PpDHN-31蛋白的新用途，该蛋白质的氨基酸序列如序列表序列I所示，所述新用途为序列表序列I所示蛋白可用于提高植物耐旱性，或提高序列表序列I所示蛋白表达量的物质或方法可用于提高植物耐旱性。本发明的另一个目的是提供一种提高植物耐旱性的方法，是将序列表序列I所示蛋白的编码基因导入目的植物中，得到耐旱性高于所述目的植物的转基因植物。在上述方法中，所述序列表序列I所示蛋白的编码基因为如下I)或2)或3)或4)的基因I)其核苷酸序列是序列表序列2所示的DNA分子；2)其核苷酸序列是序列表序列2中第62-934位所示的DNA分子；3)与I)或2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同一性且编码序列表序列I所示蛋白的DNA分子；4)在严格条件下与I)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码序列表序列I所示蛋白的DNA分子。序列表序列2的核苷酸序列长1008bp，是苔藓PpDHN-31蛋白的部分cDNA序列，序列表序列2中第62-934位为开放阅读框，编码序列表序列I所示的苔藓PpDHN-31蛋白。所述严格条件可为如下50°C，在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0. 5M Na3P04和ImMEDTA的混合溶液中杂交，在50°C，2XSSC，0. 1% SDS中漂洗；还可为50°C，在7% SDS,O. 5MNa3POJP ImM EDTA的混合溶液中杂交，在50°C，I X SSC，O. 1% SDS中漂洗；还可为50°C，在7% SDS,O. 5M Na3POdPlmM EDTA 的混合溶液中杂交，在50°C，O. 5X SSC, O. 1% SDS 中漂洗；还可为50°C，在 7% SDS,O. 5M Na3POdPlmM EDTA 的混合溶液中杂交，在 50°C，O. I X SSC,O. 1% SDS中漂洗；还可为50°C，在7% SDS,O. 5M Na3PO4和ImM EDTA的混合溶液中杂交，在65。。，O. 1XSSC,0. 1%SDS中漂洗；也可为:在6XSSC，0. 5%SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用 2 X SSC, O. 1% SDS 和 1XSSC,0. 1% SDS 各洗膜一次。在上述方法中，所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。在上述方法中，所述单子叶植物为水稻。实验证明，3个转PpDHN-31基因株系LI 1-6, L14-7和L14-10的水稻幼苗在含15%PEG-8000的1/2 Hogland液体培养基中(模拟轻度干旱)处理2天，再转移至含25%PEG-8000的1/2 Hogland液体培养基中(增加干旱强度)继续处理3天，复水5天 后可以恢复正常生长，而转空载体对照株系和野生型水稻日本晴(WT)植株大部分不能恢复生长；在开花灌浆期停止浇水15天至土壤严重干旱，复水30天后的植株存活数分别为92. 9%、100%和100%，而转空载体对照株系植株和野生型水稻日本晴(WT)的存活率均为27. 3% ;经上述开花灌浆期的干旱处理后转PpDHN-31基因株系Lll-6，L14-7和L14-10的主茎单穗总粒重分别为9. 7,12. 6和20. 5克，而野生型对照平均为I. I克。本发明为培育抗旱植物提供了一种新的途径，在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。
图I为小立碗藓(Physcomitrella patens)^叶体的突光差异凝胶电泳(DIGE)图谱。其中，图A为对照未经干旱处理，图B为经过干旱处理。图2为重组载体P⑶-PpDHN-31的T-DNA片段结构示意图。其中，LB和RB分别代表左边界和右边界，Hygromycin为潮霉素磷酸转移酶基因，35S为花椰菜病毒的启动子，Ubiquitin为玉米泛素启动子，PpDHN-31为插入的目的基因。图3为转PpDHN-31株系的PCR电泳图。其中，M为Marker，从上到下的片段依次为 2000bp、1000bp、750bp、500bp 和 250bp。图4为转PpDHN-31株系幼苗期的株高统计结果。图5为转PpDHN-31株系幼苗期的耐渗透胁迫结果。其中，图A为未经PEG-8000处理的对照结果，图B为经过PEG-8000处理结果。图6为转PpDHN-31株系成熟期的株高统计结果。图7为转PpDHN-31株系成熟期的植株生长状态。图8为成熟期的转PpDHN-31株系耐旱性的存活率统计结果。图9为成熟期的转PpDHN-31株系耐旱性的主茎单株总粒重统计结果。图3—9中，WT为野生型水稻日本晴，Lll-6、L14-7、L14-10分别代表3个转PpDHN-31的株系。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。小立碗藓(Physcomitrellapatens) Cui et al. Proteome analysis ofPhyscomitrella patens exposed to progressive dehydration and rehydration.Journal of Experimental Botany, 2012，63 (2) : 711-726 ;公众可从首都师范大学获得。水稻品种日本晴(Oryzasativa L. spp. japonica, cv. Nipponbare) Goffet al. A Draft Sequence of the Rice Genome(Oryza sativa L.ssp. japonica).Science. 2002, 296:92-100 ;公众可从首都师范大学获得。根癌农杆菌LBA4404 (Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404):中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心(Biovector Scicnce Lab Inc.).实施例I、苔藓抗旱相关蛋白PpDHN-31及其编码基因的获得将生长在BO)培养基上的小立碗藓(Physcomitrella patens)^叶体转移至浸湿的滤纸上，放入500ml烧杯中，用吸水纸封口。在温度24 ± I °C，相对湿度30 土 5%的培养室内进行干旱处理，3天后，取出干旱的茎叶体利用酚抽提法进行蛋白质提取，以未经干旱处理在正常条件下生长的茎叶体为对照。来自正常条件下和干旱条件下的蛋白质通过荧光差异凝胶电泳(DIGE)分离(具体步骤按照Amersham Bioscience提供的实验操作指南进行)，获得的蛋白质图谱用 DeCyder 2D Software,Version 6. 5 (Amersham Bioscience)进行分析。结果在干旱条件下有5个蛋白点在荧光差异凝胶电泳(DIGE)图谱中分别上调
3.75,3. 01,2. 90、I. 94、I. 59倍(图I)。将这5个蛋白点分别用胰蛋白酶处理，经质谱仪(MALDI T0F/T0F MS)和数据库(NCBI，小立碗藓基因组)鉴定后确认它们来自于同一个基因。该基因被命名为PpDHN-31，其编码的蛋白质命名为PpDHN-31。根据基因序列设计引物，以获得全长的cDNA。首先提取经上述干旱处理后的小立碗藓茎叶体总RNA，将RNA用逆转录酶合成cDNA。根据上述检索获得基因的CDS序列设计引物如下5’ -GGGGTACCACCGCATCCTGACATTT-3’ (下划线部分碱基为Kpn I识别序列)和5 ’ -CGCGGATCCACAACCGCATACACACA-3 ’ (下划线部分碱基为BamH I识别序列)。以反转录得到的cDNA为模板，进行PCR扩增，对PCR产物进行O. 8%琼脂糖凝胶电泳检测，得到分子量约为Ikb的条带，与预期结果相符。用琼脂糖凝胶回收试剂盒(TIANGEN)回收该片段。将该回收片段与PMD19-T Simple (Takara)连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，根据PMD19-T Simple载体上的羧卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的通用引物M13对其进行核苷酸序列测定，测序结果表明扩增得到序列表序列2所示的1008bp序列(命名PpDHN-31 )，其开放阅读框(ORF)为序列表中序列2的自5 '末端第62至934位脱氧核糖核苷酸，编码序列表序列I所示的蛋白质PpDHN-31。实施例2、转PpDHN-31基因培育耐旱植物I、表达目的基因的重组载体构建将序列表中序列3所示的玉米Ubiquitin启动子插入植物双元表达载体PCAMBIA1390 (Cambia)的Hind III和Pst I位点间，构成中间载体pC1390_Ubi。将实施例IPCR扩增获得约为Ikb的DNA片段用Kpn I和BamHl双酶切，正向插入中间载体pC1390_Ubi的Kpn I和BamH I位点间(插入的基因刚好位于Ubiquitin启动子后),得到重组载体。将经测序证实含有序列表中序列2的自5 ^末端第1-1008位脱氧核糖核苷酸的PpDHN-31基因的重组载体命名为P⑶-PpDHN-31 (其T-DNA片段的结构示意图如图2所示)。该载体具有卡那霉素和潮霉素两个筛选标记。2、转PpDHN-31基因植株的获得和鉴定将pQJ-PpDHN-31载体用电击法转入根癌农杆菌LBA4404 (Agrobacteriumtumefaciens strain LBA4404)中。挑取阳性克隆28°C培养。待农杆菌浓度达到0D600值为O. 120 O. 140之间时,用该菌液侵染水稻品种日本晴(Oryza sativa L. spp. japonica,cv. Nipponbare)愈伤组织，侵染30min，期间不时用手轻摇。将愈伤组织转移到共培养培养基上，避光共培养3 4d。共培养结束后，将愈伤组织转移到选择培养基上培养10 15d后继代一次。挑取从原愈伤组织表面生长出来的新的潮霉素抗性愈伤组织，转移到预分化培养基上，28°C黑暗下预分化培养7d。选择奶白色、表面光滑的愈伤组织转移到分化培养基上，28°C分化培养先在黑暗下培养3d，然后在持续冷光照下培养15 20d。将从抗性愈伤组织再生出的幼苗转移到根诱导培养基上，持续光照培养15d，生长状况良好的幼苗直接转移到大田种植。当年秋季收获转基因水稻种子。
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种子收获后，播于含潮霉素(30mg/L)的MS筛选培养基上筛选。待Tl代植株长至4-6叶时移到大田中生长。将Tl代单株收获后，各单株种子分别播种，用潮霉素继续筛选以观察T2代的分离情况，如此重复数代直至获得稳定的转PpDHN-31株系。按照获得转PpDHN-31株系的方法将空载体pC1390_Ubi导入水稻品种日本晴(Oryza sativa L. spp. japonica, cv. Nipponbare)中，制备得到稳定的转空载体对照株系。3、转PpDHN-31株系植株的PCR鉴定选择稳定遗传的转PpDHN-31株系中的3个株系(Lll-6，L14-7和L14-10)，进行PCR验证。用CTAB法提取水稻基因组DNA，使用正向引物(5 ' -GAATGAGAACTTCGGTGGGT-3/ )和反向引物(5' -ATTGACAGAAGAGTGGAGGAGCCCG-3')进行 PCR 扩增。上述 3 个株系中均可扩增出497bp的目的条带(图3)。4、转PpDHN-31株系植株的耐旱性鉴定以转空载体对照株系和野生型水稻品种日本晴(Oryza sativa L. spp. japonica,cv. Nipponbare) (WT)为对照株系，在水稻幼苗期检测转PpDHN-31基因株系(Lll-6，L14-7和L14-10)的株高和耐渗透胁迫性，在成熟期检测水稻幼苗期检测转PpDHN-31基因株系(Lll-6, L14-7和L14-10)的株高和抗旱性，方法和结果如下I)幼苗期植株性状及耐渗透胁迫性鉴定培养室内，在1/2 Hogland液体培养基中培养水稻幼苗，统计2周龄幼苗株高。结果在幼苗期，转PpDHN-31株系Lll-6，L14-7和L14-10植株表现出的非常好的生长一致性，但株高比转空载体对照株系和野生型对照植株分别下降约3. 5%、12. 5%、7. 3% (图4，空载体对照和野生型对照植株表型一致，省略了空载体对照图)。培养室内，将2周龄水稻幼苗在含15% PEG-8000的1/2 Hogland液体培养基(即每IOOml培养液含15g PEG-8000)中处理2天，再转移至含25% PEG-8000的1/2 Hogland液体培养基(即每IOOml培养液含25g PEG-8000)中继续处理3天，观察复水5天后的植株状态，以未经PEG-8000处理在1/2 Hogland液体培养基中生长的处理为对照。结果在幼苗期，转空载体对照株系和野生型水稻(日本晴)(WT)植株大部分不能恢复生长，而3个转PpDHN-31基因株系Lll-6，L14-7和L14-10可以恢复正常生长(图5)，表明在幼苗期，转PpDHN-31基因株系植株表现出较好的抗渗透胁迫能力。2 )成熟期植株性状及抗旱性鉴定在田间大棚中种植水稻于营养土中，于灌浆期统计株高。结果在灌浆期，2个转PpDHN-31株系植株L11-6和L14-7的株高比野生型对照植株下降约11. 3%、15. 6%，但另I个转PpDHN-31株系植株(L14-10)的株高却比野生型对照植株增加了 7. 8% (图6，图7)。在田间大棚中种植水稻于营养土中，在开花灌浆期停止浇水15天至土壤严重干旱，水稻叶片全部因缺水而卷曲。复水30天后统计植株存活数和主莖的单穗总粒重。实验共设三次重复，每次重复中，所测试的各株系植株分别为15株。结果转空载体对照株系植株和野生型水稻(日本晴)(WT)的存活率均为27. 3%，而转PpDHN-31基因的株系L11-6、L14-7和L14-10的存活率分别为92. 9%、100%、100%(图7和图8，转空载体对照株系植株和野生型对照植株表型一致，省略了转空载体对照株系植株图)。统计水稻主茎单穗总粒重， 野生型对照平均为I. I克，而上述3个转PpDHN-31基因的株系Lll-6、L14-7和L14-10的平均主茎单穗总粒重分别为9. 7、12. 6和20. 5克(图9)。上述结果表明转PpDHN-31基因植株的株形、抽穗时期与转空载体对照株系和野生型对照并没有明显差别，但其耐旱性明显优于转空载体对照株系和野生型对照植株。苔藓PpDHN-31蛋白及其编码基因PpDHN-31可明显提高植物的耐旱性。
权利要求
1.序列表序列I所示蛋白在提高目的植物耐旱性中的应用。
2.一种提高植物耐旱性的方法，是将序列表序列I所示蛋白的编码基因导入目的植物中，得到耐旱性高于所述目的植物的转基因植物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述序列表序列I所示蛋白的编码基因为如下I)或2)或3)或4)的基因 1)其核苷酸序列是序列表序列2所示的DNA分子； 2)其核苷酸序列是序列表序列2中第62-934位所示的DNA分子； 3)与I)或2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同一性且编码序列表序列I所示蛋白的DNA分子； 4)在严格条件下与I)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码序列表序列I所示蛋白的DNA分子。
4.根据权利要求1-3中任一所述的应用或方法，其特征在于所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。
5.根据权利要求4所述的应用或方法，其特征在于所述单子叶植物为水稻。
全文摘要
本发明公开了一种苔藓PpDHN-31蛋白及其编码基因在提高植物抗旱性中的应用。实验证明，转PpDHN-31基因株系与转空载体对照株系和野生型水稻日本晴(WT)植株相比，具有抗渗透胁迫能力，且在开花灌浆期停止浇水15天至土壤严重干旱，复水30天后的植株存活率达92.9%—100%，明显高于转空载体对照株系植株和野生型水稻日本晴(WT)的27.3%；经上述开花灌浆期干旱处理后转PpDHN-31基因各株系主茎单穗总粒重为9.7—20.5克，而野生型对照平均为1.1克。本发明为培育抗旱植物提供了一种新的途径，在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。
文档编号C12N15/84GK102776229SQ201210263008
公开日2012年11月14日 申请日期2012年7月26日 优先权日2012年7月26日
发明者何奕騉, 崔素霞, 张治国, 李利, 李幼英, 蔺平亮, 路铁刚, 陈希 申请人:首都师范大学