专利名称：：以金纳米团簇来减缓氧化压力和/或老化的方法、组合物及用途的制作方法
技术领域：
：本揭示内容是有关于一种金纳米团簇的用途；尤其是有关以红光金纳米团簇来减缓氧化压力和/或老化的新颖用途。
背景技术：
：依据先前研究成果显示，老化过程与各相关疾病所引起的退化过程，部分是肇因于自由基氧化压力和/或硫基/二硫酸盐(thio/disulfate)氧化还原反应的氧化转移(BeckeamenandAmes,Physiol.Rev.199878:547-581)。也有人推论认为氧化压力是肇因于相关的血管疾病或血管因子。因此，此
技术领域：
亟需找出一种可减缓氧化压力，对抗老化和各种血管疾病症状的制剂。因此，可减缓氧化压力甚至老化过程的制剂，将来有潜力被发展成为可用来治疗血管疾病的药剂或药学组合物。
发明内容以下为本
发明内容的简要说明，目的是使通常知识者能对本揭示内容有一些基本认识。此
发明内容非本揭示内容的概要，且未界定本揭示内容的主要/关键组件或勾划出本发明的范畴。本
发明内容的目的为简要地呈现本揭示内容的概念，更进一步的详细内容将记载于实施方式内。本发明是基于意外发现红光金纳米团簇可以有效地减缓一培养细胞的氧化压力和/或老化，因此可作为一制剂，以便有效地抵抗或抑制细胞老化，且可进一步发展成为一种可治疗由血管因子(如，发炎或血管疾病)诱发的氧化压力和/或老化的药剂。本揭示内容为一种可减缓培养细胞的氧化压力和/或老化的方法。此方法包括让一有效量的金纳米团簇与该培养细胞接触，其中金纳米团簇粒径约为O.I至20纳米。在一实例中，上述金纳米团簇为二氢硫辛酸(dihydrolipoicacid,DHLA)涂覆的金纳米团簇。该培养细胞是选自于人类主动脉内皮细胞(humanaroticendothelialcell,HAEC)、人类表皮细胞、人类内皮前驱细胞(humanendothelialprogenitorcell,HEPC)、人类胚胎干细胞(humanembryonicstemcell)和人类间叶干细胞(humanmesenchymalstemcell)所组成的群组中。与培养细胞接触的金纳米团簇的总量约为1-1，OOOnM。另外，本揭示内容为前述金纳米团簇的用途，用来制造出一种能减缓培养细胞的氧化压力和/或老化的试剂。再者，本揭示内容为一种用来治疗一个体的氧化压力和/或老化症状的药学组合物。此药学组合物包含一有效量的前述金纳米团簇和一药学上可接受的赋形剂。其中该个体为人或动物，较佳是哺乳类。另一方面，一种以金纳米团簇来治疗一个体的氧化压力和/或老化症状的方法也属于本发明范畴。本方法包括对该个体施用前述的药学组合物来减缓该个体的氧化压力和/或老化。该氧化压力和/或老化是由一血管因子所造成，例如由发炎或血管疾病所造成。所述的血管疾病可以是动脉粥状硬化、冠状动脉疾病(coronaryarterydisease,CAD)、心肌梗塞(myocardialinfraction,Ml)、缺血(ischemia)、中风、夕卜围动脉阻塞(peripheralvasculardisease)、或肺源性动脉阻塞(pulmonaryvasculardisease)。前述的个体可为人类或动物，最好是哺乳类。本揭示内容的实施例将详细阐述于实施方式及申请专利范围内。参照实施方式及申请专利范围能更进一步充分了解本揭示内容的特征，目的，和发明优点。图I为金纳米团簇之化学结构组成的示意图；且图2为人类动脉细胞有或无以实施例I的金纳米团簇处理，并于处理后第1、7、21或28天，分别以相位差显微镜或荧光显微镜拍摄的照片。具体实施例方式本领域技术人员应了解，在不超出本发明范畴下，可针对本发明做许多的改变或改良，因此这类等效物应视为仍属本发明范畴内。本文中实施例仅是作为阐述本发明之用，本发明范畴不限于此。本揭示内容记载的特定专有名词如以下所述。于本说明书所使用记载的技术和科学专有名词，其含义与目前一般本领域技术人员所理解相同，除非另有规定。本揭示内容所使用的单数形式的“一(a,an)”「」和“该(the，said)”包含复数参照物，除非文义另有规定。本揭示内容中所记载的名词“约”，一般为或0.5%的特定值或范围。另外，名词“约”，是指本领域技术人员所认可的一平均值的可接受的标准误差。本揭示内容中所记载的名词“药学上可接受(pharmaceuticallyacceptable)”组分，为一种与危害比率(Benefit/riskratio)相衬的适合人类和/或动物使用且无不良副作用(如毒性，刺激性和/或过敏性反应)的成分。本揭示内容中所记载的名词“有效量(aneffectiveamount)”,是指足以产生一预期反应的金纳米团簇的用量。对体外试验应用而言，可减缓所培养细胞的氧化压力和/或老化的该有效量会随着不同因子而有所改变，例如与金纳米团簇接触的细胞类型或是细胞经过继代培养的次数。该有效量的表示方式，可以是所施加金纳米团簇的总浓度(nM)、金纳米团簇的总质量(例如，克、毫克或微克)、金纳米团簇的总质量与培养基总体积的比例(例如，毫克/毫升)。较佳是，所施加的金纳米团簇的浓度在约I至1，OOOnM间；较佳是在约10至3，OOnM间；更佳是在约30至IOOnM间。对活体内试验的应用而言，例如，减缓一个体的氧化压力和/或老化症状的体内应用，该有效量也会随着不同因子而改变，例如特定的治疗条件，实验对象的生理条件(例如，体重、年龄或性别)，哺乳类或动物的类型，治疗期间，同时施用的其它治疗(如果有的话)种类，和所使用的特定配方。该有效量的表示方式，可以是该金纳米团簇的总质量(如克、毫克或微克)，或是该金纳米团簇之总质量与该个体体重间的比例(例如，毫克/公斤)。本揭示内容中所记载的名词“赋形剂(excipient)”，是指可以成为金纳米团簇之媒介/载体的任何惰性物质(例如粉状或液状)。此该赋形剂一般而言是安全、无毒的，并且广义而言，可涵盖任何于医药产业上应用于药学组合物制备之已知物质，例如，充填剂(fillers)、稀释剂(diluents)、凝结剂(agglutinants)、接着剂(binders)、润滑剂(lubricatingagents)、助流剂(glidants)、稳定剂(stabilizer)、着色剂(colorants)、润湿剂(wettingagents)、分解剂(disintegrants)等。本揭示内容中所记载之名词“血管因子(vascularfactor)”或“血管疾病(vasculardisease)”,是指任何会对血管系统(包括心脏和血管)产生影响的因此或疾病。在本揭示内容中，血管因子或疾病包括任何会使血管功能失控的因子或疾病，例如发炎、血管狭窄或血管阻塞。血管疾病的实例包括，但不限于，动脉粥状硬化、冠状动脉疾病(coronaryarterydisease,CAD)、心肌梗塞(myocardialinfraction,MI)、缺血(ischemia)、中风、外围动脉阻塞(peripheralvasculardisease)、或肺源性动脉阻塞(pulmonaryvasculardisease)。本揭示内容之实施方式是关于以金纳米团簇来制备药学组合物或药剂以减缓培养细胞的氧化压力和/或老化，或一个体的由血管因子或疾病所引起的氧化压力和/或老化之症状。本揭示内容的金纳米团簇为红光金纳米团簇；特别是，以二氢硫辛酸涂覆之金纳米团簇。本发明所用的涂覆有二氢硫辛酸的金纳米团簇乃是此项
技术领域：
所熟知的，其制备过程(Linetal.,2009ACSNano3:395-401)也是此项
技术领域：
所熟知的，因此，不需进一步解释其制备过程。涂覆有二氢硫辛酸的金纳米团簇，在激发波长约为420纳米的条件下，可发射出650纳米的偏振光，因此其发射波长范围为红色光至近红外线范围。每个金纳米团簇粒径约为0.I至20纳米间，较佳范围为约I至15纳米间，更佳范围为约2至13纳米。以上所揭露的金纳米团簇的粒径为干燥状态下的金纳米团簇，然而，如果用于本揭露内容的金纳米团簇是水溶性的或至少可分散于液体培养基和/或水中，将会更好；由于与周边溶剂分子(例如，水)稱合，因此金纳米团簇的流体动力学粒径(hydrodynamicsize)明显大于其干燥尺寸。于一实施例中，金纳米团簇的流体动力学粒径(hydrodynamicsize)约相当于0.I至30千耳顿(kDa)的聚乙二醇。根据一实施例，当本揭示内容的金纳米团簇与培养细胞接触时，具有抗氧化和/或老化活性。在此实施例中，于培养基中加入约I至1，OOOnM金纳米团簇与培养细胞一起培育一段时间，例如I至10小时，较佳为约3至7小时，更佳为约4至6小时，并且于反应过程中需置换新鲜培养基。经金纳米团簇处理后的培养细胞，至少能维持细胞形态7天，较佳为14天，更佳为21天，特佳为28天。适合以本发明纳米金团处理的细胞，包含但不限于人类主动脉内皮细胞、人类表皮细胞、人类内皮前驱细胞、人类胚胎干细胞、和人类间叶干细胞。另一方面，本揭示内容的金纳米团簇可用来制备一药学组合物或一药剂，藉以治疗一个体的氧化压力和/或老化症状。本揭示内容的该药学组合物或该药剂具有一有效量的金纳米团簇；和一药学上可接受的赋形剂。适合的接受该药学组合物或该药剂的个体乃是具有血管疾病所引起的氧化压力和/或老化，例如，由动脉粥状硬化、冠状动脉疾病(coronaryarterydisease,CAD)、心肌梗塞(myocardialinfraction,MI)、缺血(ischemia)、中风、外围动脉阻塞(peripheralvasculardisease)、或肺源性动脉阻塞(pulmonaryvasculardisease)所引起的氧化压力和/或老化。该个体为人类或哺乳类，例如猴子和黑猩猩。该药物组合物或该药剂的投药方式可为系统性或局部性。可使用任何一般常见的投药方式来施用本案所揭露的金纳米团簇。可以下列方式来投药，例如，口服、舌面、舌下含服、颊内、直肠或不经肠道方式(即，绕过肠道，如静脉注射(intravenously)、动脉注射(intraarterially)、心脏注身寸(intracardially)、表皮注身寸(intracutaneously)、皮下注射(subcutaneously)、皮肤贴片(transdermally)、腹腔(intraperitoneally)或肌肉注射(intramuscularly)),其中口服或静脉投药较适宜。对于本揭示内容的应用来说，本揭示内容的金纳米团簇可制造成一般配方，例如，锭剂、糖衣锭、丸剂、颗粒剂、气雾剂、糖浆、乳剂、悬浮液、溶液、软膏、霜剂或凝胶或任何形式，特别是使用惰性、基本上无毒并且为药学上可接受的载体或溶剂来制造。为此，本揭示内容的金纳米团簇在任一情况下的治疗有效量，即足以达到指定或所需剂量范围之量，相对于总混合物的重量而言，为约O.001至约99%(百分比浓度)之间，较佳为约0.01至约95%(百分比浓度)。尽管，根据不同的体重和/或投药途径的类型，药剂的个体反应，配方的类型和/或投药的时间或间隔，适当地偏离上述剂量范围是必要的。因此，于某些情况下，可投予较上述剂量范围小的药量或是在其它情况下，则是需要超过上述上限值的药量。于给予高剂量情况下，建议将高剂量分成数个单剂量于一规定内间内投药，例如，一天内。可于适当条件下，以溶剂和/或载体(适当情况下，也可使用乳化剂和/或分散齐IJ)来稀释本揭示内容的金纳米团簇，以将其制成配方。例如，在以水作为稀释剂的情况下，若情况准许，也可使用有机溶剂作为辅助性溶剂。根据不同投药途径，为达到预期的效果，本揭示内容的金纳米团簇之剂量范围约0.001至约500毫克/公斤体重，较佳为约0.001至约100毫克/公斤体重，更佳为约0.01至约50毫克/公斤体重。尽管，根据不同的体重和/或投药途径，药剂的个体反应，配方的类型和/或投药的时间或间隔，适当地偏离上述剂量范围可能是必要的。因此，于某些情况下，投药量少于上述表示的剂量范围或超过上限值，亦可以达到所需的剂量。当所给予的是高剂量情况下，建议将高剂量分成数个单剂量于一规定期间内投药，例如，一天内；投药方式以数个单剂量或持续性投药(即，持续性静脉注射)。此投药方式较可能应用于慢性治疗(即锭剂的形式)上。实施例I制备金纳米团簇本发明的荧光金纳米团簇是以先前所述方法(参见Linetal.,ACSNano20093:395-401)进行制备。简言之，经由单相反应(Singlephasereaction)(参见JanaandPeng,JAmChemSoc2003125:14280-14281)来合成6-纳米的与双十二烷基二甲基溴化铵(didodecyldimethylammonium)稳定结合的金纳米团簇(AuNPODDAB),其组成结构如图I所示。再逐渐滴加入黄金前驱溶液(氯化金溶于双十二烷基二甲基溴化铵-甲苯溶液)使电浆吸收作用逐渐耗失，直至溶液转变成黄色透明状为止。接着，将先前制备的纳米团簇加入至还原态硫辛酸中以进行配位基置换；还原硫辛酸需新鲜制备，其是以硫辛酸与溴化四丁基铵(TBAB)摩尔比为4:1的比例混合。上述步骤生成深褐色纳米团簇凝块混合物，以紫外线灯照射(365纳米，30分钟)纳米团簇凝块使凝块凝集。去除上清液，加入甲醇至纳米团簇凝块以重新悬浮并分散纳米团簇凝块，接着加入氯仿沉淀去除游离的界面活性齐U。此干燥的纳米团簇沉淀物可再次以硼酸缓冲液(pH9)悬浮散开。接着进行超高速离心(110，OOOrpm)三次，去除多余的硫辛酸。为了收集金纳米团簇，加入PBS缓冲液至30千道耳顿分子量截断(MWCO)浓缩离心管，至纳米团簇透明溶液胶体稳定且不具电浆吸收波锋为止。该金纳米团簇的浓度，于波长420纳米下的吸光系数约为450，OOOM-1Cm'实施例2降低培养细胞内的活性氧物质(ROS)2.I培养细胞与传送实施例I的金纳米团簇将人类动脉内皮细胞培养于内皮细胞生长培养基MV(此培养基名称为“完全培养基(completeculturemedium)”购于PromoCel1，Heidelberg,Germany)中。以每平方公分10，000细胞的密度将细胞接种至I%明胶涂覆的塑料皿或2%明胶涂覆的盖玻片上，培养于含有95%空气与5%CO2的37°C培养箱内。实施例I的金纳米团簇以无血清的完全培养基且和有/无添加阳离子脂质试剂(LipofectAMINE2000,Invitrogen,Carlsbad,Calif·ornia,USA)一起被传送至人类动脉内皮细胞。简言之，以250微升无血清或抗体的培养基稀释该实施例I的金纳米团簇和一脂质载体。经培养5分钟后，被稀释的该实施例I的金纳米团簇和该脂质载体充分混合培养10分钟。将金纳米团簇/脂质载体复合物加入含有细胞的塑料皿和条件培养基(即，事先经过喂养细胞(feedercells)培养3至5天之培养基)。培养4小时后，以新鲜的培养基置换包含该实施例I的金纳米团簇的培养基，接着定时以显微镜下观察该人类动脉内皮细胞的细胞型态变化并且以流式细胞仪分析活性氧物质。于室温下，所有的样本以显微镜(DMIRBE,Leica,ffetzlar,Germany)物镜20倍/光圈O.4及CXD照相机(DC300F,Leica)记录之，结果示于图2。图I为人类动脉细胞有/无以实施例I的金纳米团簇处理，并于处理后第1、7、21或28天分别以相位差显微镜或荧光显微镜拍摄的照片。该些照片可以证实实施例I的金纳米团簇能够维持人类动脉上皮细胞之细胞型态至少28天。2.2以实施例I的金纳米团簇降低活性氧物质利用侦测一荧光染剂，2，7-二氯二氢荧光素二乙酸酯染料(2,7-dichlorodihydrofluoresceindiacetatedye,DCFDA)(购于Invitrogen,GrandIsland,NY,USA)，来评估人类动脉内皮细胞氧活性物质含量，进而推估出细胞内的氧化压力。该荧光染剂与细胞反应的最终浓度为10μM0培养I小时后，以HBSS缓冲液冲洗细胞，接着以胰蛋白酶悬浮细胞，立即以FACScan流式细胞仪分析。以FLI侦测器侦测二氯荧光黄(DCF)讯号，此讯号为DCFDA荧光物质的氧化形式，藉以侦测荧光强度的中位数值量，进而可相对地评估细胞内之氧化程度，结果如表一所示。表I以金纳米团簇人降低人类动脉内皮细胞内的活性氧物质情况权利要求1.一种用以减缓一培养细胞的氧化压力和/或老化的方法，包含在该培养细胞内加入一有效剂量的一金纳米团簇，其中该金纳米团簇的粒径为I至20纳米。2.如权利要求I所述的方法，其中该金纳米团簇是外层涂覆有二氢硫辛酸的金纳米团簇。3.如权利要求I所述的方法，其中该培养细胞选自于人类主动脉内皮细胞、人类表皮细胞、人类内皮前驱细胞、人类胚胎干细胞、和人类间叶干细胞所组成的群组中。4.如权利要求I所述的方法，其中该有效剂量的金纳米团簇约在I至1，OOOnM间。5.如权利要求4所述的方法，其中该有效剂量的金纳米团簇约在10至3，OOnM间。6.如权利要求5所述的方法，其中该有效剂量的金纳米团簇约在30至IOOnM间。7.—种金纳米团簇的用途，该金纳米团簇是可用来减缓培养细胞的氧化压力和/或老化，且该金纳米团簇的粒径为I至20纳米间。8.如权利要求7所述的用途，其中该金纳米团簇是外层涂覆有二氢硫辛酸的金纳米团簇。9.如权利要求7所述的用途，其中该培养细胞选自于人类主动脉内皮细胞、人类表皮细胞、人类内皮前驱细胞、人类胚胎干细胞、和人类间叶干细胞所组成的群组中。10.如权利要求9所述的用途，其中该培养细胞为人类主动脉内皮细胞。全文摘要本揭示内容为一种以金纳米团簇来减缓培养细胞的氧化压力和/或老化，或减缓一个体由血管因子或疾病所引起的氧化压力和/或老化症状的方法、组合物及用途。本揭示内容的金纳米团簇粒径约为0.1至20纳米，且较佳是涂覆有二氢硫辛酸的金纳米团簇。文档编号C12N5/071GK102952775SQ20121030738公开日2013年3月6日申请日期2012年8月27日优先权日2011年8月26日发明者叶宏一,张恒雄,林政鞍,王学孝申请人:中原大学,叶宏一,王学孝