专利名称：一种转移肿瘤缺失蛋白抑制剂多肽的制作方法
技术领域：
本发明属于生物化学领域，特别涉及一种转移肿瘤缺失蛋白抑制剂多肽，还涉及此多肽和多核苷酸重组质粒的制备和应用以及该多肽物质对Metastasis suppressor I ニ聚化抑制作用生物活性。
背景技术：
Inverse BAR (I-BAR)家族基因的表达产物蛋白能结合细胞膜，并能在细胞外刺激作用下对细胞膜的形态变化和细胞状况做出调节[Frost, A.et al. (2009) Cell137(2) :191-196. ] οMetastasis suppressor I (以下简称 Mtssl) [Lee, Y. G. et al. (2002) Neoplasia4(4):291-294.]基因是I-BAR家族的重要成员，由于其在转移性细胞中表达异常，且对 膜运动、细胞极性、胞内交织以及细胞移动具有调控功能[Mattila，P.K. et al. (2003)Journal of Biological Chemistry 278 (10):8452-8459.]。近期对人类恶性肿瘤样本的研究显示，在多种晚期膀胱癌和转移性胃癌中发现Mtssl基因表达的缺失；由于和预后不良情况成反比，Mtssl基因表达的程度可做为某些癌症患者无病生存率的诊断依据[Liu, K. et al. (2010)BMC Cancer 10:428.]。同时也有报道某些Mtssl基因过度表达以及染色体8q24. I上Mtssl基因位点扩增的肿瘤[Glassmann，A.et al. (2007)BMC Dev Biol 7:111·]。另タ卜，Mtssl 还是 Sonic hedgehog (Shh)响应基因之一 [Callahan, C. A. et al. (2004)Genes & Development 18 (22) : 2724-2729.],而Shh信号通路往往会促进作用肿瘤的发生[Bailey，J. M. et al. (2007) J Cell Biochem102(4) :829-839.]。尽管当前的数据暗示Mtssl基因异常表达与肿瘤进展相关，但Mtssl的生理功能及其信号通路对肿瘤进展的影响尚没有得到充分阐明。Mtssl基因早先被认为与肿瘤转移有关，在某些恶性肿瘤中表达降低[Lee，Y. G. et al. (2002)Neoplasia4 (4) : 291-294.]。该基因编码全长759个氨基酸的蛋白，其N端带有250个氨基酸组成的inverse Bin-Amphiphysin-Rvs (I-BAR)同源区，能形成扭曲的椭球形状的ニ聚体结构，利用该结构形成的凸面结合细胞膜[Yamagishi, A. et al. (2004)Journal of Biological Chemistry279 (15) : 14929-14936. ]。I-BAR 家族蛋白在 N 端往往高度的保守，并且与细胞膜运动密切相关。研究表明Mtssl蛋白I-BAR区能结合PI (4，5)P2_富集的人工膜并引发丝状伪足样的膜突起[Saarikangas, J. et al. (2009)Curr Biol 19(2) :95-107. ] 此外，Mtssl I-BAR 能够与小 GTP 酶 Rac 相互作用，结合细胞膜并交叉连接肌动蛋白细胞骨架[Bompard, G. et al. (2005) Journal of CellScience 118 (22) : 5393-5403. ]。Mtssl的C端还包括一个丝氨酸富集区(SRD)、ー个脯氨酸富集区(PRD)和ー个WASP同源2区(WH2)结构，这些位点能够结合肌动蛋白单体[MattiIa, P. K. et al. (2003) J Biol Chem 278 (10) :8452-8459.]、皮层肌动蛋白[Lin, J. etal. (2005)Oncogene 24(12):2059-2066.]和 Daaml 等[Liu, ff. et al. (2011)Development138(10) :2035-2047.]细胞骨架调节相关蛋白。许多证据表明Mtssl的I-BARニ聚体在其构象形成和功能发挥发面具有重要作用；针对这一位点对进行阻断，将有理由于了解Mtssl蛋白N端特殊的作用。在结构上，两个Mtssl蛋白分子能够借助其N端的I-BAR区域结合成ニ聚体的结构，这ー结构能结合细胞膜并促使膜形成伪足状突起[Woodings, J. A. et al. (2003)Biochemical Journal 371:463-471.]。Mtssl蛋白ニ聚体发挥生物活性的机制尚未阐明，这就需要发现有针对性的相关抑制剂，用以研究ニ聚化作用能否影响Mtssl介导的细胞膜变化和内吞作用，以及ニ聚化作用与Mtssl蛋白对肌动蛋白细胞骨架调节之间的联系。
发明内容
发明目的本发明的目的在于提供ー种能够有效抑制Mtssl蛋白ニ聚化作用的多肽，编码这些多肽物质的多核苷酸以及该多核苷酸重组载体。
技术方案本发明提供了一种转移肿瘤缺失蛋白抑制剂多肽，包含SEQ ID No 2所示的氨基酸序列。作为改进，本发明提供的转移肿瘤缺失蛋白抑制剂多肽，还包含SEQ ID No :2所示的氨基酸序列的片段或类似物。作为进ー步改进，本发明提供的转移肿瘤缺失蛋白抑制剂多肽，还包含SEQ IDNo 2所示的氨基酸序列的多肽的片段，或与SEQ ID No 2所示的氨基酸序列具有80%以上同源性的多肽。本发明还提供了ー种多核苷酸，它编码包含SEQ ID No 2所示的氨基酸序列的碱基序列。作为改进，该多核苷酸编码包含SEQ ID No :2所示的氨基酸序列的多肽或其片段、类似物的碱基序列。该多核苷酸包含SEQ ID No :I所示的碱基序列。作为改进，该多核苷酸包括SEQ ID No :I的碱基序列或与SEQ ID No :I的碱基序列有80%以上的同源性。本发明还提供了 ー种重组质粒表达载体，它包含SEQ ID No 1所示的碱基序列；该重组质粒表达载体由上述的多核苷酸与外源表达载体质粒构建而成。本发明还提供了上述转移肿瘤缺失蛋白抑制剂多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。该转移肿瘤缺失蛋白抑制剂多肽通过与Mtssl蛋白I-BAR区结合,抑制Mtssl蛋白的ニ聚化作用，从而达到抑制肿瘤细胞内摄，干扰细胞膜形态变化以及干扰肿瘤相关信号传导的效果。其中，多肽-蛋白的体外结合解离常数和抑制活性均在纳摩尔级。有益效果本发明提供的转移肿瘤缺失蛋白抑制剂多肽通过抑制Mtssl蛋白ニ聚化作用，抑制肿瘤细胞内摄，干扰细胞膜形态变化以及干扰肿瘤相关信号传导，削弱由表皮生长因子EGF、血小板衍生因子TOGF或刺猬因子shh等肿瘤刺激因素引发的细胞增殖和生长，其中多肽-蛋白的体外结合解离常数和抑制活性均在纳摩尔级。
图I为转染GFP标记的序列号2代表的多肽，在293T细胞中表达情况，用WesternBlot检测的结果；其中目标蛋白分子量约38KD。图2为纯化的GST标记的序列号2代表的多肽，使用Commassie Blue染色的結果；其中目标蛋白分子量约35KD。图3为GST柱结合的序列号2代表的抑制剂多肽与Mtssl蛋白结合能力的检测结果；计算二者的解离常数在纳摩尔级。图4为GST标记的序列号2代表的抑制剂多肽抑制Mtssl ニ聚化能力的检测结果；计算多肽的抑制活性在纳摩尔级。
具体实施例方式
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根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、エ艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。试剂及仪器聚介: : PfuUltra II fusion HS DNA polymeraseStratagene 公司
单核苷酸混合物dNTPPromega公司
BamH I限制性内切酶NEB公司
SalI限制性内切酶NEB公司
3号酶切缓冲液NEB公司
T4 DNA連接酶和配套浓缩缓冲液Invitrogen公司
氨苄青霉素SIGMA公司
LB固体培养基GIBCO BRL公司 小牛血清BCSHyclone公司
DMEM高糖培养液Lonza公司
青霉素GffiCO公司
链霉素GIBCO公司
细胞转染试剂SuperFectQiagen公司
S.O.C.培养基SIGMA公司
LB液体培_基Invitxogen公司
异丙基-beta-D-硫代半乳糖苷IPTGSIGMA公司
谷胱甘肽琼脂糖凝胶 Glutathione Sepharose 4BAmerican Biosciences 公H]
化学发光底物Thermo公司
考马斯亮蓝BIO-RAD公司
鼠抗 anti-Myc 抗体(9E10)BD Biosciences 公'-同
鼠抗anti-Flag抗体SIGMA公司
Ilr \ i 凝胶 Protein A SepharoseGE Healthcare 公 ι
Mastercycler型DNA梯度热循环仪eppendorf公司
细胞培养皿BD Falcon公司
Centricon YM-30 超滤管Millipore 公司
ImageStation 2000丨冬丨像糸统Kodak公'丨丨'j正常培养液为含10%小牛血清BCS的DMEM高糖培养液。实施例IGST标记的多肽编码DNA质粒的构建。以鼠源重组DNA质粒P Mtssl-Myc-His 为模板，5’_CAGTTAGGATCCACCATCATCAGCGAC-3’和5’ -CAGTTAGTCGACCTAGATGCTCCGGTG-3’序列的多核苷酸为引物，进行PCR扩增。扩增反应条件为50 μ I反应体系，使用PfuUltra II fusion HS DNA polymerase及其配套IOx 缓冲液，dNTP 各 250 μ M，模板 DNA 20ng/μ 1，引物各 O. 5 μ Μ。在 Mastercycler 型 DNA梯度热循环仪上按下列条件反应30个循环95°C，20s ；67.4°C,20s ;72°C，15s。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳和紫外成像确认分子量约250bp，使用苯酚、氯仿和异戊醇的混合液(25:24:1)抽提，水层加入终浓度约O. 3mol/L的NaAc和2倍量的无水こ醇混匀，高转速离心5分钟，得到的沉淀使用70%こ醇洗涤，室温晾干后使用纯水溶解。之后将上述PCR产物同时还有5 μ g载体质粒分别在37 °C下使用BamHl和Sal I限制性内切酶于3号酶切缓冲液中孵育消化60分钟，目的是将PCR产物(即插入序列)以及载体的5’和3’两端完全修饰以便进行粘性末端连接。酶切反应结束后分别使用琼脂糖凝胶电泳割胶纯化插入序列和载体，纯化后的插入序列和载体DNA以3:1的摩尔比(4. 5nM:l. 5nM)于20 μ I总体积的缓冲液(由IOx配套浓缩缓冲液配制)中在O. I单位的Τ4 DNA连接酶催化下室温反应2h。取I μ I连接反应液转染DH5ci感受态细胞，接种至含氨苄青霉素的LB固体培养基，得到的阳性克隆经质粒纯化后进行DNA测序最终确证质粒构建。 实施例2序列号2代表的抑制剂多肽，其多核苷酸重组质粒在真核/原核细胞中的表达和检测。人胚肾细胞293Τ细胞的培养使用含10%小牛血清BCS的DMEM高糖培养液，加入终浓度为100units/ml的青霉素和100 μ g/ml的链霉素进行培养。DNA转染前，将I. 5xl06细胞接种在IOOmm细胞培养皿中使用不含抗生素的正常培养液在37°C和5%C02条件下培养过夜。随后制备转染混合物=IOyg绿色荧光蛋白GFP标记的抑制剂多肽质粒DNA，300 μ IDMEM,60 μ I SuperFect0转染混合物经室温孵育5_10分钟后加入3ml正常培养液混匀，用以替换细胞培养液培养细胞2-3h，随后再更换成正常培养液培养48h进行表达，表达情况可以直接使用荧光显微镜检测绿色荧光，或将细胞收集、裂解后取裂解液进行检測。100 μ I DH5 α感受态细胞与IOOng谷胱甘肽转移酶GST标记的质粒DNA混合后于4°C静置30min后，立即放入42°C水浴热休克45sec，再置于4°C下2min，随后添加O. 9mlS.O. C.培养基，37°C下200rpm转速培养lh。取20 μ I上述培养液，接种至含有氨苄青霉素的LB固体培养基，在37°C下培养过夜。得到的阳性克隆需要经琼脂糖凝胶电泳确认分子量。挑取单个克隆在3ml含30 μ g/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中37°C下200rpm转速培养过夜，随后再添加IOOml预热过的LB液体培养基(含50 μ g/ml氨苄青霉素)200rpm转速37°C下培养l-2h直到体系的0D_值达到O. 3-0. 4，此时加入终浓度O. 4mM的异丙基-beta-D-硫代半乳糖苷IPTG继续培养90min。4°C下5000xg离心收获细胞，在IOml含有PMSF的PBS缓冲液中超声裂解，并收集上清液。在上清液中加入2ml的谷胱甘肽琼脂糖凝胶GlutathioneSepharose 4B50%磷酸盐缓冲液(PBS)悬浊液，4°C下30rpm培养2h，弃上清，使用PBS洗涤沉淀，得到GST柱结合多肽。再使用含IOmM还原型谷胱甘肽的50mM Tris (pH8. O)洗脱，洗脱液用PBS在CentriconYM-30超滤管中4°C下离心超滤得到较纯的GST标记多肽蛋白PBS溶液。检测多肽的方法如下。以10%SDS_聚丙烯酰胺凝胶电泳分离多肽样品。针对细胞裂解液，使用Western Blot方法，即把凝胶在350mA电流4°C下湿法电转Ih至硝酸纤维膜，以兔抗GFP抗体的1: 500的5%脱脂牛奶稀释液在4°C下孵育过夜，TBST缓冲液洗涤后在以辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG 1:1000的5%脱脂牛奶稀释液室温孵育30分钟，TBST缓冲液洗涤之后使用化学发光底物显色并在ImageStation 2000图像系统上曝光成像得到检测数据(如图I);针对纯化的GST多肽，则使用考马斯亮蓝室温染色过夜，再使用脱色液(含30%冰醋酸，40%甲醇，其余为水)室温脱色2h得到检测结果(如图2)。实施例3GST柱结合的序列号2代表的抑制剂多肽与Mtssl蛋白结合能力的检测。将pMtssI-Myc-His质粒转染至293T细胞，表达后的细胞裂解液中加入不同浓度的GST柱结合多肽，在4°C下30rpm培养2h，取上清样品，以8%十二烷基磺酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。使用Western Blot法,分别利用鼠抗anti-Myc抗体(9E10)和山羊抗鼠IgG处理之后再用化学发光 底物显色并曝光成像得到结合能力数据，同时利用β -actin作为内部參照以确定加样量(如图3)。样品中Mtssl-Myc数量越少，暗示GST柱结合多肽的结合能力越強。实施例4GST标记的序列号2代表的抑制剂多肽抑制Mtssl ニ聚化能力的检测。将鼠源重组DNA质粒pFlag-Mtssl和pMtssl_GFP共转染至293T细胞进行表达，48小时候收集细胞并裂解，裂解液按照200 μ I体积分装7组，其中加入不同浓度的GST标记的抑制剂多肽溶液，在4°C下30rpm培养2h。取样品上清，加入I μ I的兔抗GFP抗体以及20 μ I Protein A Sepharose的50%PBS悬池液混勻，在4°C下30rpm培养Ih,此时ニ聚化的Flag-Mtssl和Mtssl-GFP蛋白将形成免疫共沉淀。收集上清，以8%SDS_聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。使用Western Blot法,分别利用鼠抗anti-Flag抗体和山羊抗鼠IgG处理之后再用化学发光底物显色并曝光成像得到结合能力数据，同时利用β-actin作为内部參照以确定加样量(如图4)。样品中Flag-Mtssl的量越多，暗示GST标记多肽的抑制ニ聚化能力越強。
权利要求
1.一种转移肿瘤缺失蛋白抑制剂多肽，包含SEQ ID No :2所示的氨基酸序列。
2.一种多核苷酸，编码包含SEQ ID No :2所示的氨基酸序列的碱基序列。
3.根据权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于包括SEQID No :1所示的碱基序列。
4.一种重组质粒表达载体，其特征在于它包含SEQ ID No : I所示的碱基序列。
5.权利要求I所述的转移肿瘤缺失蛋白抑制剂多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述转移肿瘤缺失蛋白抑制剂多肽与Mtssl蛋白I-BAR区结合，并抑制Mtssl蛋白的二聚化作用。
全文摘要
本发明提供了一种转移肿瘤缺失蛋白抑制剂多肽，包含SEQ ID No2所示的氨基酸序列。本发明还提供了编码该多肽的多核苷酸以及该多核苷酸重组载体。该转移肿瘤缺失蛋白抑制剂多肽通过抑制Mtss1蛋白二聚化作用，从而达到抑制肿瘤细胞内摄，干扰细胞膜形态变化以及干扰肿瘤相关信号传导的效果，其中多肽-蛋白的体外结合解离常数和抑制活性均在纳摩尔级。
文档编号C12N15/63GK102816225SQ20121029454
公开日2012年12月12日 申请日期2012年8月17日 优先权日2012年8月17日
发明者詹熙, 吉民, 曹萌 申请人:东南大学