专利名称：一种鸭坦布苏病毒检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种医学检测用试剂盒，确切讲本发明是一种用于鸭坦布苏病毒一步法SYBR Green荧光定量PCR检测试剂盒。
背景技术：
由鸭坦布苏病毒引起的鸭群疾病现已形成大范围爆发流行，其主要临床症状为采食量突然下降，体温升高，排绿色稀便，部分鸭瘫痪，个别鸭精神沉郁，发病后不久产蛋量急剧下降可从90%以上下降至10%以下，剖检可见卵泡破裂出血，卵黄性腹膜炎，脾脏出血，胰腺出血坏死,肝脏肿大出血。该病具有传染性,一年四季均可发生,发病率高达90%，死亡率可达5%-30%，以冬春季节多发，各个产蛋阶段的鸭均可发病。鸭坦布苏病毒是近年发现的一种新病毒，目前还没有预防该病毒的疫苗和有效的治疗药物，主要依靠综合防治措施加以控制。2010年以来该病首先在我国东南部(上海，浙江，江苏，福建等省份)爆发，之后蔓延到山东，河南，湖北等省份，疫情一旦爆发便迅速蔓延，该病毒导致的疾病给养殖户和社会带来了沉重的负担，造成了极大的经济损失。所以建立一种能够快速，敏感，特异的检测鸭坦布苏病毒的方法对该病的控制至关重要。这一工作显得尤为迫切。目前已报道的基因检测技术主要有RT-PCR、巢式PCR、RT-LAMP, Taqman RT-PCR等，这些检测技术(除Taqman RT-PCR)敏感性不够、阳性率低、易污染、需进行后处理，而且不能准确提供病毒在体内含量的高低，对于Taqman RT-PCR检测技术，其不仅引物探针设计要求高，而且Taqman探针成本高，不易于大量样品的检测。SYBR Green荧光染料法，在PCR反应过程中随着目的片段的扩增，SYBR Green荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光积累信号，而不掺入链中的SYBR Green染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步，该法还可通过融解曲线来分析反应的可靠性，不仅如此该方法价格相对较低，适用于大量田间样品的检测。
发明内容
本发明的技术任务在于提供一种特异、敏感、快速、方便、廉价的用于定量检测鸭坦布苏病毒的方法；本发明的另一技术任务在于提供一种用于该检测方法的试剂盒。
本发明的鸭坦布苏病毒SYBR Green荧光定量PCR检测试剂盒内包含有根据鸭坦布苏病毒E基因保守区设计的两条特异性引物SEQl和SEQ2。本发明的试剂盒，其特征在于试剂盒内还含有2X定量PCR反应液包括dNTPMixture、Mg2+、SYBR Green I、RNase Inhibitor、反转录酶、Ex Taq HS、ROX ReferenceDye II等。本发明的鸭坦布苏病毒SYBR Green荧光定量PCR检测试剂盒内含有作为阴性对照的不含鸭坦布苏病毒RNA样品和作为阳性对照的含有鸭坦布苏病毒RNA的样品。当本发明的试剂盒内除含有特异引物SEQl和SEQ2外，还含有其它的附属物时，如有 dNTP Mixture、Mg2+、SYBR Green I、RNase Inhibitor、反转录酶、Ex Taq HS、ROXReference Dye II等，不含鸭坦布苏病毒的RNA阴性样品和含鸭坦布苏病毒的RNA的阳性样品，这样可以使检测过程更为方便简捷。 本发明所涉及的引物分别为
SEQl : (RT-EF) 5，-3，ccg cta gat tcg tga taa c ；
SEQ2 (RT-ER) 5，-3，cat ggt aag ttg aga tea tg ；
SEQ3 : (PEF) 5’ _3’ cga att cgc cac cat gat age ccc agcgta cag ctt cag ；
SEQ4 (PER) -3’ cat ctc gag cta ctt gtc gtc ate gtc ttt gta gtc ggc attgac att tac tgc cagga。利用本发明试剂盒进行鸭坦布苏病毒一步法SYBR Green荧光定量PCR检测，其优点在于，根据鸭坦布苏病毒E基因保守区设计特异性引物，在该病毒RNA提取的基础上，对组织样品进行荧光定量PCR扩增，实现对鸭坦布苏病毒的定量检测。本发明中样品RNA的提取为常规Trizol法提取，将提取的RNA样品取2μ I直接加入到分装于8连管中的反应液中(23 μ I),即可直接用于定量检测。优选的，上述的一步法SYBR Green荧光定量PCR扩增条件为42°C 5min，95°CIOsec, I个循环一95°C 5sec, 60°C lmin, 40个循环；其中突光信号收集设置在每一循环的60°C，Imin 末；融解曲线条件为 95°C lmin，55°C 30 sec, 5°C 30sec。本发明的试剂盒中有在对鸭坦布苏病毒E基因序列比对后，根据其保守区域优化设计特异性引物。在使用本发明的试剂盒进行检测时，是对鸭坦布苏病毒RNA提取后直接进行定量PCR扩增，同时本发明对反应体系及反应条件进行了优化，使检测中反转录及RCR扩增一步完成，简化了操作步骤，因此可以缩短反应时间，减少污染几率，并能提高检测的准确度和速度，一个检测反应可在2小时内完成。荧光定量PCR在扩增完成后可直接通过标准曲线定量起始病毒拷贝数，能为流行病学调查提供可靠的信息。同时，所提供的荧光定量PCR试剂盒操作简单快捷，成本相对较低，适于田间样品检测的要求。
图I是鸭坦布苏病毒E基因目的序列克隆到pBSK质粒中的重组质粒、酶切和PCR检测核酸电泳图，其中
M5000bpDNA MarkerlpBSK质粒对照泳道2:E-pBSK重组质粒检测泳道3:重组质粒酶切检测泳道4:重组质粒PCR检测泳道；
图2是重组质粒线性化核酸电泳图，其中
M5000bpDNA MarkerlE-pBSK重组质粒对照泳道2:重组质粒线性化检测泳道；
图3是一步法定量PCR的扩增曲线，其中纵坐标代表荧光量，横坐标代表循环数扩增曲线自左到右表示目的RNA的拷贝数分别为5X IO7 — 5X IO2 ；
图4是扩增曲线对应的标准曲线，其中纵坐标代表Ct值，横坐标代表样品的拷贝数，相关系数R2 1. 000，扩增效率Eff 99. 3% ；
图5是扩增曲线对应的融解曲线；
图6是检测方法特异性的扩增曲线；
图7是检测方法敏感性的扩增曲线，其中纵坐标代表荧光量，横坐标代表循环数扩增曲线自左到右表示目的RNA的拷贝数分别为2X IO7 — 2X 10° ；
图8是图7对应的融解曲线；
图9是常规PCR敏感性试验电泳图。
具体实施例方式以下结合具体实例和
对本发明做进一步说明实施例I.鸭坦布苏病毒荧光定量PCR引物的设计与合成
利用已知的鸭坦布苏病毒序列进行E基因序列比对，找出其保守区域，再利用PrimerExpress 3. O软件设计荧光定量PCR引物，引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。上下游引物分别为
SEQl : (RT-EF) 5’ _3’ ccg cta gat tcg tga taa cSEQ2 (RT-ER) 5，-3，cat ggt aag ttg aga tea tg。实施例2.标准品的制备
(I)扩增E全长基因上下游引物的设计合成
利用Oligo 6设计出扩增全长E基因的上下游引物SEQ3和SEQ4，并在SEQ3上游引物5’端加I酶切位点，SEQ4下游引物5’端加通ο I位点，引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。上下游引物分别为
SEQ3 : (PEF) 5’ _3’ cga att cgc cac cat gat age ccc agcgta cag ctt cagSEQ4 (PER) -3’ cat ctc gag cta ctt gtc gtc ate gtc ttt gta gtc ggc attgac att tac tgc cag ga。(2) E基因与pBSK重组质粒的构建和重组质粒的线性化
取临床确诊患有鸭坦布苏病毒的病理损伤组织，通过Trizol提取RNA并反转录为cDNA,经PCR扩增目的片段，利用胶回收试剂盒(OMEGA)回收纯化目的片段，用I和Xho I双酶切目的片段和pBSK质粒(STRATAGENE)，再用T4 DNA连接酶(NEB)将目的片段和pBSK质粒16°C过夜连接，转化DH5a感受态细胞，挑单克隆斑于LB (Amp+)中扩大培养，用质粒提取试剂盒(OMEGA)提取质粒，通过PCR和双酶切(AcoR I和通ο I)鉴定阳性质粒，见附图1，再通过测序鉴定，将成功构建的阳性质粒大量提取后用通ο I单酶切将其线性化，见附图2。(3)体外转录获得标准品RNA
以前述线性化的质粒为模板，利用体外转录试剂盒(TaKaRa)获得目的RNA。反应体系为10XT7 RNA polymerase buffer 2 μ 1，DTT 2 μ 1，NTP Mixture (each 2. 5mM) 4 μ I,RNase inhibitor(40U/μ I) 0. 5 μ I,Template DNA(50_500ng) 400ng,T7 RNA polymerase(50U/y I) 1μ 1，DEPC H2O to 20 μ 1，反应条件37°C作用Ih。体外转录RNA抽提与纯化步骤(a)转录的RNA以IOU DNase I，37°C作用lOmin。(b)加入30 μ I DEPC水，再加入50 μ I苯酚氯仿:异戊醇(25:24:1)，涡旋混匀，4°C、12000rpm、10min。(c)取上清，加入50 μ I氯仿:异戍醇(24:1),润旋混勻，41€、12000印111、10111；[11。(d)取上清,加入1/10体积的3M NaAc (pH=5. 2)再加入2. 5倍体积的冰冷无水乙醇，_20°C作用30_60min。(e) 4°C、12000rpm> 15min,弃上清，用70%冰冷无水乙醇洗漆沉淀。(f) 4°C、7000rpm、5min,弃掉乙醇，真空干燥沉淀，最后以适量DEPC水溶解RNA，测定浓度后于-80°C冻存。
利用公式(copies/μ1)=[(耶数父10 _9)X (6. 02X 10 23)] + (碱基数 X340)换算出目的RNA的拷贝数。实施例3.标准曲线的建立
根据定量后得到的拷贝数，将标准样品作成2. 5X 102—2. 5X 107 (copies/μ I)等6个梯度稀释的检测标准品，为降低误差，提高实验的可重复性，每一稀释度样品都设有三个重复孔，确定Ct值(Ct即cycle threshold,指反应管内的突光信号达到设定的域值时的所经历的循环数)，从而确定扩增效果最好的标准曲线。(I)荧光定量PCR扩增
扩增体系为 25 μ 1，其中包括 dNTP Mixture、Mg2+、SYBR Green I,RNase Inhibitor、反转录酶、Ex Taq HS, ROX Reference Dye II、上下游引物SEQl和SEQ2等，和稀释好的标准样品2 μ I οPCR 扩增米用 Agilent Technologies_Mx3005pPCR 扩增仪,程序为
42°C 5min, 95°C IOsec, I 个循环(反转录)
950C 5sec, 60°C lmin, 40 个循环(PCR 扩增)
其中荧光信号收集设置在每一循环的60°C，Imin末；95°C lmin, 55°C 30 sec, 5°C30sec (制作融解曲线)。(2)标准曲线的制备
PCR荧光信号的分析采用安捷伦公司MxPio软件，所得到的荧光定量PCR扩增曲线以及相应的标准曲线和融解曲线分别见附图3、4、5。实施例4.特异性的检测
用下述鸭常见疾病病原禽流感病毒H5和H9亚型、新城疫病毒、鸭肝炎病毒、呼肠孤病毒、鸭瘟病毒、产蛋下降综合症病毒，检测已建立检测方法的特异性，所得到的荧光定量PCR结果见附图6。其中设鸭坦布苏病毒RNA (此处RNA为临床上已知黄病毒感染鸭肝脏组织，通过Trizol法提取)阳性对照和水为模板的对照。结果显示该方法只能特异性的扩增出鸭坦布苏病毒RNA阳性对照，特异性好。实施例5.敏感性的检测
将标准样品作成I X IO7— I X 10° (copies/μ I)等8个稀释度，检测已建立方法的敏感性，所得到的荧光定量PCR结果见附图7，敏感性检测对应的融解曲线见附图8。同时用常规PCR检测同样稀释度的样品，结果见附图9。根据图8所示在2个拷贝时的融解曲线有杂峰，表示有非特异性扩增，为确保检测的准确性，将S 36个循环起峰的样品判为阳性。根据上述原因，此荧光定量检测方法能准确的检测到20个拷贝的病原，而普通PCR只能检测到2 X IO4个拷贝，由些可见本发明的荧光定量PCR的检测敏感性是普通PCR的IO3倍，敏感性好。
权利要求
1.一种鸭坦布苏病毒一步法SYBR Green荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于试剂盒内包含有根据鸭坦布苏病毒E基因保守区设计的两条特异性引物SEQl和SEQ2。
2.根据权利要求I所述的鸭坦布苏病毒SYBRGreen荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于试剂盒内还含有2X定量PCR反应液包括dNTP Mixture、Mg2+、SYBR Green I、RNaseInhibitor、反转录酶、Ex Taq HS、ROX Reference Dye II 等。
3.根据权利要求I或2所述的鸭坦布苏病毒SYBRGreen荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于试剂盒内还有作为阴性对照的不含鸭坦布苏病毒RNA样品和作为阳性对照的含有鸭坦布苏病毒RNA样品。
全文摘要
本发明公开一种用于鸭坦布苏病毒的一步法SYBRGreen荧光定量PCR检测试剂盒。本发明的鸭坦布苏病毒检测试剂盒内包含有根据鸭坦布苏病毒E基因保守区设计的两条特异性引物SEQ1和SEQ2。采用本发明的试剂盒进行检测，简化了操作步骤，可以缩短反应时间，减少污染几率，并能提高检测的准确度和速度，一个检测反应可在2小时内完成。荧光定量PCR在扩增完成后可直接通过标准曲线定量起始病毒拷贝数，能为流行病学调查提供可靠的信息。同时，所提供的荧光定量PCR试剂盒操作简单快捷，成本相对较低，适于田间样品检测的要求。
文档编号C12Q1/70GK102925585SQ20121026734
公开日2013年2月13日 申请日期2012年7月31日 优先权日2012年7月31日
发明者朱启运, 付钰广, 刘宗梁, 吉艳红, 郭建宏, 才学鹏 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所