专利名称：生长因子基因药物在应激性胃肠损伤防治中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞生长因子基因药物在应激性胃肠损伤防治中的应用，特别涉及低氧诱导因子-1 α (hypoxia-inducible factor-1 α，HIF-I α )和角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor, KGF)的联合在预防和/或治疗应激性胃肠损伤疾病中的应用，更特别涉及其在预防和/或治疗急性应激致胃肠损伤疾病中的应用。
背景技术：
胃肠黏膜是营养物质消化、吸收的重要场所，然而多种应激因素，包括病原微生物
因素、物理因素、化学因素、机械性因素等多种因素，作为应激源均易引起胃肠道黏膜损伤。同时胃肠黏膜屏障作为应激反应的中心器官之一，參与多种疾病的发生、发展和转归，其损伤的机制包括胃肠黏膜缺血、缺氧及氧自由基的损伤、细胞因子的损伤、肠道免疫功能受损和细胞凋亡。其中缺氧是造成胃肠黏膜损伤的关键，尤其是在高海抜地区，与低海抜地区相比，气候有很大不同，低压、缺氧、寒冷、干燥、辐射强、气候多变，这些因素尤其是缺氧，对进入高海抜地区的人群造成不同程度的胃肠道应激性急性损伤。此外，由于气候环境的影响，高海抜地区疾病的发生、发展具有独特的特征，胃肠黏膜屏障參与多种高原疾病的发生、生发展和转归，其急性应激损伤后，轻者产生急性炎症反应，影响动物营养物质的吸收，胃肠道菌群失调，产生毒素；重者，胃肠道黏膜形成溃疡，甚至穿孔，从而严重影响人们的生活质量，甚至威胁人的生命。另外急性应激性胃肠道损伤常作为其他许多疾病的继发症状出现，其对其他疾病的发展、转归有着重要的决定作用。总之，急性应激性胃肠道损伤对人类的健康造成了极大的威胁。因此胃肠道急性应激性损伤疾病的防治，尤其是高海拔胃肠道急性应激性损伤疾病的防治显得至关重要。当前胃肠黏膜损伤的治疗手段主要有抗生素、微生态制剂、肠外营养、中药，虽然以上各种治疗方法具有一定的治疗效果，但未从源头改变损伤部位缺氧环境；且由于胃肠黏膜屏障的损伤，吸收功能会大大降低，有效的药效浓度很难控制和維持；使胃肠黏膜损伤的修复不尽如意。而对原本缺氧高海拔的环境下的胃肠应激损伤的防治更是显得无力。因此，研究新型的、高效的防治胃肠应激性损伤的药物尤其是防治高海抜胃肠应激性损伤的药物成为当今生命科学亟待解决的问题。
发明内容
为了解决上述问题，即预防和/或治疗胃肠道应激性损伤，本发明人作了不懈的努力。结果意外地发现，低氧诱导因子-la (HIF-Ia)和角质细胞生长因子(KGF)的联合对于急性应激性胃肠道损伤性疾病具有甚为良好的治疗效果。具体地说，本发明人发现，含有同时携带并可在真核细胞中表达HIF-Ia基因和KGF基因的重组载体的重组减毒沙门氏菌制剂在经ロ服之后，可以将HIF-I α基因和KGF基因两者转染到胃肠组织细胞，表达HIF-I α和KGF活性蛋白，从而对急性应激性胃肠道损伤性疾病特别是缺氧应激致胃肠道损伤性疾病及其他急性应激因素致胃肠道损伤性疾病起到良好的防治效果。此外，通过急进高海抜地区建立缺氧应激致胃肠道损伤模型，并通过ロ服含有同时携带并可在真核细胞中表达HIF-I α和KGF基因的重组载体的减毒沙门氏菌制剂进行治疗，取得了良好的治疗防治效果。此外，本发明人还发现，HIF-Ια和KGF的联合对其他急性应激因素致胃肠道损伤如急性应激性溃疡性结肠炎、急性应激胃溃疡均具有良好的防治效果。基于以上发现，本发明人完成了以下发明。概括地说，本发明第一方面提供了 HIF-I α和KGF联合用于制备预防和/或治疗急性应激性胃肠道损伤性疾病的药物中的用途。
在一个优选的实施方案中，所述HIF-I α和KGF以携带HIF-I α和KGF基因的重组质粒或重组减毒沙门氏菌的形式提供。本发明第二方面提供了ー种重组载体，其同时携带并可在真核细胞中表达HIF-I α基因和KGF基因。在一个优选的实施方案中，所述载体为同时携带并可在真核细胞中表达表达HIF-I α基因和KGF基因的pIRES质粒。本发明第三方面提供了ー种重组细菌，其含有本发明第二方面所述的重组载体。在一个优选的实施方案中，所述重组细菌为重组减毒沙门氏菌。本发明第四方面提供了ー种药物组合物，其包含治疗有效量的HIF-Ia和KGF，或者包含治疗有效量的本发明第二方面所述的重组载体，或者包含治疗有效量的本发明第三方面所述的重组细菌。在一个优选的实施方案中，所述药物组合物为含有同时携带并可在真核细胞中表达HIF-I α和KGF基因的pIRES质粒或者含有所述质粒的重组减毒沙门氏菌Ty21a。通过采用本发明的重组质粒或者重组减毒菌，可以有效地治疗急性应激性胃肠道损伤性疾病，特别是缺氧应激致胃肠道损伤性疾病，如高原应激反应、及其他急性的全身或胃肠道局部缺血缺氧性疾病引起的急性胃肠道损伤。
图I示出KGF基因的PCR扩增产物的电泳結果。图2示出pIRES-HIF-Ι α基因质粒酶切鉴定結果。图中，M为250 bp DNA LadderMarker, I 为 piRES 质粒，2 为 pIRES-HIF-l α，3 为 Nhe I 酶 /Mlu I 酶酶切产物。图3 示出 pIRES-HIF-1 a-KGF 酶切鉴定結果。图中，M 为 250 bp DNA LadderMarker, I 为 piRES 质粒，2 为 pIRES-HIF-l a -KGF, 3 为 Xba I/Not I 酶酶切产物，4 为 Nhel酶/Mlu I酶酶切产物。图4示出用重组减毒沙门氏菌TPHK治疗的溃疡性结肠炎大鼠的结肠的一般形态学观察結果。图5示出用重组减毒沙门氏菌TPHK防治的溃疡性结肠炎大鼠的结肠的组织病理学观察結果。图6示出用重组减毒沙门氏菌TPHK防治的高海拔缺氧肠应激损伤大鼠的小肠的组织病理学观察結果。图7示出用重组减毒沙门氏菌TPHK防治的高海拔缺氧肠应激损伤大鼠的血浆丙ニ醛(MDA)的含量检测結果。图中，舞 vs N(^i，P<0.01;1#vsT(^i，P<0.01;fvsPTPH组，P < O. 01, · vsPTPK 组，P < O. 01 ;O vsTTPH 组，P < O. 05。图8示出用重组减毒沙门氏菌TPHK防治的高海拔缺氧肠应激损伤大鼠的血浆超氧化物歧化酶(SOD)的活力检测結果。图中，来vs NC组，P < O. 01，合vsTC组，P < O. 01 ；ψ vsPTPH 组，P < O. 01, · vsPTPK 组，P < O. 01 ；# vsTTPH 组，P < O. 01, ★ vsTTPK 组，P
<O. 01。图9示出用重组减毒沙门氏菌TPHK防治的高海拔缺氧肠应激损伤大鼠的肠组织中丙ニ醛(MDA)的含量检测結果。图中パ灰vs NC组，P < O. 01 ；φ vsTC组，P < O. 01 ；Q vsPTPH 组，P < O. 05, ψ' vsPTPH 组，P < O. 01 vsTTPH 组，P < O. 01, ★ vsTTPK 组，P
<O. 01。图10示出用重组减毒沙门氏菌TPHK防治的高海拔缺氧肠应激损伤大鼠的肠组织
中超氧化物歧化酶(SOD)的活力检测結果。图中，U vsTTPH组，P < O. 05，来vs NC组，P
<O. 01，要 vsTC 组，P < O. 05 ;# vsTC 组，P < O. 01 ;擎 vsPTPH 组，P < O. 01， · vsPTPK组，P < O. 01 vsTTPH 组，P < O. 01, ★ vsTTPK 组，P < O. 01。图11示出采用ELISA检测用重组减毒沙门氏菌TPHK防治的高海拔缺氧肠应激损伤大鼠的肠组织中的KGF和HIF-Ia的表达結果。图中，来vs NC组，P < O. 01，螽vsTC组，P < O. 01 灣 vsPTPH 组，P < O. 01, · vsPTPK 组，P < O. 01 ;φ vsTTPH 组，P < O. 05 ；#vsTTPH 组，P < O. 01, ★ vsTTPK 组，P < O. 01。图12示出用重组减毒沙门氏菌TPHK防治的应激性胃黏膜溃疡大鼠的胃的一般形态学观察結果。图13示出用重组减毒沙门氏菌TPHK防治的应激性胃黏膜溃疡大鼠的胃的病例组织学观察結果。图 14-17 分别是是 pIRES、pIRES-HIF-l a、piRES-KGF, pIRES-HIF-l a -KGF 的质粒图。序列说明SEQ ID NO :1 :人 HIF-1 α 正向扩增引物SEQ ID NO :2:人 HIF-I α 反向扩增引物SEQ ID NO 3 :人 HIF-1 a cDNA 序列SEQ ID NO :4 :人KGF正向扩增引物SEQ ID NO :5 :人KGF反向扩增引物SEQ ID NO :6 :人 KGF cDNA 序列SEQ ID NO :7 :重组质粒 pIRES-HIF-l α 序列SEQ ID NO 8 :重组质粒 pIRES-HIF-l a -KGF 序列SEQ ID NO 9 =CMV 正向扩增引物SEQ ID NO 10 CMV 反向扩增引物SEQ ID NO 11 :人 β-actin 正向扩增引物SEQ ID NO :12 :人 β -acti 反向扩增引物SEQ ID NO 13 :重组质粒 pIRES-KGF 序列
具体实施方式
如上所述，本发明人在寻求对急性应激性胃肠道损伤的治疗和/或预防方法的过程中，意外地发现，低氧诱导因子-Ia即HIF-Ια和角质细胞生长因子即KGF的联合对于急性应激性胃肠道损伤性疾病具有甚为良好的治疗效果。因此在本发明第一方面，提供了 HIF-Ια和KGF联合用于制备预防和/或治疗急性应激性胃肠道损伤性疾病的药物中的用途。“低氧诱导因子-1 α ” 或“ HIF-1 α，，是 Semenza (Semenza GL, Wang GLMol CellBiol，1992，12u2) :5447-5454. A nuclear factor induced by hypoxia via de novoprotein synthesis binds to the human erythropoietin gene enhancer at a siterequired for transcriptional activation.)于1992年在低氧诱导的肝细胞癌細胞株Hep3B细胞的核提取物中发现的ー种蛋白质，它能与人红细胞生成素(erythropoietin，ΕΡ0)基因的V端增强子的寡核苷酸序列特异性結合，促进EPO转录。HIF-I属于低氧诱导因子蛋白家族(HIF)。HIF-I α是受氧浓度调节的重要因子，在氧浓度低于6 %时(相
当于氧分压在46 mmHg)，HIF- α成倍增加，迅速达到最大值，并与HIF-I β形成结构稳定的HIF-I分子。HIF-Ia随着缺氧时间的延长而被大量激活。HIF-I是机体細胞在低氧环境中产生的一种结合DNA蛋白质因子，在低氧信号转导中起到ー个重要的中介作用。在缺氧条件下，HIF促进对一系列的低氧反应基因(hypoxia repensive gene, HRG)(袁源、钟竑.现代生物医学进展.2010，10(5)961-963.缺氧诱导因子-1结构及功能的研究进展)进行转录调节，从而产生一系列的生理适应红细胞生成增多，携氧能力增强；血管再生和重建；糖酵解能力增强，使无氧条件下ATP生成增多，以满足组织細胞的能量代谢，同时激活细胞的自嗷(autophagy) (Junichi Sadoshima. Landes Bioscience, 20084 (4), 402-403.ihe role of autophagy during ischemia/reperfusion ；Marco T,Luana S,Tahira A，etal.Landes Bioscience,2008,4(8) : 1042-1053. Induction of autophagic cell death bya novel molecule is increased by hypoxia ；Chen YQ, Elizabeth S. H, Jeannick C，etal.Landes Bioscience,20084(2) :195-204. Hypoxia induces autophagic cell death inapoptosis-competent cells through a mechanism involving BNIP3 ；Zhang HF，MartaBosch-M，Larissa A. S，et al. The journal of biological chemistry，2008，283(16)10892-10903. Mitochondrial Autophagy Is an HIF-l-dependent Adaptive MetabolicResponse to Hypoxia.),增强细胞在缺氧条件下的能力，为损伤肠粘膜的修复争取更多的时间。“角质生长因子”或“KGF” 是由 Rubin (Rubin JS, Osada H, Finch Pff, Proc. Natl.Sci. U. S. A. 1989 86 :802-806. Acad.)等首先从人胚胎肺成纤维细胞M426的培养液中分离纯化出来的细胞因子，具有促进小鼠角质细胞有丝分裂的作用。该因子从属于成纤维细胞生长因子(FGF)家族，又称为FGF-7。KGF是各种上皮组织来源细胞特异性的旁分泌介质，其主要活性是通过间质上皮相互交流的作用方式促进上皮细胞的増殖、移行、分化。KGF在整个胃肠系统中均有表达，具有刺激胃肠系统的上皮细胞的増殖和分化的功能，对保持胃肠系统粘膜的完整性和促进损伤修复有很重要的作用。早期体外研究显示，KGF刺激角质细胞DNA合成的能力比转化生长因子TGF-α和表皮生长因子EGF强2_10倍。而在上皮发生损伤时其表达量会迅速増加。将这两种因子联合起来，本发明人惊喜地发现，它们可以有效地治疗急性应激性胃肠道损伤性疾病，并且与分别单独使用所述两种因子相比具有协同效应。正如下文实施例部分所详细记载，在将HIF- α和KGF同时给予有溃疡性结肠炎大鼠(參见实施例4、图4和图5)、高海拔缺氧应激肠损伤大鼠(參见实施例5、图6、图7、图8、图9和图10)和应激性胃黏膜溃疡大鼠(參见实施例6、图12和图13)后，其组织学宏观和微观结构和生化指标均得到显著改善。本发明中使用的术语“低氧诱导因子-Ia ”或“ HIF-Ia ”可以是人的HIF-Ia，也可以是鼠或其它哺乳动物的HIF-I α。优选地，本发明的HIF-I α是人HIF-I α，包括人HIF-I α的ー个亚群。本领域技术人员清楚，“人HIF-I α ”具有本领域公知的含义。本发明中使用的术语“角质细胞生长因子”或“KGF”可以是人的角质细胞生长因子(hKGF)，也可以是鼠或其它哺乳动物的KGF。优选地，本发明的KGF是hKGF，包括人KGF的所有分类，例如亚类，亚组，亚群，亚族等。本领域技术人员清楚，“hKGF”具有本领域公知
的含义。本发明中使用的术语“预防”和“治疗”具有它们一般意义上的含义。在一些实施方案中，HIF-I α和KGF以同时携带并可在真核细胞中表达HIF-I α和KGF基因的重组载体的形式提供。所述载体可以是同时携带并可在真核细胞中表达HIF-I α和KGF基因的质粒、噬菌体、病毒或粘粒等，优选质粒。在一个优选的实施方案中，所述质粒可以是氨苄青霉素抗性的真核表达质粒，例如本发明人自行改构的pIRES-HIF-l a -KGF(PHK)，或者其他携带并可表达HIF-I α和KGF基因的真核表达质粒如PCDNA3-HIF-1 a -KGF质粒。在ー个具体的实施方案中，所述质粒为PHK，其序列如SEQ ID N0:8所示。在另ー些实施方案中，HIF-I α和KGF以含有上述重组载体的重组细菌的形式提供。所述重组细菌是对人体无毒或者减毒的可直接将真核表达质粒带入动物细胞内的细菌，包括但不限于减毒沙门氏菌、减毒双歧杆菌、减毒大肠杆菌，优选沙门氏菌。本发明人发现，以沙门氏菌作为治疗基因HIF-I α和KGF的载体，可以成功地实现这两种蛋白在目标位点的表达。基因治疗(gene therapy)是ー种新的治疗手段，其被认为是21世纪医疗革命的关键。该治疗方法是通过以下方式实现治疗将治疗性蛋白的功能基因导入患者体内，使之在其中表达，从而发挥治疗作用。在这一方法中，合适载体的选择是基因治疗成败的关键。本发明人针对肠道寄生有大量菌群的独特微环境，选用沙门氏菌作为基因治疗的载体，成功地将功能基因导入体内并实现其表达。沙门氏菌为一群寄生于人和动物肠道内的无芽孢、革兰氏阴性直杆菌，可引起人和动物肠热症、胃肠炎、败血症等。减毒后的沙门氏菌仍保持对肠粘膜组织的强亲嗜性。减毒沙门氏菌通过侵袭派伊尔结(Payer' s pathches,PPs)下的滤泡相关上皮中的M细胞，M细胞对其进行吞饮，进而穿过小肠上皮屏障进入细胞内。此外，减毒沙门氏菌还可以被树突状细胞(Dendritic cell, DC)直接摄取进入机体(Fournier B, Williams IR, GewirtzAT, et al Infect Immun,2009 ；77 (9) :4121-4129. Toll-like receptor 5-dependentregulation of inflammation in systemic Salmonella enterica Serovar typhimuriuminfection.) 0且减毒沙门氏菌已被实验性地用做外源抗原基因载体，并已初步证明能直接将真核表达质粒携带进入动物细胞内，表达相应的蛋白(Chen D, Guo ff, Xu Z, at clSheng Wu Gong Cheng Xue Bao,2009,25(3) :341-347. Construction of a dual-promoterexpression plasmid delivered by Salmonella choleraesuis C500)。因此，特别优选地沙门氏菌，所述重组细菌为包含上述重组载体的减毒沙门氏菌。在ー个具体的实施方案中，所述重组细菌为本发明人构建的包含同时携带并可在真核细胞中表达HIF-I α和KGF基因真核表达质粒(序列如SEQ ID NO 8所示)的减毒沙门氏菌Ty21a 的菌株 Ty21a-pIRES-HI F_l a -KGF (TPHK)。本发明的TPHK具备对胃肠道黏膜的亲嗜功能，因此在给予到胃肠道之后，其更容易停留于此，并在此表达治疗性HIF-I α和KGF蛋白。因此，与直接给予蛋白或质粒相比，给予本发明的TPHK可以延长给药间隔，減少给药次数，更有针对性。另外，由于蛋白或质粒的制备、纯化和保存相对繁琐、昂贵，因此采用本发明的TPHK可以更为经济地实现对胃肠道损伤的防治。再有，TPHK只在局部分泌KGF和HIF-I α，无进入血流而引起诱发肿瘤的危险的顾虑。在本发明中，本发明采用急进高原建立高海拔缺氧肠应激损伤模型以及急性应激性结肠炎模型和急性应激性胃溃疡模型，通过灌胃给予TPHK进行治疗，验证了治疗效果。在本发明中，所述急性应激性胃肠道损伤性疾病特别是缺氧应激致胃肠道损伤性疾病可以为高原应激反应及其他急性的全身或胃肠道局部缺血缺氧性疾病继发引起的的急性胃肠道损伤；所述的高海拔缺氧应激致胃肠道损伤性疾病还可以是直接的急进高海抜缺氧应激致胃肠道黏膜损伤。所述其他急性应激性胃肠道损伤性疾病特别是急性应激性溃疡性结肠炎、急性应激胃溃疡，可以为物理的如射线、化学的如各种有机农药及微生物毒素、微生物的如各种胃肠道致病菌等因素以及极端环境因素如缺氧、高寒或其他的突发事件如地震作为应激源引起的急性胃肠道损伤性疾病。在本发明第二方面，提供了ー种重组载体，其同时携带并可在真核细胞中表达HIF-I α 和 KGF 基因。所述载体可以是同时携带并可在真核细胞中表达HIF- α和KGF基因的质粒、噬菌体、病毒或者粘粒，但优选质粒。在一个优选的实施方案中，所述质粒可以是氨苄青霉素抗性的真核表达质粒，例如本发明人自行改构的pIRES-HIF-l a -KGF(PHK)，或者其他携带并可在真核细胞中表达HIF-Ia和KGF基因的真核表达质粒如pAH质粒。在ー个具体的实施方案中，所述质粒为PHK，其序列如SEQ ID N0:8所示。所述HIF-I α可以是人的HIF_1 a，也可以是鼠或其它哺乳动物的HIF-I α。优选地，本发明的HIF-I α是人HIF-1 a，包括人HIF-I α的ー个亚群。所述KGF可以是人的角质细胞生长因子(hKGF)，也可以是鼠或其它哺乳动物的KGF0优选地，本发明的KGF是hKGF，包括人KGF的所有分类，例如亚类，亚组，亚群，亚族等。在本发明第三方面，提供了ー种重组细菌，其含有本发明第二方面所述的重组载体。所述重组细菌可以是含有本发明第二方面所述的重组载体的减毒沙门氏菌或者对人体无毒或者减毒的可直接将真核表达质粒带入动物细胞内的其他细菌，所述其他细菌包括但不限于减毒的双歧杆菌、减毒的大肠杆菌。所述重组细菌为含有本发明第二方面所述的重组载体的减毒沙门氏菌。在ー个具体的实施方案中，所述重组细菌为本发明人构建的含有同时携带并可在真核细胞中表达HIF-I α和KGF基因的真核表达质粒(序列如SEQID Ν0:8 所示)的减毒沙门氏菌(Ty21a)的菌株 Ty21a-pIRES-HIF_l a-KGF (TPHK)。所述HIF-I α可以是人的HIF-1 α，也可以是鼠或其它哺乳动物的HIF-I α。优选地，本发明的HIF- α是人HIF-1 a，包括人HIF-I α的ー个亚群。所述KGF可以是人的角质细胞生长因子(hKGF)，也可以是鼠或其它哺乳动物的KGF0优选地，本发明的KGF是hKGF，包括人KGF的所有分类，例如亚类，亚组，亚群，亚族等。本发明的TPHK具备对胃肠道黏膜的亲嗜功能，因此在给予到胃肠道之后，其更容易停留于此，并在此表达治疗性HIF-I α和KGF蛋白。因此，与直接给予蛋白或质粒相比，给予本发明的TPHK可以延长给药间隔，減少给药次数，更有针对性。另外，由于蛋白或质粒的制备、纯化和保存相对繁琐、昂贵，因此采用本发明的TPHK可以更为经济地实现对胃肠道损伤的防治。再有，TPHK只在局部分泌KGF和HIF-1 a，无进入血流而引起诱发肿瘤的
危险的顾虑。本发明人认为，KGF具有促进肠黏膜损伤修复功能，HIF-I α在缺氧条件下诱导分泌一系列的低氧反应元件，调节机体低氧适应性，增强细胞的耐受能力，为修复创造时间，两者联合应用具有治疗效果。在本发明中，本发明采用急进高原建立高海拔缺氧肠应激损伤模型以及急性应激性结肠炎模型和急性应激性胃溃疡模型，通过灌胃给予TPHK进行治疗，验证了治疗效果。在本发明第四方面，提供了ー种药物组合物，其包含治疗有效量的HIF-I α和KGF，或者包含治疗有效量的本发明第二方面所述的重组载体，或者包含治疗有效量的本发明第三方面所述的重组细菌。所述载体可以是同时携带并可在真核细胞中表达HIF-I α和KGF基因的质粒、噬菌体、病毒或粘粒等，但优选质粒。在一个优选的实施方案中，所述质粒可以是氨苄青霉素抗性的真核表达质粒，例如本发明人自行改构的pIRES-HIF-l a -KGF(PHK)，或者其他携带并可在真核细胞中表达HIF-Ia和KGF基因的真核表达质粒如pAH质粒。在ー个具体的实施方案中，所述质粒为PHK，其序列如SEQ ID N0:8所示。所述重组细菌可以是包含本发明第二方面所述的重组载体的减毒沙门氏菌或者对人体无毒或者减毒的可直接将真核表达质粒带入动物细胞内的其他细菌，所述其他细菌包括但不限于减毒的双歧杆菌、减毒的大肠杆菌。所述重组细菌为包含本发明第二方面所述的重组载体的减毒沙门氏菌。在ー个具体的实施方案中，所述重组细菌为本发明人构建的含有同时携带并可在真核细胞中表达HIF-I α和KGF基因真核表达质粒(序列如SEQ IDNO 8 所示)的减毒沙门氏菌 Ty21a 的菌株 Ty21a-pIRES-HIF_l a -KGF (TPHK)。所述HIF-I α可以是人的HIF-1 α，也可以是鼠或其它哺乳动物的HIF-I α。优选地，本发明的HIF- α是人HIF-1 a，包括人HIF-I α的ー个亚群。所述KGF可以人的角质细胞生长因子(hKGF)，也可以是鼠或其它哺乳动物的KGF。优选地，本发明的KGF是hKGF，包括人KGF的所有分类，例如亚类，亚组，亚群，亚族等。文所使用的“治疗有效量”指的是足以预防或改善胃肠道损伤的量。治疗有效量或剂量将取决于患者的年龄、性别及体重，以及患者的当前医疗状況。本领域技术人员能够依据本公开以及这些和其他因素来确定合适的剂量。例如，对于包含所述重组细菌的药物组合物，所述重组细菌的治疗有效量为5X 106-5X IO9 cfu/kg，优选为1-9X108 cfu/kg。
任选地，所述药物组合物还可以包含可药用辅助剂，例如赋形剂、稳定剂、防腐剤、载体等。在一个优选的实施方案中，所述药物组合物为ロ服胶囊制剂。根据本发明，所述药物组合物可以有效地预防和/或治疗急性应激性胃肠道损伤性疾病特别是缺氧应激致胃肠道损伤性疾病，例如高原应激反应以及其他急性的全身或胃肠道局部缺血性疾病引起的胃肠道损伤疾病；高海拔缺氧应激致胃肠道损伤性疾病还可以是直接的急进高海拔缺氧应激致胃肠道黏膜损伤。所述其他急性胃肠道损伤性疾病包括急性应激性溃疡性结肠炎、急性应激胃溃疡，可以为物理的如射线、化学的如各种有机农药及微生物毒素、微生物的如各种胃肠道致病菌等因素以及高原应激如高海拔各种特殊的自然环境因素或其他的突发事件作为应激源引起的急性胃肠道损伤性疾病。通过本发明，可以更科学、更有效地治疗急性应激性胃肠道损伤性疾病。在目前针对急性应激性胃肠道损伤性疾病特别是缺氧应激致胃肠道损伤性疾病临床治疗不尽如意的情况下，本发明提供了一种新的治疗途径，并且比以往的治疗手段更为科学、疗效更明确。
实施例下面通过具体实施例进ー步说明本发明。但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。这些实施例描述了携带并可表达HIF-I α和KGF基因的重组质粒或重组减毒沙门氏菌的制备以及急性应激性胃肠道损伤性疾病的治疗作用，以进ー步阐述本发明。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。实施例I.重组减毒沙门氏菌SPH的构津与制备I. HIFl a cDNA 的克隆按文献报道(MiyazawaK, et al BBRC，1989，163 :967-973 ；Nakamura T, etal. Progress in Growth Factor Research 1991,3:67-85)的人低氧诱导因子 hypoxiainducible factor-1 α , HIFl α ) cDNA序列设计引物，并在正向引物中引入Nhe I酶切位点，反向引物中引入Mlu I酶切位点。正向引物的寡核苷酸序列为5' -cat gctagc caccga ttc accatg gag ggc~3/ (SEQ ID NO :1),反向引物的寡核苷酸序列为 5' -gtc acgcgttea gtt aac ttg ate caa age tctg-3' (SEQ ID NO :2)。在本文中，如果未特别说明，所提及引物均为Takara公司所合成。用25ml的细胞培养瓶1640培养基(Gibco)于三气培养箱37°C 5% CO2条件下，诱导培养Hela细胞，细胞生长贴壁率达到80%时，弃去培养液。每瓶细胞用PBS(PH=7.4)冲洗I次，各加Iml Trizol裂解5min左右，加200 μ I氯仿，充分颠倒混勻，静置5min,4 °C 12000rpm 离心 IOmin,转移上清至 DEPC (diethypyrocarbonate,焦碳酸ニ こ酷)水处理过的I. 5ml EP管，加5倍体积的冰无水こ醇_20°C沉淀过夜。次日，4°C 12000rpm离心lOmin，弃去こ醇超净台吹干，加入20 μ I DEPC水完全融解RNA。取I μ I RNA加入DEPC水99 μ I (100倍稀释)，紫外分光光度计下测OD26。及OD28tl。计算OD26tl / OD28。的比值，留取比值在I. 8-2. O的样本进行逆转录。根据公式RNA 浓度(μ g / ml) =OD260X40X 100,计算 RNA 的浓度 O. I μ g / μ I,
并进行电泳检測。取10 μ I总RNA进行反转录，合成CDNA (方法參见PrimcScrippRT
reagent Kit (Perfect Real Time)试剂盒(购自Takara公司)操作说明)。反应体系RNA(I μ g) 10 μ I, 5XPrimeScript TM buffer 4 μ I, Random 6 mers (100 μ Μ) I μ I, OligodT Primer (50 μ Μ) I μ I,PrimeScript TM RT Enzyme Mix I I μ I,无 RNase 水补足 20 μ I。反应參数:37°C，15min，85°C 5s。将合成的cDNA分别以上述特异引物(SEQ ID No 1和SEQ ID NO :2，)和人
β-actin引物(SEQ ID NO :11和SEQ ID No 12)进行PCR扩增，鉴定cDNA模板质量。HIF-Ia反应体系:cDNA模板10μ l，HIF-la上游引物(20 μ Μ)和下游引物(20 μ Μ)各2μ 1，TaKaRa Taq (5U / μ I) O. 5 μ 1，dNTP (各 2. 5mM) 4 μ 1，10 XPCR buffer 5μ1，灭菌蒸馏水补足50μ I反应条件退火温度，94°C预变性5min ;94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸3min, 30 个循环；最后 72°C 延伸 lOmin。β -actin 反应体系cDNA 模板 10μ 1，β -aetin上游引物(20 μ Μ)和下游引物(20 μ Μ)各 2μ1，TaKaRa Taq (5U / μ 1)0. 5 μ 1，dNTP (各2. 5mM) 4 μ I, IOXPCR buffer 5 μ I,灭菌蒸懼水补足50 μ I。反应条件94°C预变性5min ;94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸lmin，30个循环；最后72°C延伸IOmin0 1%琼脂糖电泳，扩增出HIF-Ia在大约2500bp左右处有ー特异条带，β -actin在大约200bp处有ー很亮的特异性条带，如图I所示。测定人HIF-Ia cDNA序列(上海生エ生物工程技术服务公司)。将测得的人HIF-IacDNA序列与文献报道的人HIF-Ia cDNA序列进行比较分析。结果表明，克隆的人HIF-I αcDNA序列与文献报道的人HIF-1 a cDNA序列完全一致，其序列如SEQ ID NO 3所示。2.携带人HIF- α基因的质粒的构津在上述电泳胶中切掉2500_3000bp的条带，用回收试剂盒(TIANgel MidiPurification Kit,购自 TIANGEN 公司)回收。用 Nhe I (购自 Takara)和 Mlu I 酶(购自Takara)酶对pIRES载体(兽研所惠赠，其质粒图如图14所示)进行酶切，然后将其与上述PCR产物进行连接，连接反应体系纯化的PCR产物2 μ L，载体1.5 μ L，Solution I0. 5yL, T4连接酶I μ L，灭菌蒸馏水补足10yL，16°C连接12h。所得的重组质粒命名为pIRES-HIF-l α，其质粒图如图15所示。测定人重组质粒pIRES-HIF-l α序列(上海生エ生物工程技术服务公司)，如SEQID NO 7 所示。3.携带HIF- α基因的减毒沙门氏菌菌株的制备3. I电穿孔转化将减毒沙门氏菌Ty21a (购于北京生物制品检定所，编号50218)冻存菌液50 μ L接种于5ml不含抗生素的LB培养液，震荡培养至对数生长中期(菌液A值约0. 4)，4°C条件下，4000r. min-1离心收集菌体，用预冷的无菌去离子水洗涤细胞2次，洗涤后的细菌悬于Iml冰预冷的无菌去离子水。用电穿孔法(Μμ Itiporator 4308 Eppendorf电转仪)将pIRES-HIFl α质粒0. 2 μ g转化200 μ L预处理的减毒沙门氏菌。电穿孔条件电压2. 5kV,电容25 μ F，电阻200 Ω，放电时间O. 5s。加入SOC培养基1ml，37°C轻柔震荡培养45min,涂布于含氨节青霉素(lOOmg. L-1)固体LB培养基平皿,37°C培养16h后各挑取2个菌落进行鉴定。3. 2阳性工程菌的筛选从培养板各挑取2个单菌落，分别接种于3mL含氨苄青霉素的LB培养液中，37°C震摇培养。转入pIRES-HIFla质粒的减毒沙门氏菌菌株的筛选通过氨苄青霉素抗性、PCR (利用菌液为模板，扩增真核表达启动子CMV及目的基因HIFl a )及提取质粒后通过Nhe 1/Mlu I双酶切鉴定；转入pIRES的减毒沙门氏菌菌株的筛选通过卡那霉素抗性及PCR筛选(利用菌液为模板，扩增真核表达启动子CMV)。扩增真核表达启动子CMV的引物为上游 5' -CCC agt aca tga cct tat ggg-31 (SEQ ID NO :9)，下游 5' -gga gac ttg gaaate ccc gt-3' (SEQ ID NO :10)，PCR 參数为94で 30sec,55°C 30sec,72°C lmin，循环数
为 30，72°C延伸 5min。扩增 HIFl α 的引物为 SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO :2。PCR 參数为94°C 60sec,55°C 60sec,72°C 90sec，循环数为 30，72で延伸 7min。3. 3工程菌TPH的制备将携带HIFl α基因真核表达载体的减毒沙门氏菌菌种(TPH)接种于含氨苄青霉素(O. lmg/mL)的LB培养基中，35 37oC 8% C02培养箱中培养24h做为一代菌种，将ー代菌种接种至含完全培养基的克氏瓶中扩大培养做为ニ代菌种，并在无菌条件下取一代菌种和ニ代菌种样涂片，革兰氏染色后显微镜下可见呈革兰氏阴性杆菌，长链多，菌形一致。将ニ代克氏瓶菌种刮于IOOmL灭菌生理盐水菌种瓶中，比浊结果为1.7X1010f/mL，30L发酵罐发酵12h后3000 r/min离心20min,收集菌体73g,加入70mL脱脂牛奶充分混勻，置于不锈钢盘中冷冻干燥，制备成无菌干粉约26g。实施例2.携带KGF基因的重组减毒沙门氏菌(Ty21a-DlRES_KGF (TPK))的构津与制备I. KGF cDNA 的克降按文献报道(RubinJS, et al Proc Natl Acad Sei USA1989. 86 :302-306 ；FinchPff,et al Science 1989,245(49 19) :752-755)的人 KGF cDNA 序列设计引物，在正向引物中引入Xbal酶切位点，反向引物中引入NotI酶切位点。正向引物的寡核苷酸序列为5’-TATTCTCAGAATGAGCTATGATTACATGGAAG-3’ (SEQ ID NO :4)，反向引物的寡核苷酸序列为 5’_GACGCGGCCGCTTAAGTGATTGCCATAGGCAG-3’ (SEQ ID NO :5)。从人胎盘 cDNA文库(购自 Clontech)克隆人角质细胞生长因子(KGF)基因。反应体系模板cDNAly 1，KGF上游引物(20 μ M)和下游引物(20 μ Μ) # I μ I, dNTP 3 μ 1，10XPCR buffer 5 μ I,TaKaRa Taq(5U/ μ 1)0. 5 μ 1，灭菌蒸馏水补足50 μ I。PCR參数为94°C预变性5min ;94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸lmin，30个循环；最后72°C延伸lOmin。然后，将PCR产物进行电泳。电泳结果參见图2。测定人KGF cDNA序列(上海生エ生物工程技术服务公司)。将测得的人KGF cDNA序列与文献报道的人KGF cDNA序列进行比较分析。结果表明，克隆的人KGF cDNA序列与文献报道的人KGF cDNA序列完全一致，其序列如SEQ ID N0:6所示。2.携带人KGF基因的质粒的构津在上述电泳胶中切掉400bp左右的条带，用回收试剂盒(TIANgel MidiPurif ication Kit,购自 TIANGEN 公司)回收。用 Xba I (购自 Takara)和 Not I 酶(购自Takara)酶对pIRES载体进行酶切，然后将其与上述PCR产物进行连接，连接反应体系纯化的PCR产物2 μ L，载体I. 5 μ L，溶液I O. 5 μ L，Τ4连接酶I μ L，灭菌蒸馏水补足10 μ L，16°C连接12h。所得的重组质粒命名为pIRES-KGF，其质粒图如图16所示。测定人重组质粒pIRES-KGF序列(上海生エ生物工程技术服务公司)，如SEQ IDNO 13所示。3.携带KGF基因的减毒沙门氏菌菌株的制备3. I电穿孔转化将减毒沙门氏菌Ty21a(购于北京生物制品检定所，编号50218)冻存菌液50 μ L接种于5ml不含抗生素的LB培养液，震荡培养至对数生长中期(菌液A值约O. 4)，4°C条
件下，4000r. min-1离心收集菌体，用预冷的无菌去离子水洗涤细胞2次，洗涤后的细菌悬于Iml冰预冷的无菌去离子水。用电穿孔法(Μμ Itiporator 4308 Eppendorf电转仪)将pIRES-KGF质粒O. 2 μ g转化200 μ L预处理的减毒沙门氏菌。电穿孔条件电压2. 5kV，电容25 μ F，电阻200 Ω，放电时间O. 5s。加入SOC培养基1ml，37°C轻柔震荡培养45min，涂布于含氨苄青霉素(lOOmg. L-1)固体LB培养基平皿，37°C培养16h后各挑取2个菌落进行鉴定。3. 2阳性工程菌的筛选从培养板各挑取2个单菌落，分别接种于3mL含氨苄青霉素的LB培养液中，37°C震摇培养。转入pIRES-KGF质粒的减毒沙门氏菌菌株的筛选通过氨苄青霉素抗性、PCR(利用菌液为模板，扩增真核表达启动子CMV及目的基因KGF)及提取质粒后通过XbaL和Not I双酶切鉴定；转入pIRES的减毒沙门氏菌菌株的筛选通过卡那霉素抗性及PCR筛选(利用菌液为模板，扩增真核表达启动子CMV)。扩增真核表达启动子CMV的引物为SEQ ID NO 9和SEQID NO 10, PCR 參数为94°C 30sec，55°C 30sec，72°C lmin，循环数为 30，72°C延伸 5min。扩增 KGF 的引物为 SEQ ID NO :4 和 SEQ ID NO :5。PCR 參数为94°C 60sec，55°C 60sec,72°C 90sec，循环数为 30，72°C延伸 7min。3.3工程菌TPK的制备将携带KGF基因真核表达载体的减毒沙门氏菌菌种(TPK)接种于含氨苄青霉素(0. lmg/mL)的LB培养基中，于35_37°C、8% C02培养箱中培养24h做为一代菌种，将一代菌种接种至含完全培养基的克氏瓶中扩大培养做为ニ代菌种，并在无菌条件下取一代菌种和ニ代菌种样涂片，革兰氏染色后显微镜下可见呈革兰氏阴性杆菌，长链多，菌形一致。将ニ代克氏瓶菌种刮于IOOmL灭菌生理盐水菌种瓶中，比浊结果为I. TXlOVmLf/mLdOL,酵罐发酵12h后40000r/min离心20min，收集菌体70g，加入70mL脱脂牛奶充分混匀，置于不锈钢盘中冷冻干燥，制备成无菌干粉约20g。实施例3.携带HIF-I α基因和KGF基因的重组减毒沙门氏菌(Ty2la-pIRES-HIFl a -KGF (TPHK))的构津与制备I.携带人KGF和HIF-I α双基因质粒的构建将实施例2中KGF基因的PCR产物切胶回收，与pIRES-HIF-l α载体的Xba I和Not I (均购自Takara)双酶切产物连接，并将所得重组质粒命名为pIRES_HIF_l a -KGF,其质粒图如图17所示。测定人HIFl a cDNA序列(上海生エ生物工程技术服务公司)。所得pIRES-HIF-l a -KGF 的序列如 SEQ ID NO 8 所示。3.含有真核表达质粒pIRES-HIF-l a -KGF的减毒沙门氏菌菌株(Ty21a-pIRES-HIFl a -KGF (TPHK))的筛选与制备3. I.电穿孔转化将减毒沙门氏菌Ty21a冻存菌液50 μ L接种于5ml不含抗生素的LB培养液，震荡培养至对数生长中期(菌液A值约O. 4)，4°C条件下，4000r. mirT1离心收集菌体，用预冷的无菌去离子水洗涤细胞2次，洗涤后的细菌悬于Iml冰预冷的无菌去离子水。用电穿孔法(Multiporator 4308 Eppendorf 电转仪)将 pIRES-HIF-l a -KGF 质粒 O. 2 μ g 转化 200 μ L经预处理的减毒沙门氏菌。电穿孔条件电压2. 5kV，电容25 μ F，电阻200 Ω，放电时间
0.5s。加入SOC培养基lml，37°C轻柔震荡培养45min，涂布于含氨苄青霉素(lOOmg.じ1)固体LB培养基平皿，37°C培养16h后各挑取2个菌落进行鉴定。3. 2.阳件工程菌菌株 Tv21a-pIRES-HIF-l a -KGF 的筛诜从培养板各挑取2个单菌落，分别接种于3mL含氨苄青霉素O. lmg/ml的LB培养液中，37°C在ZD-85恒温振荡器(国华企业)摇菌扩增培养。转入pIRES-HIF-l a -KGF的减毒沙门氏菌菌株的筛选通过氨苄青霉素抗性、PCR(利用菌液为模板，扩增真核表达启动子CMV及目的基因HIF-I α和KGF)及提取质粒后Xba I/Notl酶或Nhel/Mlu I酶酶切鉴定(图3)。扩增真核表达启动子CMV的引物为SEQ ID NO :9和SEQ ID N0:10;PCR參数为:94°C预变性30sec ;55°C变性30sec，72°C延伸lmin，30个循环；72°C延伸5min。扩增 HIF-I α 的引物 SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO :2。PCR 參数为94°C变性 60sec，55°C退火60sec，72°C延伸 90sec，30 个循环；72°C延伸 7min。扩增 KGF 的引物为 SEQ ID NO :4 和 SEQID NO :5，PCR 參数为:94°C预变性 5min ;94°C变性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 lmin, 30 个循环；72°C延伸lOmin。HIF-I α反应体系菌液模板10μ l，HIF_la上游引物(20 μ M)和下游引物(20 μ Μ)各 2μ I, dNTP 4μ 1,10XPCR buffer 5 μ LTaKaRa Taq (5U/ μ 1)0. 5 μ 1，灭菌蒸馏水补足 50μ1。退火温度 64°C，94°C 5min ;94°C 30s, 60 °C 30s, 72 °C 3min。将筛选的阳性工程菌株命名为Tyl21 a -pIRES-HIFl a -KGF(简称ΤΡΗΚ)。3.工程菌 Ty21a-pIRES-HIF-l a -KGF 的制备将携带HIF-I α基因和KGF基因的真核表达载体的减毒沙门氏菌菌种(Ty21a-pIRES-HIF-l a -KGF)接种于含氨苄青霉素(0. lmg/ml)的LB培养基中，于35-37°C,8% CO2培养箱中培养24h，作为一代菌种。将一代菌种接种至含完全培养基的克氏瓶中扩大培养，作为ニ代菌种。在无菌条件下取一代菌种和ニ代菌种样涂片，革兰氏染色后显微镜下可见呈革兰氏阴性杆菌，长链多，菌形一致。将ニ代克氏瓶菌种刮于IOOmL灭菌生理盐水菌种瓶中，比浊结果为I. 7X 101°个/mL，30L发酵罐发酵12_14h后4000r/min离心20min。收集菌体70g，加入70mL脱脂牛奶充分混匀，置于不锈钢盘中冷冻干燥，制备成无菌干粉约20g。实施例4.重组减毒沙门氏菌TPHK治疗大鼠溃疡性结肠炎的效果观察I.实验动物及模型Wistar健康大鼠50只，体重180_220g，清洁级，由甘肃中医学院动物中心(SPF)提供。50只Wistar大鼠实验前禁食不禁水48h，随机取40只大鼠于第3天使其吸入こ醚麻醉。于仰卧位将ー根聚こ烯管(直径约2mm)经肛门插入肠道,深度8cm。将150mg/kg 2,4,6-三硝基苯横酸(2,4,6-trinitro picrylsulfonic acid, TNBS)与 50% こ醇等体积溶液(V/V)注入肠道，保持肛门高位5min，以防止液体流出。余下的10只大鼠以等量生理盐水取代TNBS灌肠液灌肠，其余过程均相同。2.动物分组及治疗将TNBS灌肠的40只大鼠随机分为5组TPHK治疗组、TPK治疗组、TPH治疗组、模型对照组(TC组)。生理盐水灌肠大鼠设为正常对照组(NC组)，每组50只。灌肠后第3天开始灌胃治疗，隔日一次，每只O. 5ml菌液，连续给药3次。TPK、TPH、TPHK菌液分别接种于含氨节青霉素O. lmg/ml的LB培养基中在恒温振荡器中摇菌扩增,9h后收集菌体,PBS洗涤后，用100g/L NaHCO3溶液悬浮，调整细菌数为2 X IO9Cfu (菌落形成単位)/mL，立即灌胃。模型对照组和正常对照组给予同体积100g/L NaHC03。 3.样品采集和处理连续灌胃3次，次日3%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，仰卧位固定于操作板上，之后常规碘酒、酒精消毒腹部皮肤，无菌开腹。取自距回盲部5 IOcm以上部分的小肠样品2cm用于病理组织学測定。4.病理组织学检测操作步骤大鼠处死后立即取小肠标本10%中性福尔马林固定24hI脱水24h后,石腊包埋、切片I脱蜡ニ甲苯I、ニ甲苯 II 各 IOmin ;ニ甲苯 IIIlOminI水化无水こ醇I、无水こ醇11、95%こ醇、85%こ醇各IminI流水冲洗I复染苏木素lmin，清水冲洗I分化I %的酒精盐酸涮几下，清水冲洗I返蓝10%氨水IOsec清水冲洗I伊红液(95 %こ醇溶液)I 3minI脱水85%こ醇、95%こ醇、无水こ醇I、无水こ醇II各2minI透明ニ甲苯I、ニ甲苯II、ニ甲苯III各2min
I封片树脂封片I光学显微镜观察分析。4. I 一般形态学观察NC组大鼠肠管黏膜皱襞纹理清晰，未见糜烂及溃疡。TC组大鼠肠管变粗，肠壁部分甚至膨胀巨大变薄，肠管黏膜坏死组织，溃疡及糜烂面的上面有灰黒色膜状物附着，其附
近黏膜充血、水肿明显。TPH和TPK治疗组较模型组有所改善，但大鼠肠壁仍有轻度充血。TPHK治疗组较TC组和TPH、TPK治疗组在形态上均有显著改善(图4)。4. 2组织学观察光镜下观察大鼠结肠组织可见，NC组黏膜、腺体结构清晰，黏膜下血管丰富；TC组黏膜糜烂、剥脱程度较重，溃疡数量多，溃疡面大，黏膜及黏膜下层有大量炎性细胞浸润，腺体破坏，组织坏死，未见明显增生现象；TPK和TPH治疗组与TC组比较结肠黏膜炎症充血、水肿、炎性细胞浸润程度减轻，溃疡面縮小；ΤΡΗΚ组较其他各组结肠黏膜炎症充血、水肿、炎性细胞的浸润明显降低，溃疡面显著缩小或完全消失，肠腺增生，溃疡底部可见黏膜下层有新生肉芽组织增生，且有丰富的毛细血管增生(图5)。5.实验结论本实验观察到TPHK对Wistar大鼠溃疡性结肠炎难愈合创面修复有良好的促进作用，表现在能明显减轻TNBS诱发溃疡性结肠炎模型大鼠的症状及炎症，促进黏膜上皮细胞的再生，加快损伤部位血运的重建，对已形成的黏膜损伤及溃疡有促修复作用。实施例5.重组TPHK治疗大鼠高海拔缺氧肠应激损伤的效果观察I.材料I. I主要试剂3%戊巴比妥钠、丙ニ醛(MDA)测试盒(南京建成)、超氧化物歧化酶(SOD)测试盒(南京建成)、KGF ELISA检测试剂盒(R&D) ,HIFl ELISA检测试剂盒(R&D)。I. 2实验动物Wistar大鼠，质量为200_220g，雄性大鼠，清洁级，由兰州大学动物实验中心提供。I. 3实验菌株减毒沙门氏菌(Ty21a)、携带HIF- α基因的减毒沙门氏菌(TPH)、携带KGF基因的减毒沙门氏菌(TPK)、携帯人HIF-I α基因和KGF的减毒沙门氏菌(TPHK)，后三者按照上述实施例制备。I. 4 仪器酶联免疫检测仪(南京华东电子集団医疗装备有限责任公司)紫外/可见分光光度计(uvlOOl，上海天美科学仪器有限公司)Electronic Balance(AUW120D, SHIMADZU CORPORATION JANPAN)80-2离心机(上海手术机械厂)MM-2A微型振荡器(北京市长风仪器仪表公司)超速低温台式离心机(Heraeus,德国)。Olympus BX5ITF 光学显微镜(日本 Olympus 公司)
P310型数码相机(日本Olympus公司)97-1型磁力加热搅拌器(江苏周庄科研仪器厂)热恒温水浴箱(上海医疗器械七厂)ZD-85恒温振荡器(国华企业)2.方法2. I动物分组及防治健康雄性Wistar大鼠64只，体重200 220克。动物购进后在本单位动物实验室
饲养I周，适应后投入实验。随机分为TPHK治疗组(TTPHK组),PTHK预防组(PTPHK组)、TPH治疗组(TTPH组)、TPH预防组(PTPH组)、TPK治疗组(TTPK组)、TPK预防组(PTPK组)、模型对照组(TC组)和正常对照组(NC组)，每组8只动物。将TPK、TPH和TPHK菌种分别接种于含氨苄青霉素O. lmg/ml的LB培养基中震荡培养，8h后收集菌液，PBS洗涤后，用10%的NaHCO3溶液悬浮，调整细菌数为lX109cfu/ml，灌胃。TTPH组、TTPK组和TTPHK组建模后开始灌胃IO9Cfu/只，每隔一天灌胃一次，共4次，7天后处死大鼠；PTPH组、PTPK组和PTPHK组于建模前第3天开始灌胃IO9Cfu/只，每隔I天灌胃I次，共4次，7天后处死；R组于建模4天后处死；C组于建模第4天处死。2. 2模型制作采用急进海拔为3800m的马衔山之后通过肠系膜上动脉缺血再灌注(I/R)建立高海抜缺氧应激致大鼠肠黏膜损伤模型。具体操作大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，仰卧位固定于操作板上，消毒后取腹正中切ロ长约3cm，用温盐水纱布将肠管推向左侧腹腔，暴露右肾内上方的肠系膜根部，找到肠系膜上动脉(superior mesenteric artery, SMA)SMA),在其根部用无创伤血管夹夹闭阻断SMA 60min，造成肠缺血模型，然后松夹，再灌注60min，之后关闭腹腔，并腹腔注射IOml/生理盐水。2. 3样品采集和处理依据上述指定时间，用3%戊巴比妥钠麻醉大鼠心脏采血5ml :常规碘酒、酒精消毒腹部皮肤，无菌开腹，全血离心(4°C /1000rpm/20min)后分装血浆，_80°C冰箱保存备用于生化分析、S0D、MDA检测。小肠组组织样品取自距回盲部5-lOcm以上部分，2cm用于组织病理学学測定，IOcm在液氮中冻存，用于ELISA測定。3.结果3. I脏器功能的检测血浆AST (天门冬氨酸转氨酶)、ALT (丙氨酸氨基转移酶)、BUN (尿素)、UREA (肌酐)、CK-MB (肌酸激酶同エ酶)使用7170自动生化分析仪测，结果如下(表I)。
权利要求
1.HIF-I α和KGF联合用于制备预防和/或治疗急性应激性胃肠道损伤性疾病的药物中的用途。
2.权利要求I的用途，其中所述HIF-Ia和KGF以同时携带并可在真核细胞中表达HIF-I a和KGF基因的重组真核表达质粒的形式提供。
3.权利要求2的用途，其中所述重组真核表达质粒为pIRES-HIF-1a -KGF(PHK)，其序列如SEQ ID NO 8所示。
4.权利要求I的用途，其中所述HIF-Ia和KGF以含有权利要求2所述的重组真核表 达质粒并可直接将所述重组真核表达质粒带入动物细胞内的重组细菌的形式提供。
5.权利要求4的用途，其中所述重组细菌为减毒沙门氏菌或者对人体无毒或者减毒的可直接将真核表达质粒带入动物细胞内的其他细菌，所述其他细菌包括但不限于减毒的双歧杆菌、减毒的大肠杆菌。
6.权利要求5的用途，其中所述减毒沙门氏菌为含有PIRES-HIF-1a -KGF质粒的Ty21a 菌株，即 TPHK, pIRES-HIF-l a -KGF 质粒的序列如 SEQ ID NO 8 所示。
7.权利要求1-6任ー项的用途，其中所述HIF-Ia和KGF是人源HIF_1a和KGF或者鼠或其他哺乳动物的HIF-I a和KGF，优选人源HIF-I a和KGF。
8.权利要求I的用途，其中所述急性应激性胃肠道损伤性疾病是缺氧应激致胃肠道损伤性疾病，包括高海拔缺氧应激致胃肠道损伤性疾病以及其他急性应激性胃肠道损伤疾病；所述高海拔缺氧应激致胃肠道损伤性疾病包括直接的急进高海拔缺氧应激致胃肠道黏膜损伤。
9.权利要求8的用途，其中所述其他急性应激性胃肠道损伤性疾病包括急性应激性溃疡性结肠炎、急性应激胃溃疡，还包括物理的如射线、化学的如各种有机农药及微生物毒素、微生物的如各种胃肠道致病菌等因素以及高原应激如高海拔各种特殊的自然环境因素或其他的突发事件作为应激源引起的急性胃肠道损伤性疾病。
10.一种重组真核表达质粒，其同时携带并可在真核生物中表达HIF-I a和KGF基因。
11.权利要求10的重组真核表达质粒，其中所述载体为pIRES-HIF-1a -KGF(PHK)，其序列如SEQ ID NO 8所示。
12.权利要求10或11的重组真核表达质粒，其中所述HIF-Ia和KGF基因是人源HIF-Ia和KGF或者鼠或其他哺乳动物的HIF-I a和KGF，优选人源HIF_1 a和KGF。
13.—种重组细菌，其含有权利要求10-12任一项所述的重组真核表达质粒并可直接将所述真核表达质粒带入动物细胞内。
14.权利要求13所述的重组细菌，其中所述重组细菌为减毒沙门氏菌或者对人体无毒或者减毒的可直接将真核表达质粒带入动物细胞内的其他细菌，所述其他细菌包括但不限于减毒的双歧杆菌、减毒的大肠杆菌。
15.权利要求14的重组细菌，其中所述减毒沙门氏菌为所述减毒沙门氏菌为含有pIRES-HIF-1 a -KGF 质粒的 Ty21a 菌株，即 TPHK, pIRES-HIF-l a -KGF 的序列如 SEQ ID NO 8所示。
16.权利要求13至15任一项的重组细菌，其中所述HIF-Ia和KGF为人源HIF-Ia和KGF或者鼠或其他哺乳动物的HIF-I a和KGF，优选人源HIF_1 a和KGF。
17.ー种药物组合物，其包含治疗有效量的HIF-I a和KGF，或者包含治疗有效量的权利要求10-12任一项所述的重组真核表达质粒，或者包含治疗有效量的权利要求13-16任一项所述的重组细菌。
18.权利要求17的药物组合物，用于治疗急性应激性胃肠道损伤性疾病特别是缺氧应激致胃肠道损伤性疾病可以为高原应激反应、及其他急性的全身或胃肠道局部缺血缺氧性疾病引起的急性胃肠道损伤；所述的高海拔缺氧应激致胃肠道损伤性疾病还可以是直接的急进高海拔缺氧应激致胃肠道黏膜损伤。
19.权利要求18的药物组合物，其中所述其他急性应激性胃肠道损伤性疾病特别是急性应激性溃疡性结肠炎、急性应激胃溃疡，可以为物理的如射线、化学的如各种有机农药及微生物毒素、微生物的如各种胃肠道致病菌等因素以及高原应激如高还发各种特殊的自然环境因素或其他的突发事件作为应激源引起的急性胃肠道损伤性疾病。
20.权利要求17-19任一项的药物组合物，其中还包含可药用辅助剂，例如赋形剂、稳定剂、防腐剂、载体。
21.权利要求17-20任一项的药物组合物，其中所述药物组合物为ロ服胶囊制剂。
全文摘要
本发明涉及预防和/或治疗急性应激性胃肠道损伤性疾病的细胞生长因子基因药物，HIF-1α和KGF基因在制备用于预防和/或治疗急性应激性胃肠道损伤性疾病的药物中的用途。本发明还涉及包含所述HIF-1α和KGF的药物组合物。本发明可以有益地预防和/或治疗急性应激性胃肠道损伤性疾病。
文档编号C12R1/19GK102813941SQ201210263919
公开日2012年12月12日 申请日期2012年7月27日 优先权日2012年7月27日
发明者哈小琴, 杨志华, 彭俊华, 邓芝云, 董菊子, 赵勇, 张媛媛 申请人:厚朴生物科技(苏州)有限公司