专利名称：抗西尼罗河病毒的非结构蛋白1的抗体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及引入外来遗传物质而修饰的细胞，具体涉及杂交瘤细胞株，该细胞株可分泌抗西尼罗河病毒的非结构蛋白I的抗体。
背景技术：
西尼罗河热和西尼罗河性脑炎是由西尼罗河病毒(West Nile virus, WNV)感染引起的，该病于1937年首次暴发于乌干达，随后迅速传播到非洲各地、欧亚和中东等地区，1999年，WNV首次登陆西半球，并迅速肆虐美国，是继炭疽事件之后，又一种导致全美恐慌的致病性微生物。目前，该病毒在全球范围内仍呈现继续扩散的趋势，加拿大和欧洲一些国家相继出现了人感染而死于西尼罗河脑炎的报道。虽然，迄今为止，中国尚未有发现WNV感染的临床病例，但中国南部的气候、地里环境复杂，含有多种传播WNV的蚊虫种类，具备有 WNV传播的条件，再者，随着国际交流的日益频繁，WNV传人中国境内的可能性越来越大。西尼罗河病毒属于黄病毒属，日本脑炎病毒(Japanese encephalitisvirus, JEV)群的成员之一，与日本脑炎病毒具有相近的免疫原性，其主要的传播媒介是蚊子。研究认为，WNV是目前发现宿主最多的虫媒病毒，至少能寄居于36种蚊子，而我国能传播WNV的蚊种就有11种。对我国而言，西尼罗病毒是一种全新的致病病毒，全民普遍易感，人群中又没有免疫屏障，其危险性之大。因此，提前做好防范及相应的技术储备为我国应对WNV的传人至关重要。至今，具有保护性的疫苗尚未研制成功，临床上对于西尼罗河性脑炎尚未有特异性的治疗药物。但实践表明早期采取对症治疗可以大大减少西尼罗河脑炎的发病率和死亡率，因此西尼罗河热的治疗很大程度上取决于早期感染的诊断。由于多数西尼罗河病毒感染者早期缺乏特异的临床表现，仅有发热、头痛、全身肌肉酸痛等呼吸道症状，难以和其它发热性疾病和脑炎相鉴别。因此，灵敏、特异的早期诊断技术，对早期发现传染源，及时阻断西尼罗河病毒的传播途径至关重要。目前，西尼罗河病毒的实验室诊断方法主要包括病毒分离、血清学检测和核酸检测。其中病毒分离是西尼罗河病毒感染诊断的金标准，但该方法费时而且对于实验室的条件要求很高，必须具备III级生物安全实验室才能进行WNV的培养。虽然病毒核酸的检测方法比传统的病毒分离法更灵敏、快速，但分子诊断操作相对繁琐，对技术水平要求较高，较易发生污染导致假阳性结果，同时由于毒株变异、潜在突变等序列改变也可能引起假阴性结果，再者，西尼罗河病毒感染患者出现病毒血症的时间特别短，血清中病毒核酸存在时间短暂，不利于病毒感染的早期诊断。抗体检测试剂目前已成为美国等国家主要诊断方法，但由于西尼罗河病毒与其它黄病毒特别是与日本脑炎病毒存在血清学交叉反应，特别是接种乙型脑炎病毒、黄热病毒疫苗的人群易发生抗体假阳性的反应结果，不能特异的诊断WNV的感染。因此，选择一个适合的靶抗原建立抗原诊断试剂盒，不仅能够达到早期特异诊断疾病的目的，同时也能避免核酸检测中检测时限短的问题。西尼罗河病毒的非结构蛋白I (nonstructural protein I, NSl)是一种相对保守的糖蛋白，分子量为48kDa,其抗原性很强，且研究发现在西尼罗河热患者的早期血中存在高浓度的NSl循环抗原，因此，检测急性期病人血清中的循环NSl抗原可用于早期诊断西尼罗河病毒感染。目前已报道的几种检测西尼罗河病毒NSl的抗原捕获ELISA法，如VecTest的抗原检测方法，能在15min内快速检测出WNV的感染，但该方法的敏感性不好；MacDonald等利用黄病毒的交叉抗体4G4作为包被和检测抗体建立双抗体夹心，该方法能灵敏的检测到病毒培养上清中NSl蛋白，其最大检测限为lng/ml,但该方法特异性不好,不能区分不同黄病毒的感染；Kyung Min Chung.等，用西尼罗河病毒NSl特异性单克隆抗体建立的双抗体夹心抗原检测方法，其敏感度、特异性和稳定性都有很多的提高。而我国目前尚未有任何WNV的抗原检测试剂的报道，因此，建立一种快速、可靠、标准化的实验室诊断西尼罗河病毒的早期抗原检测试剂已成我国预防和控制该疾病的重要手段。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供抗WNV-NSU S卩，西尼罗河病毒的非结构蛋白 I)的抗体，该抗体可作为西尼罗河病毒NSl抗原的免疫诊断试剂，且灵敏度高和特异性好。本发明解决上述问题的技术方案如下所述本发明所述的抗WNV-NSl的抗体分别是单克隆抗体1C16A24和单克隆抗体1E85A4，其中，单克隆抗体1C16A24是由保藏号为CCTCC-C201276的杂交瘤细胞株分泌的；单克隆抗体1E85A4是由保藏号为CCTCC-C201275的杂交瘤细胞株分泌的。分泌上述单克隆抗体1C16A24和单克隆抗体1E85A4的杂交瘤细胞株已于2012年06月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其中，分泌单克隆抗体1C16A24的杂交瘤细胞株的保藏号为CCTCC-C201276 ;分泌单克隆抗体1E85A4的杂交瘤细胞株的保藏号为CCTCC-C201275。上述单克隆抗体1C16A24和单克隆抗体1E85A4可作为西尼罗河病毒NSl抗原的免疫诊断试剂，所述试剂可组成采用双抗体夹心ELISA方法的检测WNV-NSl抗原的免疫诊断试剂盒，该试剂盒包括捕获抗体和检测抗体，其中，所述的捕获抗体为上述单克隆抗体1C16A24，所述的检测抗体为上述单克隆抗体1E85A4。上述免疫诊断试剂盒为常规的采用双抗体夹心ELISA方法的免疫诊断试剂盒，该试剂盒由用于包被上述捕获抗体的微孔反应板、样品处理液、标记有标记物的上述检测抗体、阳性对照、阴性对照、浓缩洗液、显色液和终止液组成。上述试剂盒中，所述的标记物可以是生物素、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、胶体金、荧光素等，优选生物素。当所述的检测抗体上结合的标记物为生物素时，所述试剂盒还含有标记有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的亲和素。所述的亲和素能与生物素以I : 4的比例结合，起到放大检测信号的作用，进一步提闻检测的灵敏度。本发明所述的单克隆抗体1C16A24和单克隆抗体1E85A4分别是由两株能分泌抗西尼罗河病毒NSl蛋白的杂交瘤细胞株分泌的，因此能特异性结合西尼罗河病毒的NSl蛋白的不同位点，可以实现准确、快速地检测出西尼罗河病毒，而与其它黄病毒属成员，如登革病毒、乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒和黄热病毒无交叉反应。更进一步地，由本发明所述的单克隆抗体1C16A24和单克隆抗体1E85A4所组成的免疫诊断试剂盒检测西尼罗河病毒NSl蛋白的灵敏度可达30pg/ml，检测西尼罗河病毒培养上清的最低滴度为61PFU/ml，而且快速、准确。
图I是单抗1C16A24和单抗1E85A4免疫印迹图，是重组WNV NSl蛋白与单克隆抗体的反应，条带I为无关单抗，条带2为单抗1C16A24，条带3为单抗1E85A4，条带4为抗GST单抗。
图2是所述检测试剂盒检测西尼罗河病毒NSl蛋白的标准曲线图，其中为检测西尼罗河病毒NSl蛋白的曲线，■^为BSA对照。图3是所述检测试剂盒的特异性分析结果图。图4是所述检测试剂盒检测模拟WNV感染病人血清标本的结果图。图5是所述检测试剂盒检测病毒感染的动物血清标本的结果图。
具体实施例方式例IA、抗WNV-NSl蛋白的单克隆抗体1C16A24和1E85A4的制备a.免疫抗原的制备本发明用于制备单克隆抗体的免疫原为基因重组WNV NSl蛋白。基因重组WNV NSl蛋白是用携带WNV NSl蛋白基因的一种大肠杆菌的工程菌株制备的，其制备按常规方法进行，详细的制备方法可参照使用手册。将NSl蛋白纯化后，以考马斯亮蓝(Coomassie)蛋白分析试剂(PIERCE，Cat, No. ED62976)定量，免疫原鉴定结果见图2。b.免疫小鼠取4-6周龄雌性BALB/c小鼠，第一次采用弗氏完全佐剂与等体积WNV NSl抗原混匀乳化，每只小鼠皮下多点注射30yg，以后每10天以弗氏不完全佐剂与等体积WNV NSl抗原混匀乳化后免疫，共4次后,于融合前3天每只小鼠腹腔注射WNV NSl抗原100 μ g进行加强免疫。c.免疫血清抗体效价测定建立间接ELISA法测定免疫血清抗体效价。配制I μ g/ml重组NSl蛋白的50mMpH9. 6碳酸盐缓冲液，包被聚苯乙烯微96孔板，100 μ I/孔，4°C过夜。次日，用含O. 25%酪蛋白(Sigma)的封闭液300μ I/孔4°C过夜，弃液并拍干后真空干燥2 12小时，用铝膜袋真空包装4°C保存，用于鼠免疫血清抗体效价测定。于第四次免疫后10天眼眶采血，鼠免疫血清用含O. I % BSA IOmM PBS以IO3 IO6倍稀释，加入96孔板，100 μ I/孔37°C 30分钟，IOmM PBS含O. l%Tween-20洗涤液洗板五次后，加入I :1000倍稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗小鼠IgG(Sigma, INC.)，100 μ I/孔37°C 30分钟，同上洗板后，加入TMB显色液，100 μ I/孔，室温避光显色10分钟，加100 μ I/孔IM H2SO4终止反应，测450nm吸光值，以免疫前小鼠血清作为阴性对照，以测定值与对照值之比> 2. I为阳性来判断免疫血清的抗体效价。d.杂交瘤制备和筛选选择血清抗体效价达I X IO6的小鼠，于融合前3天腹腔注射WNV NSl抗原100 μ g。无菌取小鼠脾脏，制成脾细胞悬液与对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株NS-I按10 :1的比例混合，45%聚乙二醇(PEG，MW4000, Sigma)作用下进行融合。按下述步骤将聚乙二醇溶液加入细胞。在37°C水浴中，在Imin内缓慢加入I. Oml PEG，边加边轻轻摇匀，分别于lmin、2min、3min、4min、5min 内加 lml、2ml、3ml、4ml、5ml 无血清 RPMI-1640 培养基终止融合，最后加入IOml含15%胎牛血清的RPMI-1640培养基，室温800rpm离心5min，弃上清，用60ml含15%胎牛血清的RPMI-1640培养基轻轻悬起细胞。将此细胞悬液加入6块96孔培养板上，在二氧化碳培养箱中温度为37°C、5%C02的培养箱中。次日于每孔加入100 μ I含次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶脱氧核苷(HAT，Sigma)筛选培养基。以后每3天用此筛选培养基给培养物换液一次，直到细胞克隆形成。为检测产生抗体克隆的存在，用上述间接ELISA法检测细胞培养上清。选择强阳性杂交瘤细胞进行了克隆化，用有限稀释法连续克隆化2 3次，共获得两株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，分别是保藏号为CCTCC-C201276 (命名为WNV-M6)的杂交瘤细胞株和保藏号为CCTCC-C201275 (命名为WNV-M4)的杂交瘤细胞株。所述的保藏号为CCTCC-C201276的杂交瘤细胞株和保藏号为CCTCC-C201275的杂交瘤细胞株已于2012年6月23日送交地址在中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心保藏。将克隆化后阳性率达100%的细胞扩增培养后液氮冻存。
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e.抗WNV NSl蛋白单克隆抗体腹水的制备和抗体纯化采用体内诱生法制备本发明中单克隆抗体1C16A24和单克隆抗体1E85A4，即在小鼠体内接种杂交瘤细胞WNV-M6制备腹水获得单克隆抗体1C16A24，或者在小鼠体内接种杂交瘤细胞WNV-M4制备腹水获得单克隆抗体1E85A4。具体制备方法简述如下每只小鼠腹腔内注射O. 5ml弗氏不完全佐剂(Sigma公司)，使瘤细胞能以腹水瘤形式在腹腔内生长。大约I 2周后，将2X IO6个杂交瘤细胞悬浮于无血清RPMI 1640培养基中，注入小鼠腹腔。注射杂交瘤细胞大约I 2周后，用9号针头放腹水，可反复收集数次。腹水经离心澄清后4°C存放备用。腹水抗体的纯化采用辛酸一硫酸铵沉淀法，腹水用60mM、pH5. O醋酸缓冲液稀释2倍，用O. IN盐酸调pH值至4. 8，液体由清亮变混浊，室温下于30分钟内边搅拌边逐滴缓慢加入辛酸，为每毫升稀释前腹水加33 μ I辛酸，出现大量沉淀，4°C静置2小时，IOOOOg, 4°C离心30分钟，取上清，加入1/10体积的pH7. 4100mM磷酸盐缓冲液，并用O. IN氢氧化钠调pH值至7. 4，冰浴搅拌下缓慢加入硫酸铵，为每毫升液体加入O. 277硫酸铵即为45%饱和度，4°C静置过夜，10000g，4°C离心30分钟，弃上清，沉淀溶于适量IOmM磷酸盐缓冲液，用同样的液体，4°C透析过夜，换液三次。以考马斯亮蓝(Coomassie)蛋白分析试剂(PIERCE，Cat，No. ED62976)定量。测定浓度后的抗体加入终浓度50%的甘油于_80°C保存。f.抗WNV NSl蛋白单克隆抗体亚类鉴定用上述的间接ELISA法检测在本实施例中获得的阳性克隆以确定其产生的抗体亚类。即WNV NSl抗原包被微孔板，封闭后与杂交瘤细胞培养上清孵育，再分别与为I :1000倍稀释HRP标记的兔抗小鼠不同亚类特异性免疫球蛋白，这些抗体包括兔抗小鼠IgGl (美国 ZYMEDLABORATORIES, INC,目录号 61-0120)，兔抗小鼠 IgG2a(同上，目录号 61-0220)，兔抗小鼠IgG2b(同上，目录号61-0320)，兔抗小鼠IgG3(同上，目录号61-0420)，兔抗小鼠IgM(同上，目录号61-6820)。检测结果显示，杂交瘤细胞株WNV-M6分泌的单克隆抗体1C16A24和杂交瘤细胞株WNV-M4分泌的单克隆抗体1E85A4均为IgGl阳性。
g.鉴定WNV NSl蛋白单克隆抗体的特异性(I)间接ELISA法进行单克隆抗体特异性分析分别用四个血清型重组WNV-NSl抗原、DV-NSl抗原、天然的DV抗原、JEV抗原和YFV抗原包被微孔板，按照常规的间接ELISA法进行检测。即在包被的微孔板中加入I μ g/ml的本专利发明的单克隆抗体1C16A24和1E85A4，37°C孵育lh，加入I :1000稀释辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG (Sigma，Inc)，100 μ I/孔37°C孵育30min，加TMB 显色液室温避光显色IOminJP IM H2SO4终止反应，测450nm吸光值(A45tl)。表I结果显示本专利发明的单克隆抗体与重组的WNV NSl抗原产生很强的特异性反应，与其他黄病毒属成员，如乙型脑炎病毒、黄病毒和四个血清型登革病毒均无交叉反应。表IWNV NSl单克隆抗体与重组的WNV NSl抗原间接ELISA反应结果
权利要求
1.一种抗WNV-NSl的单克隆抗体1C16A24，该单克隆抗体是由保藏号为CCTCC-C201276的杂交瘤细胞株分泌的。
2.—种分泌权利要求I所述的单克隆抗体1C16A24的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株的保藏号为CCTCC-C201276。
3.一种抗WNV-NSl的单克隆抗体1E85A4，该单克隆抗体是由保藏号为CCTCC-C201275的杂交瘤细胞株分泌的。
4.一种分泌权利要求3所述的单克隆抗体1E85A4的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株的保藏号为 CCTCC-C201275。
5.一种采用双抗体夹心ELISA方法检测西尼罗河病毒NSl抗原的免疫诊断试剂盒，该试剂盒包括捕获抗体和检测抗体，其特征在于，所述的捕获抗体为权利要求I所述的单克隆抗体1C16A24，所述的检测抗体为权利要求3所述的单克隆抗体1E85A4。
全文摘要
本发明涉及抗西尼罗河病毒的非结构蛋白1的抗体，所述的抗体分别是单克隆抗体1C16A24和单克隆抗体1E85A4，其中，所述的单克隆抗体1C16A24由保藏号为CCTCC-C201276的杂交瘤细胞株分泌，所述的单克隆抗体1E85A4由保藏号为CCTCC-C201275的杂交瘤细胞株分泌。本发明所述的单克隆抗体1C16A24和单克隆抗体1E85A4可组成采用双抗体夹心ELISA方法检测西尼罗河病毒NS1抗原的免疫诊断试剂盒，该试剂盒具有灵敏度高和特异性好的优点。
文档编号C12N5/20GK102898517SQ20121029256
公开日2013年1月30日 申请日期2012年8月16日 优先权日2012年8月16日
发明者车小燕, 丁细霞, 秦成峰 申请人:南方医科大学珠江医院, 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所