专利名称：一种高效快速分离人间充质干细胞的方法
技术领域：
本发明是一种快速高效的提取和培养脐带间充质干细胞的生物技术发明。本发明的特点为联合应用酶消化法和组织贴壁法，优化了干细胞提取的操作过程，无干细胞的数量损失，培养扩增后的间充质干细胞具有向脂肪细胞和成骨细胞分化的多项分化能力。
背景技术：
间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是来源于中胚层的多能干细胞。MSCs广泛存在于多种组织中，迄今已经从骨髓、脐带血、脂肪组织、外周血、皮肤等组织中提取出MSCs.MSCs具有强大的多方向分化功能。在适合的分化条件下MSCs可以分化成软骨细胞，脂肪细胞，骨细胞，内皮细胞，神经细胞，平滑肌，骨骼肌细胞等。世界范围的临床前实验 结果表明，MSCs对于心肌缺血性疾病、糖尿病、帕金森综合征、难治性骨折、脊柱损伤等疾病均有显著疗效。MSCs还具有免疫抑制作用，能够诱导机体免疫耐受，在体内外通过抑制T细胞、B细胞和NK细胞的活化和增殖，从而诱导免疫耐受。MSCs联合造血干细胞输入可有效缩短重建造血系统的时间，患者的恢复状况较好。MSCs因为其强大的治疗潜力而成为细胞治疗的理想种子细胞。但间充质干细胞在骨髓、外周血、以及成年组织中的含量均较少(IXlO7细胞中I个)，虽然MSCs具有较强的体外扩增能力，并且在体外长期培养中仍保持多方向分化潜能和生物活性，其来源组织MSCs的获得量，扩增能力仍是决定MSCs治疗效果的重要因素。脐带组织为新生组织，较成年人的骨髓、外周血中的MSCs的生物活性相对较高，近来脐带组织以其易获得性、所含的MSCs活性较好，不涉及伦理问题等特点而成为MSCs的较理想组织来源。从脐带组织提取MSCs技术方法不尽相同，主要利用流式细胞仪分选法、磁珠分选法、酶消化法或贴块法获取贴壁细胞，并利用MSCs的粘附特性，利用多次消化传代方法去除其他的细胞种类，从而在较长的时间后获得大量的MSCs。前两种方法因为操作复杂、费用较高而很难得到普及应用。而且MSCs缺乏特异性表面抗原也局限了这两种方法的普及应用。酶消化法或贴块法操作简单易行，但获得的细胞数量因使用的消化酶不同、组织块内部细胞无法贴壁生长而造成了细胞数量的大量丢失。为获得较大量的细胞，原有的方法多通过延长胶原酶的消化时间的方法，大多采用6小时酶消化时间(参考专利号201010605542. 3)。但是延长消化时间会对细胞的增殖活性和分化潜能造成较大的负面影响。
本发明首先优化了Liberase Blenzyme酶消化法的配方和消化和时间,将细胞消化时间缩短为I小时，不仅减少了长时间消化对细胞活性的影响，细胞获得数量较常规方法也明显提高。
本发明联合利用分离酶消化法后，将消化后松散的组织块贴壁培养，最大限度的减少了细胞的丢失，而且组织块在经过酶消化后变的结构比较松散，贴壁的面积变大，剩余的MSCs全部回收利用，无细胞量的损失。本方法提取的MSCs在经过体外培养扩增后的仍具有较高的分化潜能。本发明是一种高效快速获得MSCs的生物技术发明，将为MSCs临床治疗提供充足可靠的细胞来源，具有较高的应用价值。
发明内容
本发明的目的之一是通过联合应用分离酶(Liberase Blenzyme)消化法缩短了酶消化时间，增加了干细胞的数量并更好的保持了细胞的生物活性，优化了干细胞提取的操作过程。在酶消化前，利用大量的0. 9%生理盐水冲洗脐血管内的血液，避免了消化酶的活 性被血液所中和。本发明的另一目的是优化了 MSCs的体外扩增培养条件，能在较短的时间内获得大量的高生物活性的脐带间充质干细胞。从第3代到第10代的细胞向脂肪细胞和成骨细胞分化的活性未发生改变。
既往专利号为201010125235. 5的专利宣称他们的方法细胞倍增时间约为36小时，每传一代细胞数目增长2倍。本发明利用Glutamax代替Glutamine使MSCs的体外倍增时间所短为24小时，采用优化的密度种植使每传一代细胞数目增长10倍。改善了 MSCs在体外的增殖能力。综上所述，本发明有效的缩短了酶消化时间，减少了对细胞活性的影响，联合应用分离酶消化法和组织块贴壁法，最大限度的减少了细胞数量的损失。优化的培养条件使干细胞的体外增殖能力增强并保持高分化能力直至第10代。本发明将为干细胞的临床应用和科研提供成充足的、高活性的细胞来源，具有较高的实用价值。利用本发明方法，从一根长度为20cm的脐带组织中，可提取出IxlO7细胞，5日后第一代细胞数量可增加至lxlO8。传至第3代，可获得大约IxIOici符合国际细胞治疗协会间充质干细胞质量标准的细胞。
图I是原代细胞贴壁后至形成克隆的细胞形态图。图IA为培养2日后贴壁细胞的形态；图IB为培养4日后形成的干细胞克隆。图IC为第I代传代后细胞达到90%融合的特征性细胞形态。
图2是第3代间充质干细胞的细胞表面特征性抗原的流式细胞仪检测代表性结果。第三到10代的细胞细胞表面抗原的特征完全符合国际细胞治疗协会的标准。
图3是MTT测定MSCs增殖活力。取第3、5代处于对数生长期的细胞，以每孔约2 X IO4个细胞等量接种于96孔板中，每孔加入100 u L培养液，置37°C、体积分数5% C02细胞培养箱内孵育。每24h向其中5孔加入10 ii L的MST-18溶液，置于37°C、体积分数5% C02孵育3h后，用酶标仪在490nm波长处测定各孔的光密度值(A49tl)，每日测3孔，连续测7d。设立平行对照孔(加入培养液，不加细胞)并调零，测定MSCs增殖及存活能力。
图4是第5代MSCs分化成脂肪细胞的油红染色结果。图中的脂肪油滴被被油红染成红色，说明MSCs已经分化成脂肪细胞。
图5是第5代MSCs分化成成骨细胞的染色结果。
具体实施例方式 下面结合实施例进一步详细描述本发明，请理解，这些事实里仅用于阐述目的而不用于限制本发明范围。
实施例I:人脐带组织的采集和脐带间充质干细胞的分离、培养利用35岁以下健康足月妊娠产妇剖宫产后的新鲜脐带组织，0.9%无菌生理盐水中浸泡运输至无菌操作室。利用三通接头插入脐带血管中，用无菌消毒的线固定，0.9%生理盐水完全冲洗血管中的血凝块。去除三通接头。将脐带组织剪碎成5mm3左右的组织块，将组织碎块放入50mL离心管中，再加入22. 5 u g/ml Liberase Blenzyme和/或2g dl型胶原酶(collagenase)中消化,37摄氏度摇床上消化I小时，消化液体积为心肌组织的10 15倍。无菌操作台内，用吸管轻轻吹打组织块2min分散细胞，此时消化液变混浊，大部分组织块变成白色，用吸管吸取细胞悬液放入15mL离心管中，加入Iml含体积分数10% FBS低糖 DMEM或MEM a终止消化，收获细胞，所有的细胞悬液过200目铜网。1200rpm转速离心，使细胞沉淀于管底，用吸管吸出上清弃去。再加入0.9%无菌生理盐水，洗细胞一次。弃除上清后，将细胞重悬于含10 % FBS, 50Units/ml青霉素，50 u g/ml链霉素的低糖DMEM或MEM a完全培养基中。同时，将消化剩余的松散的组织块种植于另一个25cm2培养皿中。放于5%C02、37°C培养箱中培养24小时，去除上清及未贴壁细胞，换上新鲜培养基继续培养。大约
3-4日后，显微镜下可观察到克隆形成，在80%克隆含有大约300-500个细胞时，消化传代。具体细胞传代方法如下。
实施例2 :人脐带间充质干细胞的传代去除培养基，用无菌0. 9%生理盐水清洗培养皿3次，以完全去除血清。利用0. 125%胰酶覆盖培养皿，37摄氏度下孵育5分钟，显微镜下可见细胞由梭性贴壁细胞变成圆形并脱离培养表面，收集细胞悬液，加入Iml完全培养基中和胰酶作用。0.9%无菌盐水清洗细胞两次。以lxl04CellS/Cm2面积接种细胞到新的培养瓶中。4日后，重复以上操作，消化传代。利用本方法分离扩增的间充质干细胞，成梭形形态，传代后第3-10代细胞，具有较强的体外增殖能力和生物学活性，能在适宜的分化条件下向脂肪细胞分化和成骨细胞分化。
实施例3 :人脐带间充质干细胞的增殖特性实验取第3、5代处于对数生长期的细胞，以每孔约2 X IO4个细胞等量接种于96孔板中，每孔加入IOOii L培养液，置37°C、体积分数5% C02细胞培养箱内孵育。每24h向其中5孔加入10 ii L的MST-18溶液，置于37°C、体积分数5% C02孵育3h后，用酶标仪在490nm波长处测定各孔的光密度值(A49tl),每日测5孔，连续测7d。设立平行对照孔(加入培养液，不加细胞)并调零，测定MSCs增殖及存活能力。
实施例4 :人脐带间充质干细胞的特征性免疫表型的鉴定取处于对数生长期的hMSCs，0. 05%胰蛋白酶消化后计数，每个反应取细胞I X IO6,加入4°C的PBS后1200r/min离心8min，重悬细胞于50ul PBS中，在细胞中加入饱和浓度的 FITC 或 PE 标记的鼠抗人 CD29、CD31、CD34、CD45、CD73、CD105、CD166、HLA-ABC和HLA-DR单克隆抗体(Abcam);室温避光放置30min，用4°C的PBS+1 % BSA洗涤细胞2遍，FCM buffer (含1%多聚甲醛、0. 1%叠氮化钠、0.5% BSA的PBS液)固定细胞。应用FACSCalibur流式细胞仪(Becton-Dickinson公司)以及WinMDI 2. 9软件对抗体标记的细胞进行检测和分析。
实施例5 :人脐带间充质干细胞的分化活性实验。MSCs向脂肪细胞分化间充质干细胞以6xl05细胞/24孔细胞培养板中一个孔的密度接种，次日达到100%长满的状态。加入含有体积分数10% FBS、10nM/L地塞米松、10ug/ml胰岛素、0. 2mM抗坏血酸和0. 5mmol/LIBMX的DMEM诱导液，每2天换液一次，培养至21天后，油红“0”染色，苏木素复染。分化成脂肪细胞的MSCs内的脂滴将被染成红色。MSCs向成骨细胞分化实验间充质干细胞以6xl05细胞/24孔细胞培养板中一个孔的密度接种，次日达到100%长满的状态。加入成骨诱导试剂含10-7mol/L地塞米松、10埋lOmmol/Lbeta-甘油磷酸钠、50mg/L维生素C的低糖DMEM培养21天，每2_3天换液一次。利用茜素S (Alzerin Red S)行钙结节染色。分化成成骨细胞的MSCs的钙结节将被 染成红色。
权利要求
1.一种脐带胶质间充质干细胞的制备方法，其主要制备工艺包括利用35岁以下健康足月妊娠产妇剖宫产后的新鲜脐带组织，O. 9%无菌生理盐水中浸泡，5小时内，冰块上运输至无菌操作室。用O. 9%无菌生理盐水清洗脐带组织上的血液和血凝块，利用无菌缝合线将三通管固定在脐静脉和脐动脉内，O. 9%生理盐水大量冲洗血管腔以完全去除血液，本操作可最大程度的发挥消化酶的活性，提高间充质干细胞的获得率。将脐带组织剪成5_3左右的小块，Librase BlenZyme37摄氏度滚动摇床上消化I小时，收集细胞悬液，用含血清的培养基终止消化酶的作用，100目过滤网过滤后收集细胞用O. 9%无菌盐水清洗细胞2次，用含体积分数10%胎牛血清或体积分数20%人AB型血清的细胞完全培养基重悬细胞，37度，5% CO2培养箱中培养；另外消化后剩余的组织块用O. 9%无菌盐水清洗两次后，放入完全培养基中，37度，5% CO2培养箱中培养。本发明优化了干细胞提取的操作过程，无干细胞的数量损失。24到48小时后，更换培养基。以后隔日换液，细胞增殖到80%融合时，传代培养。细胞可新鲜使用或冻存。
2.根据权利要求I的脐带胶质间充质干细胞的制备方法，脐带运输方法；具体为35岁以下健康足月妊娠产妇剖宫产后的新鲜脐带组织，O. 9%无菌生理盐水中浸泡，5小时内，冰块上运输至无菌操作室。
3.根据权利要求I的脐带胶质间充质干细胞的制备方法，将三通管固定在脐静脉和脐动脉内，O. 9%生理盐水大量冲洗血管腔以完全去除血液，本操作可最大程度的发挥消化酶的活性，提高间充质干细胞的获得率。
4.根据权利要求I的脐带胶质间充质干细胞的制备方法，LibraseBlenzyme 37摄氏度滚动摇床上消化I小时，收集细胞悬液，5%胎牛血清的低糖DMEM培养基终止消化酶的作用，其特点为联合酶37摄氏度滚动摇床上消化时间为I小时。
5.根据权利要求I的脐带胶质间充质干细胞的培养方法，使用的培养基含10-20%体积分数胎牛血清可替换为10-20%体积分数AB型人血清或AB型脐带血血清。
6.根据权利要求I的脐带胶质间充质干细胞的制备方法，特点为使用的培养基为含有25mmol/LGlutamax 替代谷氨酸胺(Glutamine)。
7.根据权利要求1-6所述的方法制备的脐带胶质间充质干细胞，具有以下技术特征 a.在培养皿中贴壁生长，呈梭状生长增殖，细胞形态清楚，细胞浆内清澈，细胞核清晰。
b.细胞表面抗原表达符合国际细胞治疗协会的标准阳性表达的抗原⑶73KD90 ；⑶105，阳性率达到95%以上。低表达造血干细胞标志抗原⑶34、血细胞抗原⑶45和组织相容性抗原HLA-DR，表达阳性率低于I %。
c.扩增后的间充质干细胞具有分化成骨细胞、脂肪细胞的多向分化能力。
全文摘要
本发明公布了一种快速高效分离扩增脐带间充质干细胞的一种生物技术方法。本方法利用足月剖宫产的胎儿脐带组织，利用混合酶消化法联合组织贴块法，短时间内获得大量的间充质干细胞。此种方法有效减少了酶消化时间、最大程度上减少了细胞数量的丢失，并且改善了长时间酶消化过程对间充质干细胞生物活性的影响。本方法同时优化了体外扩增条件，扩增后的细胞具有间充质干细胞的生物学特性和较高的增殖能力。本发明创造优化了一种高效快速的脐带间充质干细胞的分离、提纯、扩增的生物技术，将为干细胞科研和临床应用提供足量的种子细胞来源。
文档编号C12N5/0775GK102851255SQ201210309220
公开日2013年1月2日 申请日期2012年8月28日 优先权日2012年8月28日
发明者张兆光, 黄益民, 李娜, 辛毅, 张颖 申请人:张兆光, 黄益民, 李娜