专利名称：结核分枝杆菌的核酸指纹特征图谱库及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种建立结核分枝杆菌核酸指纹图谱的方法，以及使用该方法，对结核分枝杆菌进行快速鉴定的方法。
背景技术：
结核病是一种严重危害人民健康的慢性传染病，目前全球有约20亿人被感染，每年新出现结核病患者约800-1000万，每年因结核病死亡人数约为200-300万。目前我国结核病年发病人数约为130万，因结核病死亡人数每年达13万，超过其它传染病死亡人数的总和。我国是全球22个结核病流行严重的国家之一，同时也是全球27个耐多药结核病流行严重的国家之一。我国结核病患病人数居世界第二位，仅次于印度。结核病是我国重点控制的重大疾病之一。
结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)简称为结核杆菌(tuberclebacilli)，属于分枝杆菌属，有多个分离株。实验室检测结核分枝杆菌是临床结核病诊断的主要依据。目前，传统检测结核分枝杆菌的主要方法为直接涂片法(萋钠法和荧光染色法)和培养法，萋钠涂片法虽简便易行，但检出率较低；荧光染色法虽检出率较高，但对设备要求亦高(需荧光显微镜)；培养法虽为金标准，但周期太长；均难以满足临床需要。近年来，实时动态突光定量PCR (fluorescent quantitative PCR, FQ-PCR)也逐渐应用于临床，但该技术由于存在假阳性、假阴性及费用高等问题。近年来，已经出现质谱技术来检测核酸和蛋白质领域，其中质谱技术应用于核酸检测领域的理论基础在于，组成遗传物质DNA的基本单元——四种核苷酸之间存在质量差异，如 ddAMP、ddCMP、ddGMP、ddTMP 的分子量依次为 271. 2Da、247. 2Da、287. 2Da、327. IDa(其中ddTMP是经过修饰的)，它们之间的最小分子量差异在16Da，完全可以通过质谱进行分辨。使用质谱能够对碱基突变或多态位点(SNP)、插入/缺失(InDeI)、甲基化位点、基因定量、拷贝数变化(copy number variation, CNV)等多种DNA变化类型进行检测。已有一些公开文献使用质谱技术对微生物进行分类和鉴定，例如，中国专利申请CN102337223A、“产黄青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin及其制备方法”，公开了一种检测产黄青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin的MALDI-T0F鉴定方法，其中从平板上挑取产黄青霉A096孢子接种于SGY液体培养基培养，预处理得到粗蛋白溶液在色谱柱上分离纯化，并在羧甲基阳离子交换色谱柱上分离纯化，收集各洗脱组分，各组分离心超滤浓缩至所需体积，以宛氏拟青霉为敏感受试指示菌，追踪抗真菌活性组分，确定的活性成分判断获得蛋白的纯度；割取SDS-PAGE电泳图上的单一条带，进行MALDI-T0F鉴定。该方法仅适用于特定微生物，且需要多重蛋白纯化过程，最终用MALDI-T0F鉴定特征蛋白Pc-Arctin，其过程繁琐、适用面窄，不能实现质谱分类细菌或微生物的目的。中国专利申请200910157210、“一种李斯特菌属细胞中脂肪酸组分的分析方法”公开了一种利用气相色谱质谱(GC-MS)分析法针对细菌脂肪酸进行分类的方法，包括李斯特菌复壮，用牛津琼脂平板和胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂平板分别分离和纯化李斯特菌，培养单个典型菌落的李斯特菌并制成菌悬液，用甲醛灭活处理，把经甲醛处理后的菌悬液平均分装在离心管洗涤，用盐酸和甲醇的混合液甲酯化，把制得的脂肪酸进行气相色谱质谱(GC-MS)分析。虽然该方法打破传统细菌分类学的局限，减少人为因素对传统形态分类带来的误差，同时为新的菌种和毒种的分类鉴定提供强有力的工具，但该法仍然属于利用质谱法进行细胞化学分析分类，并未针对核酸进行检测。国际专利申请 W02010/021548、“Method for identifying biological materiale. g. bacteria in sample of patient, involves separating stream of liquidcontaining sample into successive portions to form flying drops and ionizingflying drops to measure mass spectra”,公开了一种使用 MALDI-MS (基质辅助激光解吸和电离质谱)用于识别生物材料的方法和装置，包括准备包含试样和MALDI基质材料的液体，并将其用于形成液体的连续流束。将该流束分散成接连的部分，以形成发射到飞行中的液滴，或将流束发射到飞行中，然后分散成液滴。可使用从喷墨印刷机中已知的液滴形成技术。对飞行中的液滴电离出材料。测量来自各个液滴的电离材料的质谱。但该方法目的在 于如何改善MALDI-MS检测生物物质的灵敏度，并不涉及质谱鉴定和分类任意微生物，因此也不能解决上述技术问题。由于质谱技术检测细菌存在着难以确定标准质谱特征图谱的问题。也就是说，尽管不同细菌之间的基因组DNA存在差异，将产生不同的核酸指纹图谱，但如果没有建立标准的质谱图谱数据库，则因为出现每次质谱检测细菌的结果因待检的基因组过于庞大而缺乏重复性，导致准确度下降。例如，朱健等人(“高效液相色谱-电喷雾多级质谱法对格尔德霉素粗品中各组分的初步判别及分类”，《中国抗生素》，2011年03期)报道了应用高效液相色谱-电喷雾多级质谱法(LC-ESI-MSn)对格尔德霉素(GDM)粗品中各组分进行与质量数相关的结构信息方面的初步判别及分类。该方法针对格尔德霉素(GDM)中不同组分的多级质谱碎片进行的分析整理,并对各种化合物进行了准确分类,但并不涉及针对细菌特定物质(如核酸)进行检测从而对细菌进行分类的方法。刘海洪(“MALDI TOF MS在细菌检测和鉴定中的应用”，《微生物学免疫学进展》，2003年02期)报道了“细菌体内含有大量的生物标志分子能用于细菌的化学分类和鉴定，针对如根据细菌的组成成分获得指纹图谱检测和鉴定细菌”，并对该方法预测其理论上的可行性。然而，该研究仅仅是理论上探讨了利用MALDI TOF MS对细菌进行分类的方向，其既没有指明所针对细菌的何种组分进行检测，也没有说明具体研究方法和过程。由于细菌中可用于分类的组分(如蛋白、DNA、RNA、多糖等)种类太多，且质谱技术针对不同待测物也存在各种实验参数的组合和选择，因此在此之后的近10年内并没有利用MALDI TOF MS进行细菌鉴定的新的报道。中国专利申请201110154723、“MALDI TOF MS辅助鉴定单增李斯特氏菌的方法”和201110154469、“MALDI TOF MS辅助鉴定霍乱弧菌的方法”公开了一种利用MALDI TOF MS技术辅助鉴定细菌的方法，包括预处理细菌培养物，采集所有菌株样品的MALDI TOF MS图谱，根据软件制备细菌标准图谱，使用相同的方法检测并采集待测细菌的图谱，以及比较二者图谱，根据匹配分数进行判定。由于该方法使用常规的处理(通过无水乙醇、甲酸和乙腈处理，并辅以离心，最后吸取上清液进行检测)，尽管其在一定程度上能表征该细菌的特征图谱，但由于其待测物中含有蛋白质、脂类、脂多糖和脂寡糖、DNA、多肽及其它能被离子化的分子，其得到的图谱实质上是上述各种分子的图谱集合，因此既需要处理和比对的图谱信息量过大，并且因待检分子过于庞大而导致其图谱特征性偏低，只适用于某具体细菌而无法推广到其他大量的细菌检测中。由于质谱技术检测细菌存在的上述缺陷，导致目前使用质谱技术检测细菌甚至结核杆菌的耐药突变基因一直没有进展。作为最接近的现有技术，中国专利申请201110178412、“结核杆菌耐药蛋白的筛选方法”报道了一种结合SDS凝胶电泳和质谱技术来筛选结核杆菌耐药蛋白的方法，该方法主要通过凝胶电泳纯化蛋白后，使用液相质谱来分离和鉴定耐药蛋白，并不涉及如何建立结核杆菌相关质谱特征库并利用该库进行细菌鉴定、分型的用途，因此也无法解决上述问题。因此目前需要新的结核杆菌的鉴定和分析方法(如质谱法)来实现快速、准确、廉价、便捷的分类结果。
发明内容
本发明原理在于针对结核分枝杆菌特定区域的DNA设计合适的引物进行PCR扩增，然后将PCR产物通过特定内切酶进行消化，产生一系列长度不一丰度不一的核酸片段，并通过MALDI-TOF MS质谱进行核酸分析检测，并形成谱图。对结核分枝杆菌目标基因序列进行扩增后酶切，得到结核分枝杆菌的图谱。可以实验结果与数据库中结核分枝杆菌标准图谱信息进行比对，即可完成对结核分枝杆菌的分类和鉴定(鉴定、分型、分类等)。此方法具有特异性强，灵敏度高，成本低，操作简便，用时少等优势。因此，本发明第一目的是提供一种结核分枝杆菌的核酸指纹特征图谱库及其用途。其特征在于，它至少包括如下步骤(I)PCR反应使用针对细菌的PCR通用引物，分别扩增多个细菌的核酸模板，得到含扩增目标区域的PCR产物；(2) SAP酶消化用碱性磷酸酶(SAP酶)处理步骤(I)得到的PCR产物；(3)转录和核酸酶切使用特定的转录和内切酶，分别在一个反应体系中，对步骤
(2)得到的各个细菌的消化产物进行转录和核酸酶切，获得一系列长度不一、丰度不一的核酸片段；(4)纯化使用树脂处理步骤(3)得到的酶切产物；(5)质谱仪检测将步骤(4)得到的纯化产物上点在含有基质的靶片上，上质谱仪进行检测，得到结核分枝杆菌的特征核酸指纹谱图。在一个实施方案中，所述通用引物包括但不限于SEQ ID No :1至SEQ ID No :2所示序列。在另一实施方案中，步骤3所述的特定酶,包括但不限于RNaseA酶。在一个具体实施方案中，步骤5的纯化包括在转录和酶切产物中加入超纯水，混匀后，再加入树脂，上下颠倒混匀15分钟。在另一个具体实施方案中，其中所述质谱仪是MALDI TOF MS质谱仪。本发明的第二目的是建立结核分枝杆菌的标准图谱，至少包括上述步骤1-5，和；(6)将步骤5得到的不同分离株的核酸指纹特征图谱，通过计算机软件进行汇总和整理，得到结核分枝杆菌的标准核酸指纹特征图谱。在一个实施方案中，所述软件是发明人自行研究开发的BioExplore软件，其版权号为软著登字第136879号、登记号2009SR10700。本发明的第三目的是提供一种利用上述特征图谱库快速鉴定结核分枝杆菌的方法，包括(I)PCR反应使用针对结核分枝杆菌的PCR通用引物，扩增待测菌的核酸模板，得到含扩增目标区域的PCR产物；(2) SAP酶消化用碱性磷酸酶(SAP酶)处理步骤(I)得到的PCR产物；(3)转录和核酸酶切使用特定的转录和内切酶，在一个反 应体系中，对步骤(2)得到的细菌的消化产物进行转录和核酸酶切，获得一系列长度不一、丰度不一的核酸片段；(4)纯化使用树脂处理步骤(3)得到的酶切产物；(5)质谱仪检测将步骤(4)得到的纯化产物上点在含有基质的靶片上，上质谱仪进行检测，得到该细菌的核酸指纹特征图谱；(6)将所得核酸指纹特征图谱与库中结核分枝杆菌核酸指纹特征图谱进行比较，从而判断待测细菌是否为结核分枝杆菌。本发明的第四目的是提供能用于结核分枝杆菌分类和鉴定、临床检验的试剂盒，包括(I)用于扩增细菌DNA的通用引物对及其缓冲液；(2) SAP酶及其缓冲液；(3) RNAase 及其缓冲液；(4)用于纯化酶切产物的树脂；(5)用于比对核酸指纹特征图谱的分析软件。在一个实施方案中，其中所述引物是SEQ ID NO: 1-20在另一实施方案中，其中所述软件是BioExplore软件，其版权号为(软著登字第136879 号、登记号 2009SR10700)。定义本发明所述的“细菌或结核分枝杆菌分类和鉴定”，包括对细菌进行鉴定和识别、分型、分种、分类。例如在食品安全检测中，通过结核分枝杆菌分类或鉴定，能准确识别污染源和细菌组成，以备采用合理措施进行保障食品安全(如肉制品、奶制品安全)。又如，在研究细菌的进化中，通过对结核分枝杆菌的识别和分类/分型，能够确定各种结核分枝杆菌种属之间的亲缘远近关系。本发明所述的结核分枝杆菌DNA基因组上一个区域，优选是具有高度保守同时又具有一定多态性的区域。本发明所述的保守区域或保守片段，优选是结核分枝杆菌rRNA区域。rRNA是研究细菌进化和亲缘关系的重要指标，它含量达80%，并存在于所有细菌中，rRNA基因由保守区和可变区组成，在细菌中高度保守，素有“细菌化石”之称，是细菌系统分类学研究中最有用和最常用的分子钟。另外，目前以16S rDNA进行细菌和结核分枝杆菌分类和鉴定的方法主要是采用PCR产物直接测序，结果与数据库进行比对的方法。测序法应用于临床检测，目前存在如下问题(I)成本高；(2)耗时；(3)对于混合样本，测序易产生套峰，难以进行有效区分；(4)16S rDNA全长1.5kb以上，一般需要经过两次测序并将结果进行拼接，在这个过程中易引入误差。如前所述，16S rDNA对细菌和结核分枝杆菌分类鉴定具有重要的意义，但是传统测序等方法检测成本高、耗时长；对于混合感染的样品，测序法将得到混合的序列峰图，难以进行有效的区分，并且利用质谱进行待测物分析，需要选择合适的待测物和优化质谱参数，因此目前需要新的细菌分类技术(如质谱法)来实现快速、准确、廉价、便捷的分类结果。本发明所述的“通用引物”是能位于各种细菌基因组的待扩增区域的上下游，能在不同细菌基因组中扩增相应片段的引物。其中，本发明所述的基因组上的待扩增区域选自与SEQ ID NO:3所示序列具有至少60%同源性的序列，优选该序列具有62%、65%、68%、70%、72%、75%、78%、80%、82%、85%、88%、89%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 同源性的序列。由于对于细菌DNA (例如16S rDNA)而言，其序列通常由保守区和可变区组成，且可变区多为不连续或短片段甚至SNP形式夹杂在保守区中间或两端，因此使用通用引物即能在不同细菌基因组中扩增相应片段。因各种细菌的该片段均具有一定同源性，故在与SEQ IDN0:3所示序列具有至少60%同源性的片段中，经过酶切和质谱后能得到待测细菌的核酸指 纹特征图谱。在一个实施方案中，结核分枝杆菌16S rDNA的特定区域是16S rDNA序列CTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTATCTCAGTCCCAGTGTGGCCGGACACCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCGTCGCCTTGGTAGGCCGTCACCCCACCAACAAGCTGATAGGCCGCGGGCTCATCCCACACCGCTAAAGCGCTTTCCACCACAAGACATGCATCCCGTGGTCCTATCCGGTATTAGACCCAGTTTCCCAGGCTTATCCCGAAGTGCAGGGCAGATCACCCACGTGTTACTCACCCGTTCGCCACTCGAGTATCTCCGAAGAGACCTTTCCGTTCGACTTGCATGTGTTAAGCACGCCGCCAGCGTTCGTCCTGAGCCAGGATCAAACTCT，即 SEQ ID NO:3。在一个具体实施方案中，该特定区域的引物是 SEQ ID No 1 和 SEQ ID No :2。有益效果I、本发明基于质谱检测技术，由于质谱检测的高灵敏性，使用本方案对结核分枝杆菌存在与否的检测下限能够远超出其他技术方案；2、对于不同的样本，本发明可比对它们产生的核酸指纹图谱，将实验产生的核酸指纹图谱与数据库中结核分枝杆菌标准菌株的图谱进行对比，经生物信息学分析，可以判断该菌是否为结核分枝杆菌分离株；3、使用本方案可以进行结核分枝杆菌的分类与鉴定，并可用于临床检验等方面。4、相对于现有技术，全过程仅仅数小时内完成，省时省力；5、本发明的数据库是开放式的，可不断补充新的分离株，不断完善和扩大数据库，以便更为准确的完成结核分枝杆菌的鉴定；6、另外，本发明首次提出将结核分枝杆菌的16S rDNA区域作为待测物进行质谱检测，以获得结核分枝杆菌的不同分离株的核酸指纹图谱，用于该种的分类与鉴定。
图1、2 :结核分枝杆菌的核酸指纹特征图谱的重复结果。图3 :对幼儿园污水源的结核分枝杆菌的质谱检测结果。图4 :待测样本I在罗氏固体培养基的培养结果。
图5 :待测样本I的萋钠抗酸性涂片法的染色结果。图6 :对入境旅客(待测样本2)的结核分枝杆菌的质谱检测结果图7 :对待测样本2的荧光定量PCR检测结果
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。实施例一结核分枝杆菌核酸指纹图谱的建立一、设计并选择合适弓I物根据结核分枝杆菌(M. tuberculosis H37Rv)的16S基因序列(SEQ ID N0:3),设 计PCR引物，分别为
权利要求
1.结核分枝杆菌的核酸指纹特征图谱库及其用途，其特征在于，它至少包括如下步骤 (1)PCR反应使用针对细菌的PCR通用引物，分别扩增多个细菌的核酸模板，得到含扩增目标区域的PCR产物； (2)SAP酶消化用碱性磷酸酶(SAP酶)处理步骤(I)得到的PCR产物； (3)转录和核酸酶切使用特定的转录和内切酶，分别在一个反应体系中，对步骤(2)得到的各个细菌的消化产物进行转录和核酸酶切，获得一系列长度不一、丰度不一的核酸片段； (4)纯化使用树脂处理步骤(3)得到的酶切产物； (5)质谱仪检测将步骤(4)得到的纯化产物上点在含有基质的靶片上，上质谱仪进行检测，得到结核分枝杆菌的特征核酸指纹谱图。
2.根据权利要求I的方法，其中通用引物包括但不限于SEQID No 1和SEQ ID No 2所示序列；且用于核酸酶切的特定酶，包括但不限于RNaseA酶。
3.权利要求I或2的方法，其中步骤5的纯化包括在转录和酶切产物中加入超纯水，混匀后，再加入树脂，上下颠倒混匀15分钟；所述质谱仪是MALDI TOF MS质谱仪。
4.利用权利要求I的方法用于建立结核分枝杆菌标准核酸指纹特征图谱的方法，至少包括上述步骤1-5，和； (6)将步骤5得到的不同分离株的结核分枝杆菌核酸指纹特征图谱，通过计算机软件进行汇总和整理，得到所述的结核分枝杆菌的标准核酸指纹特征图谱。
5.权利要求4的方法，其中所述软件是BioExplore软件，其版权号为软著登字第136879 号、登记号 2009SR10700。
6.利用权利要求4的方法所建立的结核分枝杆菌标准核酸指纹特征图谱，用于结核分枝杆菌鉴定或分类的方法，包括 (I )PCR反应使用针对细菌的PCR通用引物，扩增待测细菌的核酸模板，得到含扩增目标区域的PCR产物； (2)SAP酶消化用碱性磷酸酶(SAP酶)处理步骤(I)得到的PCR产物； (3)转录和核酸酶切使用特定的转录和内切酶，在一个反应体系中，对步骤(2)得到的细菌的消化产物进行转录和核酸酶切，获得一系列长度不一、丰度不一的核酸片段； (4)纯化使用树脂处理步骤(3)得到的酶切产物； (5)质谱仪检测将步骤(4)得到的纯化产物上点在含有基质的靶片上，上质谱仪进行检测，得到该细菌的核酸指纹特征图谱； (6)将所得核酸指纹特征图谱与结核分枝杆菌标准核酸指纹特征图谱进行比较，从而判断待测细菌是否为结核分枝杆菌。
7.权利要求6的方法,其中步骤6通过BioExplore软件进行比较检测。
8.提供能用于结核分枝杆菌分类和鉴定、临床检验的试剂盒，包括 (1)用于扩增细菌DNA的通用引物对及其缓冲液； (2)SAP酶及其缓冲液； (3)RNAase及其缓冲液； (4)用于纯化酶切产物的树脂；(5)用于比对核酸指纹特征图谱的分析软件。
9.权利要求8的试剂盒，其中所述引物是SEQ ID NO: 1-2，所述软件是BioExplore软件，其版权号为(软著登字第136879号、登记号2009SR10700)。
全文摘要
本发明公开了一种利用质谱技术快速分类和鉴定结核分枝杆菌的方法，包括PCR扩增、SAP酶消化、转录和核酸酶切、纯化、质谱仪检测等步骤。基于该方法，建立结核分枝杆菌的核酸指纹图谱数据库。根据实验产生的质谱峰图，可对待检样品中的结核分枝杆菌进行快速鉴定，结果可广泛运用于结核分枝杆菌分型和分类、及环境卫生和公共安全检疫等领域。
文档编号C12Q1/68GK102808223SQ20121027334
公开日2012年12月5日 申请日期2012年8月2日 优先权日2012年8月2日
发明者马庆伟, 赵洪斌, 张海燕, 赵艳梅 申请人:向华