青霉基因工程菌的制备方法及青霉基因工程菌的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种青霉基因工程菌的制备方法及青霉基因工程菌的应用，所述方法为：获得潮霉素抗性表达盒并克隆到目标质粒上，获得潮霉素抗性的重组质粒；分别克隆青霉脂肪酶基因PEL、扩展青霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子PgpdP和构巢曲霉色氨酸合成酶终止子TtrpC，得到有强启动子驱动的PEL基因表达盒；将PEL基因表达盒克隆到潮霉素抗性的重组质粒中，获得含潮霉素筛选标记PEL基因超表达载体；将该超表达载体转化工程农杆菌，利用农杆菌介导转化法将PEL基因表达盒转化到青霉菌株中，得到青霉基因工程菌。本发明获得的青霉工程菌产脂肪酶能力强，青霉工程菌制备的脂肪酶酶活比出发菌青霉野生菌提高了100％～150％。
【专利说明】青霉基因工程菌的制备方法及青霉基因工程菌的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程【技术领域】，特别是涉及一种青霉基因工程菌的制备方法，以及所述青霉基因工程菌在制备脂肪酶中的应用。
【背景技术】
[0002]近年来，脂肪酶(Lipase EC 3.1.1.3)在工业应用方面取得了很大进展。碱性脂肪酶具有对底物水解效率高、反应温和、无毒、能在一定条件下水解脂肪等优点，已经在洗涤剂、造纸、制革、食品、纺织及轻工业等领域得到广泛的应用，并已经成为全世界酶制剂市场上重要的品种。脂肪酶可以从动物、植物提取，也可以由多种微生物产生。由于微生物脂肪酶种类多，来源广，周期短，具有比动物、植物脂肪酶更广的pH、作用温度，更多的专一性类型底物，便于工业化生产和提纯，所以在酶的理论研究和实际应用中有更重要的作用。基于微生物脂肪酶的众多优点，人们一直期望获得产脂肪酶能力强的微生物菌株。在现有的技术中，通过对大量的微生物菌种进行选育，已经获得了一种产碱性脂肪酶能力较强的扩展青霉(P.expansium)菌株,并经过多年的诱变育种和发酵工艺改进,其产脂肪酶的能力已经得到大幅度的提高。但是，传统的菌株育种方法主要依靠随机的理化诱变，目标不明确，费时费力，而且收效不明显，目前通过采用这些方法来提高该菌株产脂肪酶的能力已经非常困难。因此，基于同源表达技术之上的遗传工程改良将是进一步提高扩展青霉产脂肪酶能力的高效手段。
[0003]在真菌的遗传转化载体构建中，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, gpd)启动子通常被认为是表达目标基因的理想候选启动子。中国专利CN102154340A公开了一种获得高效表达脂肪酶菌株的方法，该方法是利用构巢曲霉的强启动子3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子PgpdA驱动扩展青霉内源性脂肪酶基因的高效表达，脂肪酶的酶活力最高达6210IU/mL，最低也达5210IU/mL。虽然使用异源甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子构建表达载体非常普遍，但是载体上的基因在某些真菌受体中也有不表达的情况发生。因此，人们希望使用内源启动子以期载体上的基因在受体中高效表达。
[0004]经过对现有技术的文献检索发现，Moralejo, F.J.等在《Applied andEnvironmental Microbiology)) 1999 年第 3 期 1168-1174 页发表了题为((Thaumatinproduction in Aspergilus awamori by use of expression cassettes with strongfungal promoters and high gene dosage)) 一文，文中评述，产黄青霉 Penicilliumchrysogenum的pcbC启动子或产黄头孢霉Acremonium chrysogenum的B2启动子构建不同的表达盒在泡盛曲霉Aspergillus awamori中表达时,表达产量分别为7.7mg/L和1.6mg/L，相反，如果换用泡盛曲霉自身的启动子时，表达产量能达到llmg/L。这表明，同种特异性的启动子具有更好的启动表达效果。
`[0005]由上所述，发明一种由同源启动子驱动青霉内源性脂肪酶基因的高效表达的基因工程菌是提高青霉产脂肪酶能力的高效手段。
【发明内容】
[0006]本发明提供一种青霉基因工程菌的制备方法及青霉基因工程菌在制备脂肪酶中的应用，所述方法是一种利用扩展青霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子PgpdP驱动扩展青霉内源性脂肪酶基因高效表达的方法，所述方法获得的青霉工程菌产脂肪酶能力强，所述青霉工程菌制备的脂肪酶酶活力比青霉工程菌的出发菌青霉野生菌提高了 100%~150%。
[0007]本发明采用的技术方案是提供一种青霉基因工程菌的制备方法，所述方法包括如下步骤:
[0008](I)获得潮霉素抗性表达盒并克隆到目标质粒上，获得潮霉素抗性的重组质粒；
[0009](2)分别克隆青霉脂肪酶基因PEL、扩展青霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子PgpdP和构巢曲霉色氨酸合成酶终止子TtrpC，得到有强启动子驱动的PEL基因表达盒；
[0010](3)将所述PEL基因表达盒克隆到潮霉素抗性的重组质粒中，获得含潮霉素筛选标记PEL基因超表达载体；
[0011](4)将含潮霉素筛选标记PEL基因超表达载体转化工程农杆菌，利用农杆菌介导转化法将PEL基因表达盒转化到青霉菌株中，得到所述的青霉基因工程菌。
[0012]所述扩展青霉甘油醒-3-磷酸脱氢酶启动子PgpdP具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
[0013]其中，所述青霉囷为扩展青霉。
[0014]其中，所述潮霉素抗性表达盒为构巢曲霉色氨酸合成酶启动子PtrpC驱动的hpt基因表达盒。
[0015]其中，所述目标质粒为含有T边界的质粒，为pCAMBIA1300、pCAMBIA2300、pCAMBIA3300、pHB 中的一种。
[0016]具体地，所述方法包括如下步骤:
[0017](I)利用PCR技术或限制性酶切技术获得潮霉素抗性表达盒并克隆到目标质粒上，获得潮霉素抗性的重组质粒；
[0018](2)进行扩展青霉基因组DNA的抽提；
[0019](3)PCR扩增PEL和TtrpC，产物经凝胶回收后克隆至目标质粒，得到重组质粒；
[0020]⑷PCR扩增PgpdP后将PgpdP克隆至步骤(3)得到的重组质粒的相应位点，得到含PEL基因表达盒的载体；
[0021](5)利用限制性酶切技术获得PEL基因表达盒，然后克隆至含有潮霉素抗性的重组质粒上，获得含潮霉素筛选标记的PEL基因超表达载体；
[0022](6)将含潮霉素筛选标记的PEL基因超表达载体通过冻融法转化工程农杆菌；
[0023](7)将青霉接种培养20天左右，收集成熟孢子；
[0024](8)将含潮霉素筛选标记的PEL基因超表达载体的工程农杆菌接种于含有抗生素的LB液体培养基中过夜培养，用含有抗生素的MM培养基重新活化；吸取适量的培养物离心去上清，并用頂培养基稀释至0D_ = 0.15左右，然后再培养至OD6tltl = 0.5~0.6 ;
[0025](9)将第(7)步得到的新鲜孢子配制成悬浮液，随后取上述孢子悬液与步骤(8)中的工程农杆菌等体积混合，均匀涂到铺在含CM培养基上的玻璃纸上，进行共培养，之后将玻璃纸反铺到选择培养基上，进行选择培养，然后揭下玻璃纸，等待转化子长出，将抗潮霉素的转化子挑出接种到二筛培养基上，如稳定传代，得到所述青霉基因工程菌；其中，CM培养基:加一半頂培养基的葡萄糖量，外加1.5%琼脂，其它成份同IM培养基。
[0026]更进一步地，所述方法包括如下步骤:
[0027](I)利用限制性内切酶将潮霉素抗性表达盒酶切下来，克隆到质粒PCAMBIA2300，获得具有潮霉素抗性的重组质粒PCHAMBIA2302 ；
[0028](2)利用高盐低pH方法进行扩展青霉DNA的抽提；
[0029](3)以步骤⑵中的扩展青霉基因组DNA为模板，PCR扩增PEL ；以质粒pAN7_l为模板扩增TtrpC，然后将PEL和TtrpC进行连接，融合片段经凝胶回收，克隆至pMD18_T载体上，得到载体 pMDlg-T:: PEL-TtrpC ；
[0030](4)以步骤⑵中的扩展青霉基因组DNA为模板，PCR扩增强启动子PgpdP，片段经限制性内切酶消化后克隆至PMD18-T:: PEL-TtrpC，得到含有PEL基因表达盒的载体pMD18_T::PgpdP-PEL-TtrpC ；
[0031](5)利用限制性内切酶对载体pMD18-T:: PgpdP-PEL-TtrpC进行消化，获得PEL基因表达盒，然后克隆至重组质粒PCHAMBIA2302上，获得含潮霉素筛选标记的PEL基因超表达载体 pCHAMBIA2302:: PgpdP-PEL-TtrpC ；
[0032](6)将终载体pCHAMBIA2302:: PgpdP-PEL-TtrpC通过冻融法转化工程农杆菌EHA105 ；
[0033](7)挑取分离纯化后的野生型青霉接种于PDA平板上，收集成熟孢子；
[0034](8)将含终载体 pCHAMBIA2302::PgpdP-PEL-TtrpC 的工程农杆菌 EHA105 接种于含有抗生素的LB液体培养基中28°C，200rpm过夜培养，用含有抗生素的MM培养基重新活化，28°C，220rpm培养48小 时；吸取适量的培养物离心去上清，并用頂培养基洗涤，最后用IM培养基稀释至OD6tltl = 0.15，然后在28°C，220rpm的条件下培养6~8小时，至OD6tltl =0.5 ~0.6 ;
[0035](9)将第(J)步得到的新鲜孢子配制成悬浮液，随后取上述孢子悬液与步骤(8)中的工程农杆菌等体积混合，取200 μ L均匀涂布到铺有玻璃纸的含AS 200 μ g/mL的CM培养基之上，28°C共培养60h，然后将玻璃纸反铺到含有抗生素的PDA培养基上，28°C培养2天，揭下玻璃纸，在28°C条件下培养I~3天，将抗潮霉素的转化子挑出接种到二筛培养基上，如稳定传代，得到所述青霉基因工程菌；其中，CM培养基:加一半IM培养基的葡萄糖量，外加1.5%琼脂，其它成份同IM培养基。
[0036]特别地，所述方法包括如下步骤:
[0037](I)利用限制性内切酶Sac I，Kpn I将潮霉素抗性表达盒从质粒PV2+上酶切出来，片段经凝胶回收，克隆到PCAMBIA2300质粒的相应酶切位点上，获得具有潮霉素抗性的重组质粒 PCHAMBIA2302 ；
[0038](2)扩展青霉菌丝体经液氮研磨,加入高盐低pH提取液，65°C水浴30min ;离心取上清液，加入2/3倍体积的2.5M，pH4.8的KAc，离心取上清液，然后往上清液中加入0.7倍体积的异丙醇，沉淀DNA，DNA经75%的乙醇洗涤两次，溶解于双蒸水中备用；
[0039](3)以步骤⑵中的扩展青霉基因组DNA为模板，PCR扩增PEL ；以质粒pAN7_l为模板扩增TtrpC，然后利用重叠延伸PCR技术将PEL和TtrpC进行连接，融合片段经凝胶回收后克隆至PMD18-T载体上，得到载体pMD18-T::PEL-TtrpC ；[0040](4)以(2)中的扩展青霉基因组DNA为模板，PCR扩增强启动子PgpdP，片段经限制性内切酶Sal 1、Spe I消化后克隆至pMD18_T::PEL-TtrpC的相应位点，得到含有PEL基因表达盒的载体 pMD18-T::PgpdP-PEL-TtrpC ；[0041](5)利用限制性内切酶Sal 1、Pme I对载体pMD18_T::PgpdP-PEL-TtrpC进行消化，获得PEL基因表达盒，然后克隆至重组质粒pCHAMBIA2302上，获得含潮霉素筛选标记的PEL 基因超表达载体 pCHAMBIA2302:: PgpdP-PEL-TtrpC ；
[0042](6)将终载体pCHAMBIA2302:: PgpdP-PEL-TtrpC通过冻融法转化工程农杆菌EHA105 ；
[0043](7)挑取分离纯化后的野生型青霉接种于PDA平板上，于28°C培养20天左右，收集成熟孢子；
[0044](8)将含终载体pCHAMBIA2302:: PgpdP-PEL-TtrpC的工程农杆菌EHA105接种于含有100 μ g/ml链霉素、100 μ g/ml卡那霉素的LB液体培养基中28°C，200rpm过夜培养，用含有100 μ g/ml链霉素和100 μ g/ml卡那霉素的丽培养基重新活化，28°C，220rpm培养48小时；吸取适量的培养物5000rpm离心去上清，并用IM培养基洗涤，最后用IM培养基稀释至OD600 = 0.15，然后在28°C，220rpm的条件下培养6~8小时，至0D_ = 0.5~0.6 ;
[0045](9)将第(7)步得到的新鲜孢子配制成I X IO7个/mL浓度的悬浮液，随后取上述孢子悬液与步骤(8)中的工程农杆菌等体积混合，取200yL均匀涂布到铺有玻璃纸的含AS 200 μ g/mL的CM培养基之上，28°C共培养60h，然后将玻璃纸反铺到含有100 μ g/mL潮霉素、500 μ g/mL头孢菌素的PDA培养基上28°C培养2天，揭下玻璃纸，在28 °C条件下培养I~3天，将抗潮霉素的转化子挑出接种到二筛培养基上，如稳定传代，得到所述青霉基因工程菌；其中，CM培养基:加一半IM培养基的葡萄糖量，外加1.5%琼脂，其它成份同IM培养基。
[0046]本发明还涉及所述方法制备的青霉基因工程菌在制备脂肪酶中的应用。
[0047]具体地，所述青霉基因工程菌以5%~20%接种量接种到发酵培养基，在25~35200~300rpm条件下，发酵2天后，经分离纯化得到脂肪酶。
[0048]更进一步地，将所述青霉基因工程菌以菌丝体或包子悬液接入种子培养基在25~35°C下培养24小时后，以5%~20%接种量转入发酵培养基，在25~35°C、150~300rpm条件下发酵2天后，经分离纯化得到脂肪酶。
[0049]本发明中所用到的培养基如下:
[0050]高盐低pH 提取液=NaAc 0.1M, pH4.8 ；EDTA-Na2 0.05Μ, ρΗ8.0 ；NaCl 0.5M ；PVP2% ；SDS 2% ;调节最终pH至5.5。
[0051]PDA培养基(g/L):马铃薯，200 ;蔗糖，20 ;琼脂，15 ；pH自然。
[0052]MM 培养基:IM K2HPO4-KH2PO4 (ρΗ7.0) 10mL，M-N(MgS04.7H2030g/L，NaCl15g/L)20mL, I % CaCl2.2H20 lmL，20 % 葡萄糖 10mL，0.01 % FeSO4 IOmL, Sporeelement (ZnSO4.7H20 lOOmg/L, CuSO4.5H20100mg/L, H3B03100mg/L, MnSO4.H20100mg/L,Na2MoO4.2H20100mg/L))5mL,20% NH4N032.5mL，无菌水 941.5mL。
[0053]頂培养基:IMK2HPO4-KH2PO4 (ρΗ7.0) 10mL，M-N(MgS04.7H2030g/L，NaCl15g/L)20mL, I % CaCl2.2H20 lmL，20 % 葡萄糖 10mL，0.01 % FeSO4 IOmL, Sporeelement (ZnSO4.7H20 lOOmg/L, CuSO4.5H20100mg/L, H3BO3 lOOmg/L, MnSO4.H2O lOOmg/L,Na2MoO4.2H20lOOmg/L) 5mL,20% NH4NO3 2.5mL，50% 甘油 IOmL, IM MES (pH5.5)40mL, IOOmMAS (乙酰丁香酮)2mL,无菌水898.7mL。
[0054]CM培养基:加一半頂培养基的葡萄糖量，外加1.5%琼脂，其它成份同頂培养基。
[0055]种子培养基(%):黄豆饼粉 4，玉米淀粉 0.8，Na NO3 0.3, Na2HPO40.2，K2SO4 0.25，MgSO4 0.03，FeSO4 0.003。
[0056]发酵培养基(%):黄豆饼粉 6，玉米淀粉 1，NaNO3 0.4，Na2HPO40.2，K2SO4 0.3，MgSO4 0.035，FeSO4 0.02，CaCO3 0.5，Na2CO3 0.02。
[0057]本发明的有益效果是:
[0058]1、运用基因工程技术对青霉菌进行改良，育种目标明确，效率高；
[0059]2、所得青霉工程菌产脂肪酶能力强，青霉工程菌制备的脂肪酶酶活力比青霉工程菌的出发菌青霉野生菌提高了 100%~150%。
【专利附图】
【附图说明】
[0060]图1为超表达载体pCHAMBIA2302:: PgpdP-PEL-TtrpC的构建路线示意图；
[0061]图2为构建的超表达载体pCHAMBIA2302::PgpdP-PEL-TtrpC的PCR鉴定图谱；其中，T1-T5:独立的农杆菌转化子；+:阳性对照；_:阴性对照；M:DL-2000Marker ；
[0062]图3为青霉转基因菌株的PCR鉴定图谱，其中，T1-TV11:独立的青霉转化子；+:阳性对照K1:阴性对照；M:DL-2000Markero
【具体实施方式】
[0063]下面结合附图及具体实施例对本发明进行进一步描述:
[0064]实施例1:超表达载体的构建
[0065]请参见图1，详细步骤如下:
[0066](I)利用限制性内切酶Sac I，Kpn I将潮霉素抗性表达盒从质粒PV2+上酶切出来，片段经凝胶回收，克隆到PCAMBIA2300质粒的相应酶切位点上，获得具有潮霉素抗性的重组质粒PCHAMBIA2302 ;潮霉素表达盒也可来自其它含该序列的任何DNA或者直接合成。用于构建PEL基因超表达载体的质粒除pCAMBIA2300外，还可用能在丝状真菌中表达的质粒如 pCAMBIA1300，pCAMBIA3300 等 pCAMBIA 系列载体和 pHB 载体。
[0067](2)取扩展青霉菌丝体0.2g经液氮研磨，加入ImL高盐低pH提取液，65°C水浴30min, 12000rpm/min 离心 IOmin,取上清液；A 0.7mL 的 KAc (2.5M, pH4.8)，12000rpm/min离心IOmin离心，取上清液；然后往上清液中加入1.2mL的异丙醇，沉淀DNA ;基因组DNA经75%的乙醇洗涤两次，溶解于双蒸水中备用。
[0068](3)根据P.expansium的脂肪酶基因PEL(AF330635)的序列设计引物(正向引物:TGACTAGTATGTTGTTCAACTACCAATCTTT, SEQ ID NO:2，下划线的序列为限制性酶 Spe I 切点；反向引物:TGGATCCGCGGCCGCTTATCAGCTCAGATAGC, SEQ ID NO:3，下划线的序列为限制性酶Not I切点)利用PCR技术扩增全基因序列。PCR反应条件为:95°C 5min ；95°C 30s, 56°C30s, 72°C 90s，35 个循环；72°C IOmin0
[0069](4)根据质粒pP AN7_l (Punt et al.1987 Gene 56:117-124)的序列设计引物(正向引物:GCTATCTGAGCTGATAAGCGGCCGCGGATCCACTTAACGTTA, SEQ ID NO:4，下划线的序列为限制性酶 Not I 切点:反向引物:GTTTAAACTCGAGTGGAGATGTGGAGTGGGCGC, SEQ ID N0:5，下划线的序列为限制性酶Pme I切点)利用PCR技术扩增出色氨酸合成酶终止子TtrpC。PCR反应条件为:95°C 5min ；95°C 30s, 56°C 30s, 72°C 60s，35 个循环；72°C IOmin0
[0070](5)取⑷和(5)的反应液各 I μ L 作为模板，以(TGACTAGTATGTTGTTCAACTACCAATCTTT，SEQ ID NO:2，下划线的序列为限制性酶Spe I切点)作为正向引物；以(GTTTAAACTCGAGTGGAGATGTGGAGTGGGCGC, SEQ ID NO:5，下划线的序列为限制性酶Pme I切点)作为反向引物，进行 PCR 扩增，PCR 的反应条件为:95°C 5min ；95°C 30s, 56°C 30s, 72°C 150s, 35个循环；72°C lOmin。反应结束后，将PCR扩增产物进行凝胶柱回收，并克隆到pMD18_T载体，获得中间载体pMD 18-T:: PEL-TtrpC。
[0071](6)根据SEQ ID NO:1所示的PgpdP全长序列，设计引物(正向引物:GAGAGTCGACGCGTCTTCGAGGGGCA, SEQ ID NO:6，下划线的序列为限制性酶Sal I切点；反向弓丨物:GAGAACTAGTGATTGCGGTTTACTGGAAGCT, SEQ ID NO:7，下划线的序列为限制性酶 SpeI切点)，以扩展青霉基因组DNA为模板，利用PCR技术扩增全基因序列。PCR反应条件为:95°C 5min ；95°C 30s, 56°C 30s, 72°C 180s，35 个循环；72°C IOmin0 然后将目标片段回收，利用限制性内切酶Sal I和Spe I对该片段进行消化，回收酶切产物，克隆到载体PMD18-T::PEL-TtrpC 的相应位点，获得中间载体 pMD18_T::PgpdP-PEL_TtrpC。
[0072](7)利用限制内切酶 Sal I 和 Pme I 对载体 pMD18_T::PgpdP-PEL-TtrpC 进行消化，回收表达盒PgpdP-PEL-TtrpC，然后克隆至pCHAMBIA2302相应位点，获得最终载体PCHAMBIA2302::PgpdP-PEL-TtrpC。
[0073](8)对含有最终载体pCHAMBIA2302::PgpdP-PEL-TtrpC的菌进行扩大培养，并抽提质粒，利用冻融法转化工程农杆菌EHA105。随机挑选5株转化子，以(TGACTAGTATGTTGTTCAACTACCAATCTTT, SEQ ID NO:2，下划线的序列为限制性酶Spe I切点)作为正向引物；以(GTTTAAACTCGAGTGGAGATGTGGAGTGGGCGC, SEQ ID NO:5，下划线的序列为限制性酶 Pme I 切点)作为反向引物，以载体PMD18-T::PEL-TtrpC为阳性对照，空EHA105为阴性对照，对这5株菌进行PCR鉴定，结果显示这5株菌均为阳性，请参见图2。
[0074]实施例2:青霉基因工程菌的获得
[0075]详细步骤如下:
[0076](I)挑取分离纯化后的野生型青霉接种于PDA平板上，于28°C培养20天左右，用无菌水洗下成熟孢子。
[0077](2)将实例 I 中含终载体 pCHAMBIA2302::PgpdP-PEL-TtrpC 的工程农杆菌 EHA105接种于含有100 μ g/mL链霉素、100 μ g/mL卡那霉素的LB液体培养基中28°C，200rpm过夜培养，用含有100 μ g/mL链霉素和100 μ g/mL卡那霉素的丽培养基重新活化，28°C，220rpm培养48小时。吸取适量的培养物5000rpm离心去上清，并用頂培养基洗涤，最后用頂培养基稀释至OD6tltl = 0.15，然后在28°C，220rpm的条件下培养6~8小时，至OD6tltl = 0.5~0.6。
[0078](3)将第(I)步得到的新鲜孢子配制成I X IO7个/mL浓度的悬浮液，随后取上述孢子悬液与步骤(2)中的工程农杆菌等体积混合，取200 μ L均匀涂布到铺有玻璃纸的CM培养基(含AS 200 μ g/mL)之上，28°C共培养60h，然后将玻璃纸反铺到含有潮霉素(100 μ g/mL转化选择抗生素)、头孢菌素(500 μ g/mL，抑制农杆菌生长抗生素)的PDA培养基上28°C培养2天，揭下玻璃纸，在28°C条件下培养I~3天，将抗潮霉素的转化子挑出接种到二筛培养基上，如稳定传代，即是所述青霉基因工程菌，如此获得了 30株青霉基因工程菌。随机挑选7株转化子进行扩大培养，并分别抽提基因组DNA，以(TGACTAGTATGTTGTTCAACTACCAATCTTT，SEQ ID NO:2，下划线的序列为限制性酶spe I切点)作为正向引物；以(GTTTAAACTCGAGTGGAGATGTGGAGTGGGCGC, SEQ ID NO:5，下划线的序列为限制性酶Pme I切点)作为反向引物，以载体PMD18-T:: PEL-TtrpC为阳性对照，野生型青霉基因组DNA为阴性对照，对这7株菌进行PCR鉴定，结果显示这7株菌均为阳性，请参见图3。
[0079]MM 培养基:IM K2HPO4-KH2PO4 (ρΗ7.0) 10mL，M-N(MgS04.7H2030g/L，NaCl15g/L)20mL, I % CaCl2.2H20 lmL，20 % 葡萄糖 10mL，0.01 % FeSO4 IOmL, Sporeelement (ZnSO4.7H20 lOOmg/L, CuSO4.5H20100mg/L, H3B03100mg/L, MnSO4.H20100mg/L,Na2MoO4.2H20100mg/L))5mL,20% NH4NO3 2.5mL，无菌水 941.5mL。
[0080]頂培养基:IMK2HPO4-KH2PO4 (ρΗ7.0) 10mL，M-N(MgS04.7H2030g/L，NaCl15g/L)20mL, I % CaCl2.2H20 lmL，20 % 葡萄糖 10mL，0.01 % FeSO4 IOmL, Sporeelement (ZnSO4.7H20 lOOmg/L, CuSO4.5H20100mg/L, H3BO3 lOOmg/L, MnSO4.H2O lOOmg/L,Na2MoO4.2H20lOOmg/L) 5mL, 20% NH4NO3 2.5mL, 50% 甘油 IOmL, IM MES (pH5.5) 40mL, IOOmMAS (乙酰丁香酮)2mL,无菌水898.7mL。
[0081]CM培养基:加一半頂培养基的葡萄糖量，外加1.5%琼脂，其它成份同頂培养基。
[0082]PDA培养基(g/L):马铃薯，200 ;蔗糖，20 ;琼脂，15 ；PH自然。
[0083]高盐低pH 提取液=NaAc 0.1M, pH4.8 ；EDTA-Na2 0.05Μ, ρΗ8.0 ； ；NaCl 0.5M ；PVP2% ；SDS 2% ;调节最终pH至5.5。
[0084]实施例3:产脂肪酶能力对比
[0085]实验随机挑选实例2所得的青霉基因工程菌接种到PDA培养基上，培养10天后分别接入种子培养基50mL中，在28°C，2IOrpm摇床培养24h，然后以10%的接种量分别转入发酵培养基(250mL三角瓶装30mL发酵培养基)，在28°C，21Orpm条件下发酵48h ;然后将发酵液离心，取上清液进行脂肪酶活力检测。
[0086]利用酸碱滴定法对脂肪酶活力进行检测，检测步骤为:取IOOmL三角瓶20只，分别加入4.0mL pH9.4的Gly-NaOH缓冲液和5.0mL橄榄油乳化液；放入震荡恒温水浴锅36°C水浴锅预热5分钟。酶液过滤后，用0.05mol/L pH9.4的Gly-NaOH缓冲液稀释使酶活为4~5u/mL后测定。往其中两个各加入ImL稀释好的酶液，缓慢振荡(60次/min) 10分钟(精确计时)。另外两瓶做空白对照，立即加入95%酒精20mL(空白对照加入ImL稀释好的酶液)，摇匀，加入IOmL 30%的氯化钠溶液，摇匀；用0.0111101/1 NaOH溶液滴定样品使其与空白对照的pH相同，记下0.01mol/L NaOH用量。
[0087]计算
[0088]X = AXBXl/TXn
[0089]式中:
[0090]X——样品的酶活力(u/g或u/mL);
[0091]A——滴定样品时消耗标准0.01mol/L NaOH的体积(mL)；
[0092]B-滴定用 NaOH 的浓度(μ mol/mL)
[0093]T-酶促反应时间(min)；[0094]η—稀释倍数；
[0095]同时做两份平行，结果取平均值，所得结果表示至整数。平行试验相对误差不得超过 5.0%。
[0096]PDA培养基(g/L):马铃薯，200 ;蔗糖，20 ;琼脂，15 ；pH自然。
[0097]种子培养基(%):黄豆饼粉 4，玉米淀粉 0.8，Na NO3 0.3, Na2HPO40.2，K2SO4 0.25，MgSO4 0.03，FeSO4 0.003。
[0098]发酵培养基(%):黄豆饼粉 6，玉米淀粉 1，NaNO3 0.4，Na2HPO40.2，K2SO4 0.3，MgSO4 0.035，FeSO4 0.02，CaCO3 0.5，Na2CO3 0.02。
[0099]橄榄油乳化液的制取:4% PVA溶液和橄榄油为2: I (v/v)，放到小三角瓶里(外包冰块)，调整为转速为10000转/分，一次乳化3分钟，间隔3分钟，共乳化3次。转基因青霉和非转基因青霉的酶活力测定结果见表1。
[0100]表1转基因青霉和非转基因青霉的酶活力测定结果
【权利要求】
1.一种青霉基因工程菌的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤: (1)获得潮霉素抗性表达盒并克隆到目标质粒上，获得潮霉素抗性的重组质粒； (2)分别克隆青霉脂肪酶基因PEL、扩展青霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子PgpdP和构巢曲霉色氨酸合成酶终止子TtrpC，得到有强启动子驱动的PEL基因表达盒； (3)将所述PEL基因表达盒克隆到潮霉素抗性的重组质粒中，获得含潮霉素筛选标记PEL基因超表达载体； (4)将含潮霉素筛选标记PEL基因超表达载体转化工程农杆菌，利用农杆菌介导转化法将PEI基因表达盒转化到青霉菌株中，得到所述的青霉基因工程菌。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述青霉菌为扩展青霉。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述潮霉素抗性表达盒为构巢曲霉色氨酸合成酶启动子PtrpC驱动的hpt基因表达盒。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标质粒为含有T边界的质粒，为pCAMBIA1300、pCAMBIA2300、pCAMBIA3300、pHB 中的一种。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤: (1)利用PCR技术或限制性酶切技术获得潮霉素抗性表达盒并克隆到目标质粒上，获得潮霉素抗性的重组质粒； (2)进行扩展青霉基因组DNA的抽提； (3)PCR扩增PEL和TtrpC，产物经凝胶回收后克隆至目标质粒，得到重组质粒； (4)PCR扩增PgpdP后将PgpdP克隆至步骤(3)得到的重组质粒的相应位点，得到含PEL基因表达盒的载体； (5)利用限制性酶切技术获得PEL基因表达盒，然后克隆至含有潮霉素抗性的重组质粒上，获得含潮霉素筛选标记的PEL基因超表达载体； (6)将含潮霉素筛选标记的PEL基因超表达载体通过冻融法转化工程农杆菌； (7)将青霉接种培养20天左右，收集成熟孢子； (8)将含潮霉素筛选标记的PEL基因超表达载体的工程农杆菌接种于含有抗生素的LB液体培养基中过夜培养，用含有抗生素的MM培养基重新活化；吸取适量的培养物离心去上清，并用頂培养基稀释至OD6tltl = 0.15左右，然后再培养至OD6tltl = 0.5~0.6 ; (9)将第(7)步得到的新鲜孢子配制成悬浮液，随后取上述孢子悬液与步骤(8)中的工程农杆菌等体积混合，均匀涂到铺在含CM培养基上的玻璃纸上，进行共培养，之后将玻璃纸反铺到选择培养基上，进行选择培养，然后揭下玻璃纸，等待转化子长出，将抗潮霉素的转化子挑出接种到二筛培养基上，如稳定传代，得到所述青霉基因工程菌；其中，CM培养基:加一半IM培养基的葡萄糖量，外加1.5%琼脂，其它成份同IM培养基。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤: (1)利用限制性内切酶将潮霉素抗性表达盒酶切下来，克隆到质粒PCAMBIA2300，获得具有潮霉素抗性的重组质粒PCHAMBIA2302 ； (2)利用高盐低pH方法进行扩展青霉DNA的抽提； (3)以步骤(2)中的扩展青霉基因组DNA为模板，PCR扩增PEL;以质粒pAN7-l为模板扩增TtrpC，然后将PEL和TtrpC进行连接，融合片段经凝胶回收，克隆至pMD18_T载体上，得到载体 PMD18-T::PEL-TtrpC ；(4)以步骤(2)中的扩展青霉基因组DNA为模板，PCR扩增强启动子PgpdP，片段经限制性内切酶消化后克隆至PMD18-T:: PEL-TtrpC，得到含有PEL基因表达盒的载体pMD18_T::PgpdP-PEL-TtrpC ； (5)利用限制性内切酶对载体pMD18-T::PgpdP-PEL-TtrpC进行消化，获得PEL基因表达盒，然后克隆至重组质粒PCHAMBIA2302上，获得含潮霉素筛选标记的PEL基因超表达载体 pCHAMBIA2302::PgpdP-PEL-TtrpC ； (6)将终载体pCHAMBIA2302:: PgpdP-PEL-TtrpC通过冻融法转化工程农杆菌EHA105 ； (7)挑取分离纯化后的野生型青霉接种于PDA平板上，收集成熟孢子； (8)将含终载体pCHAMBIA2302::PgpdP-PEL-TtrpC的工程农杆菌EHA105接种于含有抗生素的LB液体培养基中28°C，200rpm过夜培养，用含有抗生素的丽培养基重新活化，28°C，220rpm培养48小时；吸取适量的培养物离心去上清，并用頂培养基洗涤，最后用頂培养基稀释至OD6tltl = 0.15，然后在28 °C，220rpm的条件下培养6~8小时，至OD6tltl = 0.5~`0.6 ； (9)将第(J)步得到的新鲜孢子配制成悬浮液，随后取上述孢子悬液与步骤(8)中的工程农杆菌等体积混合，取200 μ L均匀涂布到铺有玻璃纸的含AS 200 μ g/mL的CM培养基之上，28°C共培养60h，然后将玻璃纸反铺到含有抗生素的PDA培养基上，28°C培养2天，揭下玻璃纸，在28°C条件下培养I~3天，将抗潮霉素的转化子挑出接种到二筛培养基上，如稳定传代，得到所述青霉基因工程菌；其中，CM培养基:加一半IM培养基的匍萄糖量，外加`1.5%琼脂，其它成份同IM培养基。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤:` (1)利用限制性内切酶SacI，Kpn I将潮霉素抗性表达盒从质粒PV2+上酶切出来，片段经凝胶回收，克隆到PCAMBIA2300质粒的相应酶切位点上，获得具有潮霉素抗性的重组质粒 pCHAMBIA2302 ； (2)扩展青霉菌丝体经液氮研磨，加入高盐低PH提取液，65°C水浴30min;离心取上清液，加入2/3倍体积的2.5M，pH4.8的KAc，离心取上清液，然后往上清液中加入0.7倍体积的异丙醇，沉淀DNA，DNA经75%的乙醇洗涤两次，溶解于双蒸水中备用； (3)以步骤⑵中的扩展青霉基因组DNA为模板，PCR扩增PEL；以质粒pAN7_l为模板扩增TtrpC，然后利用重叠延伸PCR技术将PEL和TtrpC进行连接，融合片段经凝胶回收后克隆至pMD18-T载体上，得到载体pMD18-T::PEL-TtrpC ； (4)以(2)中的扩展青霉基因组DNA为模板，PCR扩增强启动子PgpdP，片段经限制性内切酶Sal 1.Spe I消化后克隆至pMD18_T::PEL-TtrpC的相应位点，得到含有PEL基因表达盒的载体 pMD18_T:: PgpdP-PEL-TtrpC ； (5)利用限制性内切酶Sal1、Pme I对载体pMD18_T: =PgpdP-PEL-TtrpC进行消化，获得PEL基因表达盒，然后克隆至重组质粒pCHAMBIA2302上，获得含潮霉素筛选标记的PEL基因超表达载体 pCHAMBIA2302:: PgpdP-PEL-TtrpC ； (6)将终载体pCHAMBIA2302:: PgpdP-PEL-TtrpC通过冻融法转化工程农杆菌EHA105 ； (7)挑取分离纯化后的野生型青霉接种于PDA平板上，于28°C培养20天左右，收集成熟孢子； (8)将含终载体pCHAMBIA2302:: PgpdP-PEL-TtrpC的工程农杆菌EHA105接种于含有.100 μ g/ml链霉素、100 μ g/ml卡那霉素的LB液体培养基中28°C，200rpm过夜培养，用含有.100μ g/ml链霉素和100μ g/ml卡那霉素的MM培养基重新活化，28°C，220rpm培养48小时；吸取适量的培养物5000rpm离心去上清，并用頂培养基洗涤，最后用頂培养基稀释至0D_=0.15，然后在280C，220rpm的条件下培养6~8小时，至OD600 = 0.5~0.6 ; (9)将第(7)步得到的新鲜孢子配制成IXlO7个/mL浓度的悬浮液，随后取上述孢子悬液与步骤(8)中的工程农杆菌等体积混合，取200 μ L均匀涂布到铺有玻璃纸的含AS.200 μ g/mL的CM培养基之上，28°C共培养60h，然后将玻璃纸反铺到含有100μ g/mL潮霉素、500 μ g/mL头孢菌素的PDA培养基上28 °C培养2天，揭下玻璃纸，在28 °C条件下培养I~.3天，将抗潮霉素的转化子挑出接种到二筛培养基上，如稳定传代，得到所述青霉基因工程菌；其中，CM培养基:加一半IM培养基的葡萄糖量，外加1.5%琼脂，其它成份同IM培养基。
8.如权利要求1~7任一项所述的方法制备的青霉基因工程菌在制备脂肪酶中的应用。
9.如权利要求8所述的的应用，其特征在于，所述的青霉基因工程菌以5%~20%接种量接种到发酵培养基，在25~35°C、200~300rpm条件下，发酵2天后，经分离纯化得到脂肪酶。
10.如权利要求9述的应用，其特征在于，将所述青霉基因工程菌以菌丝体或孢子悬液接入种子培养基，在25~35°C下培养24小时后，以5%~20%接种量转入发酵培养基，在.25~35°C、150~300rpm条件下发酵2天后，经分离纯化得到脂肪酶。
【文档编号】C12R1/80GK103571861SQ201210277964
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2012年8月7日 优先权日:2012年8月7日
【发明者】张田, 王剑英, 唐克轩, 林 智 申请人:深圳市绿微康生物工程有限公司